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Structure et propriétés des enzymes Objectifs de la leçon 1- Définir les termes enzymes, substrat, produits 2- Établir l’équation de Michaélis- Menten.

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1 Structure et propriétés des enzymes Objectifs de la leçon 1- Définir les termes enzymes, substrat, produits 2- Établir l’équation de Michaélis- Menten 3- Représenter graphiquement l’équation de Michaélis- Menten 4- Déterminer 3 méthodes de linéarisation de l’équation de Michaélis- Menten

2 I-Généralités Définition des enzymes : - Composés protéiques - Biocatalyseurs spécifiques : modulateurs des réactions chimiques - L’activité enzymatique est intimement liée à la structure tridimensionnelle - Perte d’activité par dénaturation protéique

3 I- Généralités  Propriétés générales des enzymes - Elles ne créent pas les réactions - Elles accélèrent la vitesse des réactions chimiques - Elles abaissent l’énergie d’activation et augmentent la concentration des substrats à l’état activé - Elles ne se perdent pas dans la réaction - Elles n’interviennent pas dans l’équilibre des réactions chimiques réversibles

4 I- Généralités  Propriétés générales des enzymes (suite) - Les enzymes agissent à de très faibles concentrations Activité moléculaire spécifique (AMS) : 10 3

5 I- Généralités  Propriétés générales des enzymes (suite) Les enzymes sont spécifiques : Spécificité de fonction Spécificité de substrat Spécificité optique Spécificité d’organe : exemple aminotransférases du foie et du coeur

6 II- Nomenclature des enzymes  Conceptions anciennes - Rajout du suffixe " ase " au nom du substrat Exemple substrat= urée ; Uréase = enzyme transformant l’urée en ammoniac + CO 2 - Rajout du suffixe " ase " au type de réaction catalysée par l’enzyme Exemple : urée + H 2 O ammoniac +CO 2 (hydrolase) - Noms communs consacrés par l’usage : Exemple : pepsine, trypsine, chymotrypsine ….etc.

7 II- Nomenclature des enzymes  Conceptions actuelles  Numéro d’ordre - Recommandation de l’union internationale de Biochimie (UIB) : enzyme dénommée par 4 chiffres séparés par des points Exemple : = alcool déshydrogénase  Nom systématique  Nom commun recommandé (appellation consacrée par l’usage)

8 II- Nomenclature des enzymes  Les 4 chiffres recommandés par l’UIB - Premier chiffre(le plus important) = classe de l’enzyme - Deuxième chiffre = sous-classe de l’enzyme (type de fonction du substrat participant à la réaction) - Troisième chiffre = sous-sous-classe de l’enzyme (nature de l’accepteur) - Quatrième chiffre = place de l’enzyme particulière à nommer dans la sous-sous- classe.

9 II-1 Nomenclature des enzymes selon le numéro d’ordre de l’UIB  Les 6 classes principales d’enzymes (Premiers chiffres selon UIB): - 1. Classe des oxydo-réductases - 2. Classe des transférases - 3. Classe des hydrolases ( OTHLIL) - 4. Classe des lyases - 5. Classe des isomérases - 6. Classe des ligases

10 II-2 Autre nomenclature des enzymes ( noms systématique et recommandé)  Nom systématique : 3 éléments de référence du nom systématique : - Nature du donneur - Nature de l’accepteur - Type de réaction catalysée  Nom recommandé : Appellation consacrée par l’usage, comme dans le cas des conceptions anciennes

11 II-3.Application de la nomenclature des enzymes  Exemple : phosphorylation du glucose α-D-glucose + ATP  α-D-glucose-6-phosphate + ADP - Numéro d’ordre = Nom systématique = ATP- α-D-glucose - 6- phosphate transférase - Nom recommandé = Glucokinase

12 III-Grandes fonctions enzymatiques III-1. Les réactions d’oxydo-réduction - Transfert d’électrons avec ou non transfert de protons - Support du transfert : corps donneur et corps accepteur - Exemple : CH 3 -CH 2 OH + NAD  CH 3 -CHO + NADH 2 Ethanol Acétaldéhyde - Faits marquants : transfert d’hydrogènes et d’électrons

13 III-Grandes fonctions enzymatiques III-2. Les réactions de transfert Exemple :phosphorylation du glucose Glucose + ATP  Glucose-6 P + ADP Enzymes de catalyses = transférases

