Techniques de base de la vitroculture S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Techniques de base de la vitroculture Vitroculture et vitrométhodes

Aspects techniques Organisation du laboratoire S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Aspects techniques Organisation du laboratoire Préparation des milieux et stérilisation Repiquage en conditions stériles Chambre de culture Laverie

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S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Conditions de culture

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Stérilisation des explants S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Stérilisation des explants Ethanol Hypochlorite de sodium ou calcium Peroxyde d’hydrogène Nitrate d’argent

Protocole de stérilisation des explants végétaux 1/ Ethanol 10 s 2/ Ca(OCl)2 7%, 10 mn 3/ 3 lavages H2O stérile Choix de l ’échantillon Découpage de l’explant et mise en culture

Milieu de culture Eau Agents solidifiants : agar phytagel : S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Conditions de culture Milieu de culture Eau Agents solidifiants : agar phytagel : polymère d’origine bactérienne (acide glucuronique, rhamnose et glucose) translucide !! Interférences avec la kanamycine !!

In vitro, la majorité des cultures végétales S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Conditions de culture Milieu de culture Source de carbone ? In vitro, la majorité des cultures végétales sont hétérotrophes Choix de la source carbonée Saccharose glucose maltose Cas par cas : substances de croissance génotype

Milieu de culture Éléments minéraux S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Conditions de culture Milieu de culture Éléments minéraux Macroéléments : N,P,K, Ca, Mg, S ex : rapport NO3- / NH4+ Microéléments : autres oligoéléments Utilisation de nitrate d’argent comme antagoniste de l’éthylène

Substances de croissance S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Substances de croissance Auxines (dérivés du tryptophane) Cytokinines (dérivés de l’adénine) Gibbérellines (diterpènoïdes)

Substances de croissance S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Conditions de culture Substances de croissance Les auxines N CH 2 CO H Naturelle : Acide Indole Acétique = IAA CH 2 CO H Synthétiques : Acide Naphtalène Acétique 2,4-D (acide dichlorophenoxyacétique) OCH 2 CO H Cl

Diffusion des hormones S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Conditions de culture Mode de production des auxines Site de production: bourgeon apical Diffusion des hormones - dominance apicale - stimulation de la rhizogenèse

Au niveau cellulaire : elles stimulent l’élongation S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Conditions de culture Rôle des auxines Au niveau cellulaire : elles stimulent l’élongation Au niveau tissulaire : Elles stimulent la croissance racinaire pour de faibles concentrations (sauf le 2,4-D) Elles inhibent l’élongation de la tige feuillée et le débourrement des bourgeons axillaires

Substances de croissance S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Conditions de culture Substances de croissance Les cytokinines Naturelles Isoprénoïd CK (ex: zéatine) Aromatic CK (ex: BA) Synthétiques Kinétine Benzyl AdénoPurine (BAP)

Site de production: Racines S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Mode de production des cytokinines Transport vers les sites d ’action : - levée de dominance apicale - débourrement des bourgeons axillaires Site de production: Racines

Au niveau tissulaire : En général, inhibition de la croissance S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Expression de CYCD3 en fonction des traitements hormonaux chez A.thaliana Rôle des cytokinines Au niveau cellulaire : elles stimulent la division cellulaire via l’induction de Cyclines Riou-Khamlichi et al., 1999 Science Surexpresseur de CYCD3 Au niveau tissulaire : En général, inhibition de la croissance d’apex racinaires Induction de l’activité des méristèmes apicaux des organes aériens

Substances de croissance S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Conditions de culture Substances de croissance Gibbérellines (Acide gibbérellique) Noyau ent-Kaurène (issu du geranyl-geranyl PP)

Gibbérellines (Acide gibbérellique) S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Gibbérellines (Acide gibbérellique) Effets complexes : Stimulation croissance internodale, expansion des feuilles Inhibition de la croissance racinaire à la lumière Favorise au contraire la croissance racinaire à l’obscurité

Milieu de culture Éléments organiques divers S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Conditions de culture Milieu de culture Éléments organiques divers Acides aminés (glycine, cystéine…) Vitamines (thiamine, acide nicotinique, acide folique…) Mélanges organiques complexes Antioxydants

et des cellules indifférenciées ? callogenèse S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Comment obtenir un cal et des cellules indifférenciées ? Coupure Cellules indifférenciées

callogenèse S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales

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organogenèse S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales

Organogenèse Régénération d’organes à partir d’un cal S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Organogenèse Skoog et Miller (1957) Régénération d’organes à partir d’un cal [Cytokinine] Callogenèse Caulogenèse Rhizogenèse [Auxine]

Méthode classique 1 – Explants sur un milieu inducteur de cal = CIM S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Méthode classique 1 – Explants sur un milieu inducteur de cal = CIM 2 – Transfert quelques jours plus tard sur un milieu inducteurs de tiges feuillées = SIM 3 – Transfert après quelques semaines sur un milieu inducteur de racines Pour un exemple détaillé lire l’article “classique” de Valvekens et al. 1987 PNAS sur la méthode d’Agrotransformation de racines d’Arabidopsis

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