La culture comme moyen d’étude du métabolisme : Année Universitaire 2010-2011 UE5 Cours du Dr R. GARNOTEL La culture comme moyen d’étude du métabolisme : Expression de macromolécules (protéines, enzymes, acides nucléiques)

1 – INTRODUCTION 2 – TECHNIQUES DE MICROSCOPIE 2.1. La technique photonique 2.2. La microscopie électronique 3 – TRIEUR DE CELLULES ACTIVE PAR FLUORESCENCE 4 – FRACTIONNER LES CELLULES 4.1. Séparation des organites et des macromolécules par ultracentrifugation 4.2. Séparation des protéines par chromatographie

5 – ETUDE DES PROTEINES 5.1. Technique d’électrophorèse SDS-PAGE 5.2 Technique d’électrophorèse bidimensionnelle sur gel de polyacrylamide 5.3. Immuno-transfert ou Western-Blot 5.4. Clivage spécifique des protéines 5.5. Analyse de la composition en acides aminés des peptides et des protéines 6 – ETUDE DES ENZYMES 6.1. Technique de zymographie 6.2. Etude des activités enzymatiques 7 – ETUDE DES ACIDES NUCLEIQUES 7.1. Etude de l’ADN 7.2. Etude de l’ARN CONCLUSION

1 – INTRODUCTION Techniques d’examen de la cellule dans son ensemble Techniques d’analyse des macromolécules constitutives de la cellule : - protéines - enzymes - acides nucléiques : ADN ARN

2 – TECHNIQUES DE MICROSCOPIE Une cellule animale type mesure de 10 à 20 µm de diamètre  utilisation du microscope Les cellules animales sont incolores et translucides  techniques de coloration

2.1. La technique photonique Permet de distinguer des détails éloignés de 0,2 µm Les cellules sont fixées pour l’observation microscopique La fixation rend les cellules perméables aux colorants et provoque la réticulation des macromolécules, de sorte qu’elles sont stabilisées et figées en position (formaldéhyde, glutaraldéhyde forment des liaisons covalentes entre les acides aminés libres des protéines)

Coloration des cellules : Hématoxyline (colorant ayant une affinité pour les molécules chargées négativement)  mise en évidence de l’ADN, l’ARN et les protéines acides dans les cellules Vert malachite, noir soudan … Marquage des cellules : technique d’immunofluorescence - Anticorps spécifique Double marquage Les cellules vivantes peuvent être observées avec précision au microscope à contraste de phase  visualisation du noyau

2.2. La microscopie électronique Résolution environ 1000 X celle de la microscopie photonique 2 nm Microscopie électronique à transmission Préparation particulière car les échantillons sont exposés à un vide très poussé dans le microscope électronique Observation non possible dans un état vivant et hydraté Fixation des cellules par du glutaraldéhyde et du tétroxyde d’osmium (qui se fixe sur les doubles couches lipidiques et les protéines) Les cellules sont incluses dans une résine et le bloc est coupé au microtome (épaisseur de 50 à 100 nm) et les coupes fines débarrassées de l’eau sont placées sur une fine grille métallique circulaire pour être observées Observation de l’ultrastructure de la cellule en deux dimensions

- Microscopie électronique à balayage Permet d’obtenir des images tridimensionnelles de surface L’échantillon étudié est fixé, déshydraté et recouvert d’une fine couche de métal lourd. Il est ensuite balayé par un faisceau très étroit d’électrons  aspect tridimensionnel Microscopie électronique par cryofracture et cryodécapage Permet d’obtenir des images de l’intérieur des cellules Congélation des cellules dans l’azote liquide (-196°C) en présence d’un cryoprotecteur (antigel) qui empêche la déformation due à la formation de cristaux de glace : le bloc congelé est ensuite fracturé avec la lame d’un couteau Le plan de fracture passe par la moitié hydrophobe des doubles couches lipidiques,mettant à nu l’intérieur des membranes cellulaires. Après ombrage au platine des surfaces de fractures obtenues, la substance organique est dissoute, puis les répliques sont prélevées et observées au microscope électronique

3 – TRIEUR DE CELLULES ACTIVE PAR FLUORESCENCE Permet d’isoler des cellules d’un type uniforme à partir d’un mélange de types cellulaires La technique du FACS (Fluorescence-activated Cell Sorter) ou trieur de cellules activé par fluorescence implique le marquage de cellules avec des anticorps couplés à un colorant fluorescent, puis la séparation des cellules marquées des non marquées dans un trieur de cellules On évalue la fluorescence de cellules individuelles, qui circulent sur une seule file dans un léger courant, en leur faisant traverser un faisceau laser Une canule vibratrice provoque, un peu plus loin en aval, la formation de minuscules gouttelettes dont la plupart ne contiennent qu’une cellule

Les gouttelettes contenant une cellule unique reçoivent automatiquement une charge positive ou négative au moment de leur formation, selon qu’elles contiennent ou non une cellule fluorescente Elles sont ensuite déviées par un fort courant électrique dans le récipient approprié Sélection : 1 cellule/1000 5000 cellules par seconde

4 – FRACTIONNER LES CELLULES Il faut faire éclater les cellules : - choc osmotique/hypothermique - vibrations ultrasoniques

4.1. Séparation des organites et des macromolécules par ultracentrifugation Fractionnement cellulaire par centrifugation Des homogénats cellulaires seront fractionnés en leurs composants par centrifugations répétées à des vitesses progressivement augmentées Plus le composant subcellulaire est petit, plus la force centrifuge nécessaire pour le sédimenter est élevée Les valeurs typiques pour les différentes étapes de centrifugation sont : - vitesse basse : 1000 g pendant 10 minutes - vitesse moyenne : 20 000 g pendant 20 minutes - vitesse élevée : 80 000 g pendant 1 heure - vitesse très élevée : 150 000 g pendant 3 heures