14 III-Grandes fonctions enzymatiques III-3. Réactions d’hydrolyse - réactions réversibles - Enzymes de catalyse : hydrolases - Exemple : CH 3 -CO-O-CH 2 -CH 2 -N + (CH 3 ) 3  c H 3 -COOH + OH-CH 2 -CH 2 - N + (CH 3 ) 3 Acétylcholine Acide acétique + Choline

15 III-Grandes fonctions enzymatiques III-4.Réactions catalysées par les lyases - Addition ou retrait de groupements à des carbones impliqués dans des liaisons - Création ou saturation de doubles liaison

16 III-Grandes fonctions enzymatiques III-5. Réactions d’isomérisation - Réarrangements intramoléculaires - Enzymes de catalyse : isomérases - Catégories d’isomérases  Racémases :(série D  Série L)  Mutases : transfert interne de radical (exemple : Glucose-6-phosphate  Glucose-1- phosphate)  Epimérase ( exemple: Galactose glucose)  Cis trans-isomérase ( exemple : Fumarate  Malate)

17 IV- Cinétique enzymatique  Complexe enzyme-substrat (complexe ES) - fixation du Substrat sur le site actif de l’enzyme S + E ES  P + E Remarque : - S= substrat; E = Enzyme; P = Produit - Disparition de S se traduit par l’apparition de P

18 IV- Cinétique enzymatique  Vitesse de la réaction (V) -Nombre de molécules de substrat (S) transformées en produit (P) par unité de temps. V = ‑ d[S] = d[P] dt dt - Ordre de réaction 0, 1 ou 2 en cinétique chimique A…B V = ‑ d[A] = K[A]  dt α = ordre de la réaction; K = constante de vitesse

19 IV- Cinétique enzymatique  Réaction du premier ordre : - transformation d’un seul substrat - [S] est une fonction exponentielle décroissante du temps et de K la constante de vitesse: Ln [S] = -Kt + Ln [S 0 ] d’où V = ‑ d[S] = d[P] = K 1 [S] dt dt T 1/2 =durée de consommation de la moitié de [S] T 1/2 = Ln2/K1

20 IV- Cinétique enzymatique  Réaction de second ordre : - réaction où deux substrats réagissent entre eux pour donner un ou deux produits A + B …… C V = d[C] = K[A] [B] dt Remarque : V en Ms -1 et K en M -1 S –1 T 1/2 = 1/(K 2 [A 0 ])

21 IV- Cinétique enzymatique  Application à la réaction enzymatique - 2 étapes essentielles : formation du complexe ES et étape de catalyse avec apparition de produit (P) E + S ES E + P Remarque : - ES = complexe de Michaëlis – Menten - ES se dissocie en P et en E. La constante est appelée constante catalytique K cat (en s -1 ) K1K1 K -1 K2K2

22 IV- Cinétique enzymatique  Vitesse initiale V 0 = d[P] = K cat [ES] dt  Hypothèse de Brigg et Haldane - notion d’état stationnaire : V a = K 1 [E][S] = V d = K -1 [ES] + K cat [ES]

23 IV- Cinétique enzymatique  Equation de Brigg – Haldane K 1 [E][S] = K -1 [ES] + K cat [ES]= (K -1 + K cat ) [ES] et (K -1 + K cat )/ K 1 = K m D’où [E][S] = K m [ES] K m = constante de Michaëlis. Remarque : K m s’exprime en molarité (ou M), c’est une concentration.

24 IV- Cinétique enzymatique  Equation de Michaelis – Menten [E] totale = [E] 0 = [E] + [ES] d’où [E]= [E] 0 - [ES] On a [E][S] = K m [ES] ( équation de Brigg – Haldane) Alors ([E] 0 - [ES]) [S] = K m [ES]

25 IV- Cinétique enzymatique  Equation de Michaëlis – Menten [E] 0 [S] - [ES] [S] = K m [ES] d’où [E] 0 [S] = [ES] [S] + K m [ES] = ([S] + K m ) [ES] [E] 0 [S] = ([S] + K m ) [ES] d’où [ES] = [E] 0 [S] / ([S] + K m ) Donc V 0 = K cat [ES] = K cat [E] 0 [S] / ([S] + K m ) = équation de Michaëlis-Menten Remarque : si [ES] = [E] 0 = [E] totale

