Unité de Recherche Biotechnologie de la Reproduction ONIRIS - Nantes

Présentation au sujet: "Unité de Recherche Biotechnologie de la Reproduction ONIRIS - Nantes"— Transcription de la présentation:

1 Unité de Recherche Biotechnologie de la Reproduction ONIRIS - Nantes
Djamel Drider – Ph.D Unité de Recherche Biotechnologie de la Reproduction ONIRIS - Nantes  ou Quimper / 18 Novembre 2010

2 une bactériocine utilisable dans les domaines de
La divercine V41 une bactériocine utilisable dans les domaines de la sécurité alimentaire et de «l’antibiothérapie » Les travaux présentés dans le cadre de cette présentation ont été réalisées au laboratoire de Microbiologie Alimentaire et Industrielle de l’ENITIAA de Nantes. Grand Merci à tous les étudiants et collègues avec qui j’ai pu travailler sur ce projet

3 Problématique scientifique
Recrudescence de la multirésistance bactérienne aux antibiotiques conventionnels Sécurité microbiologique des aliments Multiplication des infections bactériennes - Campylobacter jejuni - Listeria monocytogenes - Salmonella enterica

4 Augmentation de l’incidence des infections à bactéries multirésistantes
Figure extraite de Quadri et al. Infect Disord Drug Targets Sep;7(3):

5 Diminution du nombre de nouvelles molécules antibiotiques
Figure extraite de Belguesmia-Naghmouchi-Chihib-Drider In Drider and Rebuffat – Springer 2011

6 Autorité européenne de sécurité des aliments (European Fodd Safety Authorithy)
Campylobacter Salmonella Listeria 2006 2007 2008 En 2008 cas d’infections à Campylobacter cas d’infections à Salmonella 1381 cas d’infections à Listeria

7 Définition des bactériocines
 Les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont: - synthétisées par voie ribosomique (RPS) - secrétées dans le milieu extracellulaire…  L’activité bactéricide est dirigée contre des souches taxonomiquement proches de l'organisme producteur mais ….

8 Principales classes des bactériocines
Classe I / modifications post-traductionnelles Acides aminés inhabituels (Lanthionines et β-methyllanthionine) Lantibiotiques (Nisine) / additif alimentaire EC 234 Structure 3D de la nisine (Hsu et al., 2004)

9 Principales classes des bactériocines
 Classe III / Bactériolysines - PM > 10kDa - Thermolabiles - Agissent sur la paroi bactérienne en hydrolysant le peptidoglycane Helvéticine J Lactobacillus helveticus Zoocine A Streptococcus zooepidermicus Entérolysine A Enterococcus faecalis Milléricine B Streptococcus milleri Linocine M18 Brevibacterium linens

10 Principales classes des bactériocines
 Classe II / - Peptides non lantibiotiques (pas d’acides aminés modifiés) - PM < 10kDa - Stables à la chaleur et aux pH extrêmes - Lactoccine A - Entérocine AS-48 - Carnocycline A - Lactocycline Q - Entérocine L50A/L50B - Lactococcine G - Lactococcine Q - Pédiocine PA-1 - Divercine V41 - Entérocine A Classe IId Classe IIc Bactériocines circulaires Classe IIb Bactériocines à deux composantes Classe IIa Pediocin-like

11 Structure secondaire des bactériocines de classe IIa
Pédiocine box Feuillet β Hélices α N C YGNGV KYYGNGVTCGKHSCSVDWGKATTCIINNGAMAWATGGHQGNHKC Pédiocine PA-1 Henderson et al., 1992

12 Structure 3D des bactériocines de classe IIa
En région N-terminale : Structure en coude β, portant le motif YGNGVxCx4C. - En région C-terminale : Hélices α hydrophobes qui interagissent avec la membrane N C YGNGV Curvacine A Haugen et al., 2005

13 Mode d’action des bactériocines de classe IIa
Formation de pores Récepteur membranaire

14 K+, Acide aminés, phosphate inorganique, ATP
Modèle de Wedge Agrégation et formation du pore Milieu extracellulaire Milieu extracellulaire Milieu extracellulaire + + - - Milieu intracellulaire Milieu intracellulaire Milieu intracellulaire Milieu intracellulaire K+, Acide aminés, phosphate inorganique, ATP Naghmouchi Drider and Fliss I.(2007) J. Applied Microbiology. 102: Mort cellulaire

