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Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes Julien Gagneur doctorant Grenoble, 6 Mai 2004.

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1 Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes Julien Gagneur doctorant Grenoble, 6 Mai 2004

2 Motivation On cherche à « explorer différentes approches pour l'étude intégrée des réseaux géniques et métaboliques » On se restreint à une cellule. Régulation Métabolisme Briques élémentaires Cofacteurs Substrats du milieu Molécules propres

3 Motivation = Roche Applied Science « Metabolic Pathways » map E. coli: 750 réactions 500 métabolites

4 Motivation Le « plan » est complet pour certains micro-organismes (H. influenzae, E. coli) Par séquençage et annotation de génome, en cours pour dautres micro-organismes (KEGG) Il existe des modèles des réactions enzymatiques (MCA) MAIS: Il est difficile destimer in vivo: Les lois cinétiques leurs paramètres les concentrations des métabolites

5 Motivation Des données structurelles, certes, mais (presque) complètes à léchelle cellulaire Que peut-on dire sur le métabolisme à partir du réseau seulement ou à partir du réseau et de quelques mesures? Approche par contraintes

6 Plan Analyses du métabolisme par contraintes État quasi-stationnaire Metabolic Flux Analysis Irréversibilité Flux Balance Analysis Metabolic Pathway Analysis Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques? Vue densemble Regulatory Flux Blance Analysis propositions

7 Plan Analyses du métabolisme par contraintes État quasi-stationnaire Metabolic Flux Analysis Irréversibilité Flux Balance Analysis Metabolic Pathway Analysis Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques? Vue densemble Regulatory Flux Blance Analysis propositions

8 Construction du modèle Système Métabolites Internes m=6 Externes Flux (réactions +transports): q=10 Stœchiométrie : (Klamt et al, 03)

9 La matrice de stœchiométrie N N est un composant essentiel du système dynamique La dynamique du système est décrite par (MCA): contient les paramètres cinétiques N invariant du système contient sa structure c(t) : concentrations r(t) : flux des réactions (reaction rates) N matrice creuse

10 Hypothèse détat quasi-stationnaire Les métabolites ont un temps de turn-over typique rapide par rapport à la régulation Metabolite r1r1 r2r2 r3r3 r4r4 r5r5 Le métabolisme est à létat quasi-stationnaire (quasi steady-state) c(t) const. Pour les métabolites internes: Production = Consommation }

11 Plan Analyses du métabolisme par contraintes État quasi-stationnaire Metabolic Flux Analysis Irréversibilité Flux Balance Analysis Metabolic Pathway Analysis Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques? Vue densemble Regulatory Flux Blance Analysis propositions

12 Metabolic Flux Analysis Détermination dune distribution de flux lors dune expérience à létat stationnaire L équation Nr = 0 est souvent indéterminée (q>m : plus de réactions que de métabolites) certains flux doivent être connus par mesures par hypothèses Soit: - k (known) les indices des flux connus - u (unknown) les indices des flux inconnus

13 Metabolic Flux Analysis La solution utilisée est basée sur la matrice pseudo-inverse de Moore-Penrose qui résout le problème des moindres carrés: -pour les cas sur-déterminé (moindres erreurs) -pour les cas sous-déterminé (solution parcimonieuse)

14 Metabolic Flux Analysis r1r1 r2r2 r3r3 r4r4 A B Sous- déterminé les flux manquants peuvent être estimés par: - pseudo-inverse (longueur minimale) - optimisation dautres objectifs (croissance maximale…) 2 A B 2 Déterminé 2 A 0 B A B Sur-déterminé Connu inconnu

15 MFA: Utilisation Avec les flux externes: souvent insuffisant Combines avec des mesures (partielles) des flux internes Isotopic Tracer Experiment (Wiechert et al.)

16 Plan Analyses du métabolisme par contraintes État quasi-stationnaire Metabolic Flux Analysis Irréversibilité Flux Balance Analysis Metabolic Pathway Analysis Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques? Premiers pas Ce que lon pourrait faire (propositions)

17 Irréversibilité de certaines réactions Certaines réactions, dans les conditions de fonctionnement de la cellule, sont unidirectionnelles. Les flux associés sont positifs ou nuls.

18 Construction du modèle (suite) Flux (réactions +transports): q=10 Rev={R2,R8} Irrev={R1,R3,R4,R5, R6,R7,R9,R10}

19 Le cône des états possibles Les états possibles obéissent à un ensemble de contraintes linéaires: m égalités : |Irr| inégalités : Cela restreint toute solution dans un cône polyédrique convexe

20 Plan Analyses du métabolisme par contraintes État quasi-stationnaire Metabolic Flux Analysis Irréversibilité Flux Balance Analysis Metabolic Pathway Analysis Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques? Vue densemble Regulatory Flux Blance Analysis propositions

21 Flux Balance Analysis Détermination dune distribution de flux optimale à létat stationnaire pour une fonction objectif donnée On considère un problème doptimisation linéaire: Problème standard et rapidement résoluble Le argmax nest pas unique ! Sous contrainte: État stationnaire réversibilité et capacité Exemples: réaction irréversible : i =0 flux maximal connu (capacité) : i =V max conditions du milieu : i = i =0

22 FBA: fonction objectif 1.Suivant lidée que lévolution a conduit à des « organismes optimaux »: croissance maximale (maximal growth) rendement dATP 2.« metabolic engineering »: optimisation dorganisme rendement maximal pour un certain produit Minimisation de produits secondaires

23 Max c T r = (0,0,1,0,0,0,0,0,0,0) r Sous: Nr = 0 i = (0,-,0,0,0,0,0,-,0,0) i = (1,0, +, +, +, +, +, +, +, +) manière optimale de produire P en présence de A seulement dans le milieu ? Rendement optimal = R3/R1= 1 FBA: exemple