26 IV- Cinétique enzymatique  Equation de Michaelis – Menten (MM) si [ES] = [E] 0 = [E] totale alors V 0 = Vmax = K cat [E] 0 et on avait V 0 = K cat [ES] = K cat [E] 0 [S] / ([S] + K m ) V 0 = Vmax[S] = équation de MM K m + [S]

27 V- Représentation graphique  Cinétique Michaélienne Km Vmax v [S] Vmax/2 Courbe de Michaelis-Menten

28 V- Représentation graphique  Linéarisation de l’équation de MM  Équation de Lineweaver- Burk (LB) -1/Km 1/Vmax 2/Vmax 1/V 1/[S] Droite de Lineweaver-Burk

29 V- Représentation graphique  Linéarisation de l’équation de MM Transformation d’Eadie-Hofstee Vmax/Km Vmax V v/[S]

30 V- Représentation graphique -Km Km/Vmax [S]/V [S] Linéarisation de l’équation de MM par Transformation selon Hanes

31 Modulation de l’activité enzymatique  Objectifs de la leçon 1- Décrire les différents types d’inhibition enzymatique 2- Déterminer les constantes Km et Vmax en absence et en présence d’un inhibiteur compétitif non compétitif ou incompétitif 3- Représenter la cinétique en absence et en présence de de chacun des différents inhibiteurs ( compétitif non compétitif ou incompétitif) 4- Comparer les profils cinétiques de l’enzyme à la cinétique michaëlienne et de l’enzyme allostérique

32 VI- Modulation de l’activité enzymatique  Effecteurs physiques  Effet du pH sur l’activité enzymatique - activité enzymatique maximale au pH optimum.  Effet de la température sur l’activité enzymatique - activité enzymatique maximale à température optimale - Augmentation de la température peut dénaturer (perte de l’activité enzymatique)

33 Récapitulatif des effets pH et température sur l’activité de l’enzyme Activité relative pH Température

34 VI- Modulation de l’activité enzymatique  Activateurs et Inhibiteurs enzymatiques - Certains composés agissent sur l’activité enzymatique :  en la favorisant (ce sont les activateurs ),  ou en la défavorisant (ce sont les inhibiteurs Inhibiteurs réversibles compétitifs Inhibiteurs réversibles non compétitifs Inhibiteurs incompétitifs.

35 VI- Modulation de l’activité enzymatique  Inhibiteurs réversibles compétitifs (IRC) - Les IRC se lient de manière réversible au site actif de l'enzyme et en bloquent l'accès au substrat. - IRC et substrat (S) souvent analogues structuraux d’où la compétition entre IRC et substrat (S)

36 Cinétique enzymatique en présence d’inhibiteurs Réversibles compétitifs

37  Devenir des constantes cinétiques K M et V max  K M Dans l’équation de Michaelis-Menten K M est remplacé par : K M ' = K M (1 + [I]/K I ) où K I = k i /k -i est la constante de dissociation de l'inhibiteur.  V max La vitesse maximale v max reste la même.

38 Cinétique enzymatique en présence d’inhibiteurs Réversibles compétitifs  Représentation graphique de Lineweaver-Burk 1/V E + S E + S + IRC

39 VI- Modulation de l’activité enzymatique  Inhibiteurs réversibles non compétitifs (IRNC) - IRNC se lient de manière réversible ailleurs qu'au site actif de l'enzyme et n'en empêchent pas l'accès du substrat (S).

40 Cinétique enzymatique en présence d’inhibiteurs Réversibles non compétitifs

41  Devenir des constantes cinétiques K M et V max  K M - K M ne change pas  V max - V max change v max ' = v max / (1 + [I]/K I )

42 Cinétique enzymatique en présence d’inhibiteurs Réversibles non compétitifs  Représentation graphique de Lineweaver-Burk 1/V E + S E + S + IRNC

43 VI- Modulation de l’activité enzymatique  Inhibition incompétitive - l'inhibiteur incompétitif ne se lie que sur le complexe Enzyme-substrat (ES)

44 VI- Modulation de l’activité enzymatique  Effet des activateurs - petites molécules : cations métalliques - Association à l’enzyme ou au complexe ES - Effets délétères des chélateurs de ces ions sur l’activité enzymatique

45 VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation des enzymes  Site actif - centre catalytique constitué de groupements fonctionnels - groupements fonctionnels non forcément voisins sur la structure I aire mais rapprochés à la faveur des autres structures (II aire, III aire et IV aire ) - Site actif = cible pour le marquage chimique