15 Récepteur membranaire
Héchard et al., Microbiology 147, Drider et al., Microbiol Mol Biol Rev. 70,

16 Différences entre bactériocines et antibiotiques !
 Voie de synthèse Spectre d’action  Concentration requise pour l’activité Ingolf Nes in Drider and Rebuffat. (2011)

17 Divercine V41 / modèle d’investigation
Bactériocine de classe IIa  Carnobacterium divergens V41 (bactérie lactique isolée de viscères de poisson) La divercine V41 possède: une activité anti-Listeria très élevée deux ponts disulfure importants pour l’activité antibactérienne des acides aminés essentiels : tyrosine (Y) et tryptophane (W) TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC

18 Clivage par une endoprotéase Asp-N
Etude structure fonction C-term hydrophobe N-term hydrophile Pas d’activité anti-Listeria Activité anti-Listeria Clivage par une endoprotéase Asp-N Réduction chimique des ponts disulfures  perte de l’activité anti-Listeria Rôle important des acides aminés aromatiques 1 Trp 3 Tyr  une perte totale de l’activité Bhugaloo-Vial et al., 1999 (Appl. Environ. Microbiol.)

19 Synthèse des variants structuraux de DvnRV41
10 20 30 40 DvnRV AMDPTKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC W19F TKYYGNGVYCNSKKCWVD F GQASGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC Q21S TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGSASGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC A22G TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQGSGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC S23Y TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQAYGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC V30F TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTFVGGWLGGAIPGKC L35F TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWFGGAIPGKC A38V TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWLGGVIPGKC P40V TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWLGGAIVGKC Aa / Divercine V41 Aa / bactériocines de classe IIa Rihakova J, Petit VW, Demnerova K, Prévost H, Rebuffat S, Drider D. (2009) Appl Environ Microbiol.75:

20 DvnRV41 et variants structuraux / CMIs (µg/ml) de
Peptides Acide aminé Changé L. monocytogenes EGDe DvnRV41 None 0.1 ± 0.01 variant 1 W19F 21.1 ± 0.9 variant 2 Q21S 18.3 ± 0.9 variant 3 A22G 8.6 ± 0.01 variant 4 S23Y 0.1 ± 0.01 variant 5 V30F 1.3 ± 0.4 variant 6 L35F 0.7 ± 0.2 variant 7 A38V 1.5 ± 0.4 variant 8 P40V 2.5 ± 0.9 Rihakova J, Petit VW, Demnerova K, Prévost H, Rebuffat S, Drider D. (2009) Appl Environ Microbiol.75:

21 Consommation de saumon
 Produit de consommation quotidienne !  En France la consommation [20,000,000 kgs/an] (augmentation de la consommation nationale d’un facteur de 6 depuis 1980  Production UE est leader dans le monde [80%]  Production Française (40 entreprises / 300,000,000 €) Sources bibliographiques variées et à actualiser

22 Contamination des aliments et infection
100 bactéries Gramme d’aliment Risque Infection Listérioses Traitement Production de DvnV41 Tirer Cb. divergens V41 L. monocytogenes

23 La microbiologie du saumon
A la sortie de l’usine / La contamination des produits peut atteindre 102 à 106 UFC/g (Unités formant colonies) Les Bactéries à Gram Négatif du saumon fumé Microflore Les Bactéries à Gram Positif Sources bibliographiques variées et à actualiser

24 Les bactéries à Gram Négatif
Après le fumage et au moment du conditionnement  Les bactéries à Gram Négatif  Photobacterium phosphoreum  Shewanella putrefaciens  Vibrio spp.  Serratia liquefaciens  Acetinobacter spp.  Hafnia alvi  Enterobacter agglomerans  Proteus mirabilis Proteus vulgaris  Pseudomonas spp.  Moraxella spp.  Aeromonas spp Sources bibliographiques variées et à actualiser

25 Impact de la Flore à Gram Négatif
 Shewanella putrefaciens -Altération des qualités organoleptiques du poisson Poissons frais: Le Cabillaud, Lee Hareng, Le Bar Poissons fumés: Le Saumon -Production de TMA (Triméthylamine) -Production d’H2S et odeurs putrides dans le saumon fumé Photobacterium phosphoreum -Altération des qualités organoleptiques du poisson* Emballé sous atmosphère modifiée et calamar -Production de TMA (Triméthylamine) -Production d’amines biogènes (histamine) Sources bibliographiques variées et à actualiser

