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Les échantillons… Cellules témoin Cellules avec drogue Extraction dARN ARN ADNc ~Cy3 Reverse Transcription (10µg ARN total) en présence de fluorophores.

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1 Les échantillons… Cellules témoin Cellules avec drogue Extraction dARN ARN ADNc ~Cy3 Reverse Transcription (10µg ARN total) en présence de fluorophores Hybridation Overnight Cy3Cy5 ARN ADNc ~Cy5 Revêtement de la lame Dépôt ADNs amplifiés par PCR La lame… Principe des puces à ADN Lecture de la lame (Packard ScanArray Express)

2 Quantification des données : QuantArray Uniformisation des données : script Perl Validation des données : macro Excel Travail sur les données : programmes SAM et XL STAT Introduction

3 1 Quantification des puces (QuantArray)

4 Pour ouvrir les images, sélectionner le Cy3 puis le Cy5 DANS CET ORDRE 2 Quantification des puces (QuantArray) Ch 1 = Cy5 Ch 2 = Cy3

5 … - intensités Ch 1 et 2 (Cy5 et Cy3) - bruit de fond Ch 1 et 2 (Cy5 et Cy3) fichier texte (séparateur tabulation) 3 Quantification des puces (QuantArray)

6 Caractéristiques: dépôts en quadruplet contrôles déposés Biopuce actuelle

7 Rapports des contrôles (Cy3 : Cy5 de la lame non swapée) -FaNaC (1:1) -DmDNaC(1:5) -DgNaC(5:1) -Gamma tub(1:2) -RNase NE(2:1) -MDH(0:0) Contrôles exogènes

8 1 Uniformisation des données (Perl) Intensité « normalisée » de chaque spot : I n = intensité «spé» du spot – médiane MDH

9 Condition témoin = Cy3 n lame 1 * Cy5 n lame 2 Condition exp. = Cy5 n lame 1 * Cy3 n lame 2 2 Uniformisation des données (Perl) Lame 1 Cellules témoin Cellules avec drogue Cy3Cy5 Lame 2 (swap) Cy5Cy3

10 3 Uniformisation des données (Perl) Pour le Script Perl : - quantifs de QuantArray sous forme texte séparateur tabulation (lame2134.txt) - liste des lames sous forme texte séparateur tabulation (liste2134.txt)

11 4 Uniformisation des données (Perl) Exécuter cmd Copier les données dans la base (quantifs QuantArray et listes)

12 5 Uniformisation des données (Perl) Exécuter telnet Lancer le script Perl pour normaliser nos données

13 6 Uniformisation des données (Perl) Exécuter cmd Copier les données normalisées dans lordinateur

14 7 Uniformisation des données (Perl) Position spot Sortie dun fichier à ouvrir sous Excel (lame2134_lame2135) Cy5 1 Cy3 s Cy5 1n * Cy3 sn Cy3 1 Cy5 s Cy3 1n * Cy5 sn Médiane MDH Condition 2Condition 1

15 1 Validation des données (Macro1) Superposition des fréquences des conditions témoin (1) et expérimentale (2). Intensité Nombre de spots

16 2 Validation des données (Macro1) Répartition des rapports (Cond1/Cond2) centrée sur 1 Log 2 (Cond1/Cond2) Intensité ( Cond1 2 +Cond2 2 )

17 3 Validation des données (Macro2) Comparaison des intensités des contrôles (rapports définis) DmDNaC 5/1 Gamma tub 2/1 FaNaC 1/1 RNase 1/2 DgNaC 1/5 MDH 0/0 Intensité condition 1 Intensité condition 2

18 4 Validation des données (Macro2) Correspondance des rapports théoriques / expérimentaux des contrôles Y= 0.98 x Rapport expérimental Rapport théorique

19 5 Validation des données (Macro) 1 Cliquer sur le 1 er validation des données (macro1) 2 Copier la liste des gènes (liste genes pour macro.xls)de la colonne AT à BA 3 Cliquer sur le 2 ème validation des contrôles (macro2) Attention aux points et aux virgules ! exemple

20 Résultats Détermination des gènes dont la transcription est significativement modulée (programme SAM). Classer les gènes et les expériences (programme XL STAT)

21 SAM One Class : trouver les gènes significatifs Two Class : 2 jeux de données (groupe ctrl et groupe traité, avec échantillons de différents patients dans chaque groupe). -Pas de blancs (NA) -Rapports (cond 1/cond 2) en log 2 -Sans virgule exemple

22 XL STAT Projection des données dans un sous espace de dimension réduite (Analyse en composante principale ou ACP). Organisation des données (classification ascendante hiérarchique ou CAH). Classification des données (K means). -Pas de blancs (remplacés par la moyenne de toutes les expériences) -Données en log 2 exemple

23 XL STAT classification ascendante hiérarchique ou CAH XL STAT classification ascendante hiérarchique ou CAH

24 XL STAT K means (nuées dynamiques) Permet de classer les gènes ou les expériences dans un nombre de classes défini


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