5ème journée Steak Expert 22 juin 2011 Présentation des avis ANSES 2010 (Saisine 2010-sa-0031) Identification du danger EPEC et de celui que pourraient représenter les souches AEEC isolées dans les aliments. Estelle LOUKIADIS VetAgro Sup Campus Vétérinaire de Lyon, LMAP/ LNR STEC Unité CALITYSS / Equipe EMSA Frédéric AUVRAY Anses, Laboratoire de Sécurité des aliments de Maisons-Alfort, Unité EDB / Equipe des E. coli

Identification du danger EPEC / AEEC PLAN Bilan des connaissances Données épidémiologiques / patients Données épidémiologiques / aliments Conclusion Perspectives de recherche

1. Bilan des connaissances Les gènes stx sont portés par des éléments génétiques mobiles : les phages (dont le génome s’insère dans le chromosome bactérien) Cycle lytique Cycle lysogénique Cycle dysgénique lytique bactérie lysogène prophage E. coli (eae+, AEEC) STEC AEEC Induction (SOS)

1. Bilan des connaissances Induction des phages lors de lésions ADN (rayons UV, antibiotiques…) => perte du phage par la bactérie porteuse (+/- lyse totale de la bactérie) => transfert des phages vers d’autres E. coli (transduction) (émergence nouveaux clones ; 400 sérotypes de STEC), transfert vers d’autres espèces bactériennes (citrobacter , enterobacter sp.) Locus génétique d’insertion du phage reste intact après le départ du phage :

1. Bilan des connaissances Induction/acquisition de phages stx: in vitro Production de phage => entre 18 % et 89% STEC produisent des phages en présence de mitomycine C Garcia-Aljaro et al. 2009 (79 STEC, eaux usées, 35 sérotypes) Muniesa et al. 2004 (168 STEC, bovins, 71 sérotypes) Perte de phage Fréquence de la perte spontanée des phages stx (sans mitomycine C) au sein d’une culture pure de STEC O26:H11 : => 10 à 14% des cellules sont stx-négatives Bielaszewska et al. 2007 Acquisition de phage Fréquence d’acquisition de phage stx (transduction) par des AEEC O26:H11: => 6x10-6 à 10-7 par cellule receveuse.

1. Bilan des connaissances Induction/acquisition des phages stx : in vivo / animaux Fréquence de transduction dans le tractus gastro-intestinal animal: souris : 10-3 à 10-5 par cellule d’E.coli receveuse mouton : 10-5 à 10-7 par cellule d’E.coli receveuse (Acheson et al. 1998; Cornick et al. 2006) Perte des phages stx chez les animaux: 23 % souches O157:H7 stx-négatives (Wetzel and Lejeune 2007)

1. Bilan des connaissances Induction/acquisition des phages stx : chez l’homme Bielaszewska et al. 2007 Co-isolement d’EHEC et d’AEEC (stx-négatifs eae-positifs) O26:H11 chez des enfants infectés Perte / acquisition de phages stx in vitro : EHEC O26:H11 <=> AEEC O26:H11 + phage stx => HYPOTHESE 1: Perte de stx au cours de l’infection. => HYPOTHESE 2 : co-infection des patients par EHEC O26 + AEEC O26, puis persistance AEEC O26 > EHEC O26 (Mellmann et al. 2005) => HYPOTHESE 3 : infection des patients par des EHEC O26 puis perte des phages stx au cours de l’étape d’isolement des bactéries. => O26 (Karch et al. 1992) => O157 (Feng et al. 2001)

2. Données épidémiologiques: EUROPE Etude 1996-2006 Allemagne : 787 patients atteints de SHU (Bielaszewska et al. 2007) Isolement d’AEEC (E. coli stx-négatif eae-positif) chez 5.5% des patients: 90,7% AEEC = O157:H7/NM, O26:H11/NM, O145:H28/NM et O103:H2/NM Profils génétiques des AEEC (gènes de virulence, MLST/typage par séquençage de gènes de ménages) : similaires aux profils des EHEC Etude 1995-2007 Allemagne : 118 patients atteints de diarrhée sanglante et 10550 patients atteints de diarrhée non sanglante (Bielaszewska et al. 2008) Isolement d’AEEC chez 15.3% des patients avec diarrhée sanglante (AEEC ayant des caractéristiques génétiques proches d’EHEC), et 1.3% des patients avec diarrhée non sanglante.

2. Données épidémiologiques: FRANCE Epidémie de 2005 liée à la contamination par des souches EHEC O26:H11 –O80:H2 de camembert au lait cru: 16 patients atteints de SHU (InVS, 2007) Isolement d’AEEC O26:H11(E. coli stx-négatif eae-positif) chez les patients (43% des souches O26:H11 isolées chez enfants atteints de SHU) Isolement d’AEEC O26:H11(E. coli stx-négatif eae-positif) dans le camembert, dans le lait cru des fournisseurs, dans l’environnement de l’élevage) Or Toutes les souches O26:H11 isolées (EHEC, STEC, AEEC) d’origine humaine, alimentaire et environnementale étaient génétiquement reliées