26 Les Bactéries à Gram Positif
 Les bactéries lactiques Carnobacterium piscicola Carnobacterium divergens Lactobacillus alimentarius Lactobacillus bavaricus Lactobacillus curvatus Lactobacillus homohiochii Lactobacillus casei subsp. tolerans Lactobacillus coryneformis Lactobacillus farciminis Lactobacillus plantarum Lactobacillus sakei Lactococcus sp. Leuconostoc carnosum Leuconostoc mesenteroides  Brochotrix thermosphacta Sources bibliographiques variées et à actualiser

27 Informations génériques disponibles en ligne
La listériose Maladie à déclaration obligatoire depuis 1998 17 décès au Canada (Eté 2008) Taux de mortalité avoisinant les 30 % chez la femme enceinte 220 cas sporadiques de listériose recensés par an en France. Informations génériques disponibles en ligne

28 Systématique et bactériologie
Colonies typiques sur gélose sélective Listeria monocytogenes  Bactérie à Gram positif, distribution ubiquitaire  Températures de développement 4 à 45°C.  Concentrations en NaCl tolérées 10 à 20%. Cette bactérie à des capacités d’adaptation extraordinaires Gandhi M, Chikindas ML. Int J Food Microbiol Jan 1;113(1):1-15. Epub 2006 Sep 28. Review.

29 Relation listériose et consommation de saumon ou de truite fumés
Suède 9 personnes touchées dont 2 décès Finlande: 23 cas de listériose ont été recensés en Finlande entre juin 1999 et Février 2000, probablement liés à l’ingestion de poisson fumé ou salé à froid.  Normes ! Pas d’accord international sur le niveau acceptable de L. monocytogenes Remarque / En France et dans d’autres pays Européens, la législation tolère jusqu’à 100 UFC/g dans le saumon fumé à la DLC à condition que les entreprises ait effectué des études vieillissement de leurs produits prouvant que le seuil de 100 UFC/g n’est jamais dépassé à la DLC. (AFSSA, 2000; DGAL N98/N°8088, 1998).

30 Inhibition de L. monocytogenes dans le saumon fumé
6 5 (UFC/ g saumon) 4 Listeria monocytogenes 3 2 10 log 1 L. monocytogenes Cb. divergens V41 1 UFC/g 7 14 21 28 Temps (jours) (BRILLET et al, JAM. 97: )

31 Origine de cette inhibition ?
 Action inhibitrice de DvnV41 (in situ)?  Compétition nutritionnelle entre L. monocytogenes et Cb. divergens V41 ? Isolement et caractérisation d’une souche mutante déficiente dans la production de la divercine V41

32 Antagonisme microbien par production de peptide
Test de diffusion sur boite 1 2 3 Souche cible = Listeria monocytogenes Souche 1 Cb. divergens NCDO2763 (contrôle) Souche 3 Cb. divergens V41C9 (souche mutante) Souche 2 Cb. divergens V41 (souche sauvage) Richard C, Brillet A, Pilet MF, Prévost H, Drider D. 2003 Lett Appl Microbiol. 36:

33 Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
2,5 2 1,5 DO 405 nm 1 0,5 1 2 3 Souche 1 Cb. divergens NCDO2763 (contrôle) Souche 3 Cb. divergens V41C9 (souche mutante) Souche 2 Cb. divergens V41 (souche sauvage) Richard C, Brillet A, Pilet MF, Prévost H, Drider D. 2003 Lett Appl Microbiol. 36:

34 (Amplification et séquençage du gène dvnV41
Approche moléculaire (Amplification et séquençage du gène dvnV41 400 pb 300 pb 200 pb 1 2 3 Souche 1 Cb. divergens NCDO2763 (contrôle) Souche 3 Cb. divergens V41C9 (souche mutante) Souche 2 Cb. divergens V41 (souche sauvage) Richard C, Brillet A, Pilet MF, Prévost H, Drider D. 2003 Lett Appl Microbiol. 36:

35 Richard C, Brillet A, Pilet MF, Prévost H,
L. monocytogenes L. monocytogenes + C.b divergens V41C9 Souche mutante L. monocytogenes + Cb. divergens V41 Souche sauvage Richard C, Brillet A, Pilet MF, Prévost H, Lett Appl Microbiol. 36: Drider D. 2003

