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Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril.

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1 Ordre de passage pour les présentations 5 avril 12 avril 19 avril Ou 12 avril 19 avril

2 Techniques d’étude des interactions protéine-protéine à grande échelle Hervé PHILIPPE BIN1002 – hiver 2013

3 Pourquoi étudier les interactions protéine- protéine ? •beaucoup de matériel à disposition •focus sur l’étude des fonctions cellulaires •capacité des protéines à former des complexes •≈5 partenaires pour chaque protéine •importance des complexes protéiques dans l’aspect fonctionnel  interactome

4 De nombreuses techniques d’étude Piehler J. Curr.Op.Struct.Biol. 2005; 15:4-14 in vivo •maintien du contexte cellulaire in vitro •caractérisation détaillée des interactions (cinétique, stochiométrie …) •validation des résultats in vivo

5 Co-immunoprécipitation

6 Double hybride •utilisation de facteurs de transcription modulaires chez la levure •domaine d’activation •domaine de liaison à l’ADN •fusion des protéines à tester chacune avec un module du facteur de transcription •expression du produit de transcription si les protéines testées interagissent Principe :

7 Double hybride DA DL mARN DA : domaine d’activation DL : domaine de liaison à l’ADN TF Système rapporteur Fusion protéines et modules du facteur de transcription Expression du système DA DL prot 1 prot 2 DL prot 3 pas d’expression expression du gène colonies de levures mARN

8 Double hybride •expérience facile à mettre en placeAvantages : •analyse qualitative •faux positifs si les interactions préexistent chez la levure •faux négatifs : problème d’expression des protéines cibles chez la levure •non applicable aux protéines membranaires (30% du protéome) Inconvénients : •identification des interactions •criblage de banque de protéines Application : Fields S. & Song O. Nature. 1989; 340:

9 Interactome chez Caenorhabditis elegans Li S. et al.; Science 2004; 303:540–543

10 PCA : protein fragment complementation assay a)rapporteur (enzyme ou protéine fluorescente) b)fractionnement du rapporteur + fusion aux protéines à tester c)mesure de la reconstitution du rapporteur si les protéines testées interagissent Principe : Michnick SW. Curr Opin Biotechnol. 2003;14(6):610-7 Johnsson N & Varshavsky A. PNAS. 1994; 91:

11 PCA : protein fragment complementation assay Application : •applicable pour les protéines membranaires •réponse très rapide •niveau d’expression naturel Avantages : •décalage temporel de la réponse au signal d’expression •création de protéines chimériques qui peuvent modifier les interactions •nombreux faux positifs : accumulation du substrat et du produit de la réaction enzymatique Inconvénients : •identification des interactions •étude des réseaux d’interaction

12 FRET (fluorescence resonance energy transfer) 525 accepteur donneur excitation 475 nm 525 nm •excitation d’un fluorophore donneur par un photon •émission fluorescence par le donneur •excitation du fluorophore accepteur s’il est suffisamment proche •mesure du rapport de fluorescence Principe : R Å 475 nm émission L. Stryer; Annu Rev Biochem 1978; 47: 819–846

13 FRET (fluorescence resonance energy transfer) •étude dynamique en temps réel •applicable in vivo dans le système cellulaire originel •peut être couplé à un signal biologique •applicable dans tous les compartiments cellulaires Avantages : •création de protéines chimériques qui peuvent modifier les interactions •nécessite la surexpression des protéines testées Inconvénients : •signification biologique des interactions •localisation cellulaire par couplage avec des techniques de microscopie Application :

14 TAP-Tag : Tandem Affinity Purification Puig O. et al.; Methods 2001; 24:218–229 Principe : tag 1.constitution du complexe protéique in vivo puis lyse des cellules 2.fixation du complexe via la ProtA sur la colonne d’affinité et élution douce des contaminants 3.clivage du tag par la protéase 4.fixation du complexe via le peptide de fixation à la calmoduline et élution douce des contaminants résiduels et de la protéase 5.élution du complexe et analyses subséquentes peptide de fixation à la calmoduline domaines de fixation de la ProtA aux IgG site de clivage à la TEV protéase

15 Spectrométrie de masse •nécessite la purification des complexes •méthode compliquée et relativement coûteuse Inconvénients : Application :•identification des protéines présentes dans un complexe Gingras et al. (2005) J Physiol 563:11-21

16 TAP-Tag : Tandem Affinity Purification •seules les interactions très stables peuvent être détectées •nombreux faux positifs (protéines « colle ») Inconvénients : •seul l’appât est modifié, pas les autres protéines du complexe •taux d’expression biologique des protéines •identification de complexes avec plus de 2 protéines Avantages : Application :•identification des complexes protéiques