3. Données épidémiologiques / Aliments Induction/acquisition des phages stx :dans les aliments Peu de données => Prévalence des phages dans les aliments? (pas de données) => Mécanismes d’induction/acquisition des gènes stx dans les aliments? (une seule étude) Imamovic et al. 2009 (eau, lait entier, jus d’orange, salade, viande de bœuf hachée) => Acquisition des phages stx possible dans les aliments (eau, lait entier, salade, viande de bœuf hachée = aliments à risque) => Sous certaines conditions (impossible à pH acide < 4 et à température basse < 4°C) => Avec des niveaux de souches donneuses et réceptrices élevés (103 à 104 UFC/ml) ≠ aliments naturellement contaminés MAIS Attention aux erreurs d’hygiène, aux traitements appliqués (réduction de croissance/ survie des bactéries/inefficacité sur la survie des phages) => Dans les aliments: Induction/acquisition des gènes stx dans les aliments possible ssi conditions appropriées

3. Données épidémiologiques / aliments (France) Dans les aliments en France: Prévalence des souches AEEC Rappel: ! AEEC présentant toutes les caractéristiques des STEC hautement pathogènes et isolées à partir d’un aliment stx+

3. Données épidémiologiques / aliments (France) Dans les aliments en France: Prévalence des souches AEEC France (2009) : détection de STEC hautement pathogènes dans des fromages au lait cru (nSTEC= 7/400 et nAEEC= 3/400) (Madic et al. 2011, sous presse) France (2007 à 2009) : détection de STEC hautement pathogènes dans les aliments « à risque » (viande et fromages au lait cru (analyses officielles: rapports plan de surveillance annuels 2007 à 2009) Nb de souches AEEC O26 ≈ Nb de souches STEC O26. AEEC présentant toutes les caractéristiques des STEC hautement pathogènes et isolées à partir d’un aliment stx+

3. Données épidémiologiques / aliments (France) Année Matrices Nb échantillons analysés Nb souches isolées Prévalence STEC hautement pathogènes 2007 Viande hachée de bœuf surgelée 3605 11 STEC (5 AEEC) 11/3605 0,3% CI95 [0,2 – 0,5%] Fromages au lait cru 392 0/392 ≤ 0,9% 2008 Minerais (Viande hachée de bœuf surgelée) 992 (4 unités/éch.) 10 STEC (13 AEEC) 10/992 1% CI95 [0,6 – 1,8%] 2009 Viande hachée de bœuf à la distribution 1527 2 STEC (3 AEEC) 2/1527 0,1% CI95 [0,04 – 0,5%] 1911 17 STEC (14 AEEC) 17/1911 0,9% CI95 [0,6 – 1,4%]

4. Conclusion (1/2) Bactériophages: rôle prépondérant dans l’émergence des souches STEC pathogènes à partir d’AEEC Impossibilité de distinguer : - une souche AEEC = STEC pathogène ayant perdu son phage stx - d’une souche AEEC = E. coli n’ayant jamais acquis de phage stx Nécessité d’études complémentaires visant à : - identifier les AEEC dérivant de STEC pathogènes, - mieux comprendre les mécanismes de perte des gènes stx par les souches STEC (en particulier dans les aliments), - déterminer la prévalence de phages stx dans les aliments d’origine bovine (risque d’émergence de nouvelles souches de STEC pathogènes)

4. Conclusion (2/2) Souches AEEC isolées d’aliments testés positivement par PCR pour stx: => pourraient être des témoins de la présence de STEC pathogènes… … dont elles dériveraient par perte du gène stx (soit dans l’aliment, soit durant leur isolement) Aucune technique permettant d’infirmer ou confirmer cette hypothèse à l’heure actuelle => Impossibilité de conclure quant à l’absence ou à la présence d’un STEC potentiellement hautement pathogène dans un aliment testé stx+ par PCR et à partir duquel une souche AEEC a été isolée

5. Perspectives de recherche (1/3) Projet de recherche en cours: Caractérisation des E. coli O26 isolées dans les aliments et signification des profils obtenus en terme de risque pour la santé publique Quel danger pour la santé publique représentent les souches AEEC O26:H11 stx- isolées dans les aliments? E. coli O26:H11 eae+ stx- : peuvent-elles devenir pathogènes ou dérivent-elles de souches pathogènes présentes dans l’aliment ? Laboratoire de sécurité des aliments de Maisons-Alfort UMR 1225 ENVT INRA Campus Vétérinaire de Lyon

5. Perspectives de recherche (2/3) Caractérisation des E. coli O26 isolées dans les aliments et signification des profils obtenus en terme de risque pour la santé publique Une collection de souches stratégique: Nombre: > 100 souches O26 Origine et pouvoir pathogène: Souches AEEC et STEC d’origine humaine (pathogènes sst) et alimentaires (pathogènes?) Plusieurs approches en parallèle: Profils de virulence (qPCR haut débit / bio-puces) Profils génétiques (PFGE, MLVA, MLST) Fréquence d’induction/transduction des phages stx Séquençage génomique

5. Perspectives de recherche (3/3) Enquête épidémiologique: Présence de souches STEC hautement pathogènes et de souches AEEC du même groupe clonal dans des denrées alimentaires