36 Sur colonies de la flore lactique
Suivi de l’implantation de C. divergens V41, parmi la flore lactique du saumon fumé inoculé, par la technique de PCR-Multiplex C. divergens V41 autres Carnobacterium ssp Sur colonies de la flore lactique Connil N, Prévost H, Dousset X J Appl Microbiol.92:

37 Activité In-vivo de la divercine recombinante
Expériences sur les animaux (souris, Balb/c) ont été réalisées dans le respect des principes éthiques fondamentaux. Rihakova J, Cappelier JM, Hue I, Demnerova K, Fédérighi M, Prévost H, Drider D. 2010 Antimicrob Agents Chemother. 54:

38 Stratégie expérimentale sur modèle murin « in vivo »
Utilisation DvnRV41 et peptides altérés (W19, Q21, A22, P40) Protocole expérimental (Ingham et al. 2003; modifié) Rihakova J, Cappelier JM, Hue I, Demnerova K, Fédérighi M, Prévost H, Drider D. 2010 Antimicrob Agents Chemother. 54:

39 Groupes 1 à 5 / (Post challenge test)
T= 0: Injection iv. de L. monocytogenes EGDe 1,5 x 103 UFC/ml T= 30 min : Injection iv de peptides (2 µg/50 µl) Peptides injectés (DvnRV41; W19F; Q21S, A22G, P40V)

40 Groupes 6 – 10 / (Pré challenge test)
T= - 15 min: Injection iv de peptides (2 µg/50 µl) T= 0 min : Injection iv de L. monocytogenes 1,5 x 103 UFC/ml Rihakova J, Cappelier JM, Hue I, Demnerova K, Fédérighi M, Prévost H, Drider D. 2010 Antimicrob Agents Chemother. 54:

41 Antimicrob Agents Chemother. 54:563-564.
OBSERVATION des souris pendant 72 heures - Diarrhée - Vomissement - Dépression Euthanasie par dislocation cervicale - Extraction organe (rate) - Isolement et dénombrement de L. monocytogenes Rihakova J, Cappelier JM, Hue I, Demnerova K, Fédérighi M, Prévost H, Drider D. 2010 Antimicrob Agents Chemother. 54:

42 Résultats Groupes 1-5 / (Post- challenge test)
3.23 ±1.88 1/5 (20) 2 / (30) 1.5 x 103 5 P40V 3.14 ± 2.93 2/5 (40) A22G 4 3.10 ± 2.93 Q21S 3 4.41 ± 2.46 W19F 2 0.97±2.17 4/5 (80) DvnRV41 1 nombre UFC (Log10)/rate) Nombre des souris avec la culture négative / totale ; exprimé en (%) Quantité de peptide µg /temps (min) Quantité de L. monocytogenes EGDe introduite Nombre de souris infectées Peptide Groupe 6.25 ± 0.19 0/5 (0) NC 11 NC = contrôle négatif Rihakova J, Cappelier JM, Hue I, Demnerova K, Fédérighi M, Prévost H, Drider D. 2010 Antimicrob Agents Chemother. 54:

43 Résultats Groupes 6-10 / (Pré challenge test)
4.25 ±2.38 1/5 (20) 2/ (15) 1.5 x 103 5 P40V 10 4.43 ± 2.50 2 / (15) A22G 9 2.83 ± 2.75 2/5 (40) Q21S 8 3.92 ± 2.32 W19F 7 3.13 ±2.86 DvnRV41 6 nombre CFU (Log10)/rate) Nombre des souris avec la culture négative / totale ; exprimé en (%) Quantité de peptide µg /temps (min) Quantité de L. monocytogenes EGDe introduite Nombre de souris infectées Peptide Groupe 6.25 ± 0.19 0/5 (0) CN 11 CN = contrôle négatif Rihakova J, Cappelier JM, Hue I, Demnerova K, Fédérighi M, Prévost H, Drider D. 2010 Antimicrob Agents Chemother. 54:

44 Publicité et bonnes œuvres
Société Française des Peptides Antimicrobiens ou Third International Symposium on Food, Veterinary and Medical Applications (Lille 2012) ou Procaryotic antimicrobial peptides: from genes to biotechnologies. Edited by D. Drider and S. Rebuffat. (Springer, NY-USA. 2011)