17 Quelques définitions Arbre = réseau connexe non cyclique Réseau non connexe non cyclique Réseau connexe cyclique Réseau connexe non cyclique branche noeud

18 Jeong et al, Nature 2001

19 Qualité du réseau d’interactions Nécessité de valider les résultats Très nombreuses interactions protéine/protéine détectées par différentes méthodes Pourquoi ? 1.Les méthodes sont prévues pour détecter des interactions différentes (binaire pour le double hybride, interactions fortes pour la protéomique, etc.) 2.Les méthodes se trompent (faux positifs, faux négatifs)

20 Qualité du réseau d’interactions Construction d’un ensemble d’interactions validées manuellement interactions impliquant 1308 protéines de la levure Saccharomyces cerevisiae (http://mips.gsf.de/proj/yeast/catalogues/complexes/index.html) 1.Coverage (couverture) : fraction des interactions de référence analysées par une méthode donnée 2.Accuracy (précision) : fraction des interactions de référence retrouvées par une méthode donnée Von Mering et al, Nature (2002) 417:

21 Qualité du réseau d’interactions Von Mering et al, Nature (2002) 417:

22 Qualité du réseau d’interactions Von Mering et al, Nature (2002) 417:

23 Qualité du réseau d’interactions Von Mering et al, Nature (2002) 417:

24 Qualité du réseau d’interactions Von Mering et al, Nature (2002) 417: Filtrage : interactions détectées trois fois pour le double-hybride, par exemple

25 Von Mering et al. (2005) Nucleic Acids Research, 33:D433–D437

26 Distance et Distance caractéristique d’un réseau  la distance d(u,v) est la longueur du plus court chemin connectant deux noeuds, c-à-d le nombre minimal de noeuds qu’il faut traverser pour se rendre d’un noeud u à un noeud v  la distance caractéristique L = mean u,v d(u,v) d’un graphe est la longueur moyenne du plus court chemin connectant deux noeuds

27 Diamètre d’un réseau  le diamètre D = max u,v d(u,v) d’un graphe est la longueur du plus long des plus courts chemins connectant deux noeuds, c’est-à-dire le nombre maximal de noeuds qu’il faut traverser pour se rendre d’un noeud u à un noeud v lorsque les retours, détours et boucles sont interdits 3457

28 Réseaux « Small-World »  dans un réseau Small-World, la plupart des noeuds sont voisins les uns des autres, c-à-d qu’il faut traverser un petit nombre de noeuds pour se rendre d’un noeud u à un noeud v ex : WWW ; liens sociaux entre les êtres humains formellement, on dit que son diamètre est petit (D ≤ 6)  ces réseaux ont des distances caractéristiques faibles

29 Connectivité d’un réseau  la connectivité K d’un réseau est le nombre minimal de liens connectant deux noeuds u et v  formellement, c’est le nombre minimal de noeuds qu’il faut supprimer pour déconnecter le réseau

30 Connectivité d’un noeud Jeong et al, Nature 2000 ExponentialScale-free  la connectivité K d’un noeud (protéine i) est le nombre de liens émanant du noeud i HUB

31 Une autre représentation du réseau

32 Après un algorithme de clustering

33 P - polarity R - Ras related pathway H - Highly osmotic conditions M - Mating/filamentation Modular organization of cellular networks Rives AW et al. PNAS, 2003 D 01

34 Modular organization of cellular networks Rives AW et al. PNAS, Modules - Intermodular connections - Intermodular connections

35 Recherche de modules Gavin et al. (2006) Nature, doi: /nature04532

36 Recherche de modules Gavin et al. (2006) Nature, doi: /nature04532 A(i,j) : indice de socio-affinité n i;j|i=bait : nombre of fois où protéines i et j sont retrouvées quand I est étiquettée : nombre of proies récupérées quand i est un appât : nombre de fois où protéines i and j sont copurifiées avec d’autres appâts.

37 Recherche de modules Gavin et al. (2006) Nature, doi: /nature04532

38 Recherche de modules Gavin et al. (2006) Nature, doi: /nature04532

39 Essentialité des gènes Yu et al (2004) Trends in Genetics 20:

40 Essentialité des gènes Yu et al (2004) Trends in Genetics 20: Hubs : 1061 protéines qui ont le plus grand nombre d’interactions

41 Robustesse du réseau aux mutations Jeong et al, Nature 2000

42 Robustesse du réseau aux mutations Freeland et al. (2000) Mol. Biol. Evol. 17:511–518

43 Kelley & Iteker (2005) Nature Biotechnology 23: Perspectives : combiner les réseaux


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