4.2. Séparation des protéines par chromatographie Principe de la chromatographie sur colonne L’échantillon est déposé au sommet d’une colonne cylindrique de verre ou de plastique contenant une matrice solide perméable, comme la cellulose, imprégnée dans un solvant Une grande quantité de solvant est ensuite pompée lentement à travers la colonne et est collectée dans des tubes séparés au fur et à mesure de sa sortie à l’extrémité inférieure de la colonne Les divers composants de l’échantillon se déplacent à des vitesses différentes à travers la colonne et sont ainsi fractionnés dans des tubes différents

Suivant le choix de la matrice, les protéines peuvent être séparées selon : - leur charge (chromatographie par échange d’ions) - leur taille (chromatographie par filtration sur gel) - leur capacité à se fixer à des groupements chimiques particuliers (chromatographie d’affinité)

5 – ETUDE DES PROTEINES 5.1. Technique d’électrophorèse SDS-PAGE SDS-polyacrylamide-gel electrophoresis permet de déterminer la taille et la composition en sous-unités d’une protéine Gel de polyacrylamide fortement réticulé comme une matrice inerte, à travers laquelle les protéines migrent Plus la concentration en polyacrylamide est élevée, plus la migration est ralentie pour les protéines de masse moléculaire élevée Le SDS, sodium dodécyl sulfate, est un détergent puissant, chargé négativement, qui si lie aux régions hydrophobes de la molécule protéique  masse moléculaire apparente Le mercapto-éthanol, puissant agent réducteur, est ajouté pour rompre tous les ponts S-S des protéines  détermination des différentes sous-unités

5 – ETUDE DES PROTEINES 5.2 Technique d’électrophorèse bidimensionnelle sur gel de polyacrylamide Carte protéique bidimensionnelle  protéomique Première étape : fractionnement des protéines par focalisation isoélectrique, reposant sur le fait que la charge nette d’une protéine varie avec le pH de la solution environnante Pour chaque protéine, il existe un pH caractéristique, son point isoélectrique, auquel la protéine possède une charge nette nulle et ne migrera donc pas dans un champ électrique Deuxième étape : électrophorèse SDS-PAGE, mais dans une direction perpendiculaire à celle utilisée lors de la première étape Séparation  2000 chaînes polypeptidiques

5 – ETUDE DES PROTEINES 5.3. Immuno-transfert ou Western-Blot Après électrophorèse mono ou bi-dimensionnelle, les protéines sont transférées sur une membrane de nitrocellulose et incubées avec un anticorps qui reconnaît, par exemple, celles des protéines qui se phosphorylent sur des résidus thréonine Les protéines qui sont reconnues par cet anticorps sont révélées par un deuxième anticorps couplé à une enzyme, puis révélation par substrat spécifique Permet : identification de protéines identification de la phosphorylation des protéines

5 – ETUDE DES PROTEINES 5.4. Clivage spécifique des protéines On dispose d’enzymes protéolytiques et de réactifs chimiques qui coupent les protéines entre les résidus d’acides aminés spécifiques La trypsine est une enzyme qui coupe du côté carboxyle des résidus de lysine ou d’arginine, alors que le bromure de cyanogène est une substance chimique qui scinde les liaisons peptidiques au voisinage des résidus méthionine  Carte peptidique (« empreintes digitales » des protéines)

5 – ETUDE DES PROTEINES 5.5. Analyse de la composition en acides aminés des peptides et des protéines Liaison covalente entre la fonction aminée libre à l’extrémité amino-terminale du peptide et une substance chimique Cette substance chimique est ensuite activée par exposition à un acide faible, de sorte qu’elle rompt spécifiquement la liaison peptidique reliant l’acide aminé amino-terminal à la chaîne peptidique L’acide aminé libéré est ensuite identifié par chromatographie Le peptide restant qui est plus court d’un acide aminé, est ensuite sousmis à la même séquence de réactions, et ainsi de suite jusqu’à ce que tous les acides aminés du peptide aient été déterminés  Séquençage d’acides aminés

6 – ETUDE DES ENZYMES Les enzymes sont des protéines + activités enzymatiques 6.1. Technique de zymographie Gel de polyacrylamide en présence de 1% de gélatine Electrophorèse des échantillons 2 X 30 minutes de Triton X100 Incubation 18 heures à 37°C dans du tampon contenant du calcium Coloration au Bleu Coomassie  plages blanches sur fond bleu Activités MMP-2/MMP-9 Gel de polyacrylamide en présence de 1% de gélatine + plasminogène Plasminogène substrat pour uPA/tPA (plasminogene activateur)

6 – ETUDE DES ENZYMES 6.2. Etude des activités enzymatiques Sur substrats spécifiques Activités « in vitro »

7 – ETUDE DES ACIDES NUCLEIQUES 7.1. Etude de l’ADN - Extraction d’ADN Par technique de précipitation Facile Amplification par PCR Dénaturation Hybridation des amorces Synthèse d’ADN Technique de Southern Blot 7.2. Etude de l’ARN - Extraction d’ARN Technique délicate Amplification par RT-PCR Technique de Northern Blot

CONCLUSION Techniques de microscopie Fractionnement des protéines cellulaires Etude des protéines et des enzymes Etude des acides nucléiques  identification et fonctions biologiques