24 Prédiction du taux de croissance optimal (et observation !) (Edwards et al., Ibarra et al. ) Identification de rendement optimaux (Nielsen et al., Stephanopoulos et al. ) Prédiction de viabilité de mutants (Edwards et al.) Invalidation de réseaux Une variante pour les mutants: MoMA Minimization of Metabolic Adjustment Le mutant serait à un état sous optimal mais voisin de létat optimal de la souche sauvage (Segre et al.) Simulation dynamique FBA: application et variante

25 « fonction objectif naturelle » les organismes sont-ils optimaux? Pour quel objectif? la solution optimale nest pas unique! Solution (1): P/A=1Solution (3)Solution (2) FBA: Limitations Pas de prédiction certaine de la distribution des flux

26 Plan Analyses du métabolisme par contraintes État quasi-stationnaire Metabolic Flux Analysis Irréversibilité Flux Balance Analysis Metabolic Pathway Analysis Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques? Vue densemble Regulatory Flux Blance Analysis propositions

27 Metabolic Pathway Analysis Définition de la notion de « voie métabolique » comme route fondamentale fonctionnelle a léquilibre. Lidée part du cône (espace des réactions): Problème : le cône nest pas toujours pointé (réactions réversibles) Tout r admissible est combinaison à coefficients positifs des rayons extrêmes rayons extrêmes = base convexe espace linéaire Pour avoir une définition canonique : 2 voies…

28 MPA: Extreme Pathways Par reconfiguration du réseau Lidée classique: pour toute variable libre x, on pose: x = x + - x - x + >=0 ; x - >=0 Toute réaction réversible est partagée en 2: forward et backward =AABB R RfRf RbRb et : cône pointé Extreme pathways = extreme rays

29 MPA: Elementary Flux Modes En se basant sur une propriété des rayons extrêmes Tout rayon extrême satisfait un maximum de contraintes avec égalité (maximum au sens de linclusion) Dans le cas irréversible: Elementary Flux Mode = une distribution de flux minimal (pour linclusion) en terme de réactions utilisées Toujours satisfaites avec égalité Un maximum avec égalité un minimum de réactions utilisées Cas général:

30 MPA: 2 voies = 1 voie En fait, extreme pathways = elementary flux modes Sauf: bi-cycle futile (futile 2-cycle) utiliser les Elementary Flux Mode (extreme pathway) AB RfRf RbRb AB problèmes de convention a linterface (flux entrants et sortants) pour les extremes pathways: certains pathways optimaux peuvent être omis

31 MPA: exemple (Klamt, 03) ensemble des solutions optimales pour P/A R6 et R9 sont parfaitement corrélées

32 MPA: applications et limitations Identification de « voie métabolique »: Base qui engendre toute solution admissible Contient une base pour les solutions optimales aux problèmes linéaires Corrélations de réactions Définition des délétions létales minimales (minimal cut set) Flexibilité du réseau (par le nombre dEFMs) Limitation: explosion combinatoire Métabolisme central dE.coli (109 réactions, EM)

33 Plan Analyses du métabolisme par contraintes État quasi-stationnaire Metabolic Flux Analysis Irréversibilité Flux Balance Analysis Metabolic Pathway Analysis Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques? Vue densemble Regulatory Flux Blance Analysis propositions

34 Modèles intégrés? vue densemble réseau Quantités / temps ? MPA FBA MFA J.P. rFBA

35 Plan Analyses du métabolisme par contraintes État quasi-stationnaire Metabolic Flux Analysis Irréversibilité Flux Balance Analysis Metabolic Pathway Analysis Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques? Vue densemble Regulatory Flux Balance Analysis proposition

36 Regulatory Flux Balance Analysis Covert, Palsson « transcriptional regulation in constraints- based metabolic models » J. Bio. Chem Réseau génique modélise comme un réseau booléen, qui réagit a la présence ou absence de métabolites internes ou externes. A une condition fixee par le reseau genique, FBA est appliquee Amélioration de la prédiction de viabilité de simples mutants (de 97 a 106 sur 116 ) Amélioration des modèles dynamiques La régulation contraint le métabolisme

37 Plan Analyses du métabolisme par contraintes État quasi-stationnaire Metabolic Flux Analysis Irréversibilité Flux Balance Analysis Metabolic Pathway Analysis Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques? Vue densemble Regulatory Flux Blance Analysis proposition

38 Proposition Quels degrés de liberté reste-t-il au réseau génique étant donné le réseau métabolique? gène constitutivement exprime? logique du réseau? un exemple : enzyme subset Le métabolisme contraint la régulation

39 Enzyme subset Pour linstant détecté au sein du noyau de N comme lignes colinéaires utilise pour réduire les modèles « vraisemblablement coregules » Ensemble de réactions qui opèrent a ratio de flux fixe 2 a 2 a létat stationnaire. AB Ou correlation plus distante Exemple: cascade ABC

40 Menaquinone synthesis operon Enterochelin synthesis operon A quel point peut-on prédire des opérons par contraintes structurelles issues du métabolisme? Des structures logiques plus complexes (OU) comme un iso- enzyme ? Proposition

41 Références (points dentrée) Metabolic Flux Analysis: Klamt et al. 2002« Calculability analysis in underdetermined metabolic networks illustrated by a model of the central metabolism in purple nonsulfur bacteria. » Biotechnol Bioeng. Mar 30;77(7): Flux Balance Analysis: Edwards et al 2001 « In silico predictions of E. coli metabolic capabilities are consistent with experimental data » Nature Biotech. 19: Metabolic Pathway Analysis: Klamt, Stelling 2003 « Two approaches for metabolic pathway analysis? » Trends in Biotech. 21 (2):64-69


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