46 VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation des enzymes  Marquage du site actif de l’enzyme - marqueurs présentant une affinité des groupements du sites - Marqueur inactive l’enzyme Exemple de marqueurs : diisopropylfluorophosphate (cible :ser); iodacétamide (cible : Cys); acétylation (cible : - NH 2 ); estérification (cible : groupe C00H)

47 VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation des enzymes  Importance relative des AA dans l’activité de l’enzyme - AA du site actif : rôle de fixation,d’orientation et d’activation - AA collaborateurs : pas d’action directe mais leur fragilisation fragilise l’enzyme - AA auxiliaires : participent fixation de S et expulsion de P - AA non collaborateurs : rôle non établi.

48 VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation des enzymes  Niveau d’organisation des enzymes - systèmes poly enzymatiques :cas des enzymes cellulaires (succession des réactions ) - Exemple de chaîne séquentielle : E 1 E 2 E 3 E 4 A → B → C → D → Produit final

49 VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation des enzymes  Enzymes allostériques  Caractéristiques - enzymes volumineuses, fragiles (purification difficile) - enzymes inactives à 0°C; activité optimale à +20°C - Enzymes formées de plusieurs sous-unités - Coopérativité des sous-unités par transition allostérique

50 VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation des enzymes  Enzymes allostériques  Cinétique des enzymes allostériques -Allure sigmoïdale (Enzyme allostérique) contrairement à celle hyperbolique (Enzyme à cinétique michaëlienne)

51 VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation des enzymes  cinétique d’enzyme allostérique v [S]

52 VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation des enzymes  Enzymes allostériques  Désensibilisation des enzymes allostériques - perte de l’effet coopératif - Insensibilité aux modulateurs - Activité enzymatique : l’allure sigmoïde est remmplacée par une hyperbole (cinétique michaélienne)

53 VIII- Les Coenzymes  Généralités sur les coenzymes - Enzymes distinguées en holoenzymes et en hétéroenzymes - Hétéroenzyme : apoenzyme + partie non protéique - Partie non protéique : Cofacteur = ion métallique Coenzyme = molécule organique (groupement prostétique, co substrat)  Exemples de coenzymes : NAD; NADP; FAD; FMN, phosphate de pyridoxal; pyrophosphate de thiamine, Coenzyme A

54 IX- Les isoenzymes  Généralités sur les isoenzymes - Isoenzymes = formes moléculaires d’une même enzyme - Formes actives sur le même substrat principal  Éléments de différence : - Charge - pH optimum d’activité - Thermostabilité - Substrats secondaires - Inhibiteurs chimiques

55 IX- Les isoenzymes  Intérêts bio cliniques des isoenzymes  Exemple de la lacticodéshydrogénase (LDH) - 5 isoenzymes LDH 1, LDH 2, LDH 3,LDH 4 et LDH 5 - Chaque isoenzyme, tétramérique, est formées à partir de deux types de sous-unités M et H - origine tissulaire des sous-unités : M : prédominant dans le muscle H : prédominant dans le cœur (H = Hearth)

56 IX- Les isoenzymes  Intérêts bio cliniques des isoenzymes  Profil électrophorétique des isoenzymes LDH M 4 M 3 H 1 M 2 H 2 M 1 H 3 H 4 LDH 5 LDH 4 LDH 3 LDH 2 LDH 1 Dépôt - +

57 IX- Les isoenzymes  Intérêts bio cliniques des isoenzymes  Exemple de la créatine kinase (CK) - 3 isoenzymes : CK-BB, CK-MB et CK-MM - Chaque isoenzyme, dimérique, est formée à partir de deux types de sous-unités M et B M : prédominant dans le muscle B : prédominant dans le cerveau (B = Brain) - CK-BB, CK-MB et CK-MM sont séparables par électrophorèse - CK-MB augmente au cours de l’infarctus du myocarde

58 X- Les macroenzymes  Généralités :  macroenzymes : formes inhabituelles  Complexes divers : - association enzymes et immunoglobulines - enzymes autoagrégées - association enzymes et lipoprotéines - enzymes de fragment membranaire circulant

59 X- Les macroenzymes  Intérêts bio cliniques des macroenzymes  Exemples : Macroamylase : élévation dans affection pancréatique Macrocréatine kinases : macro CK de type 1 et macro CK de type 2

60 X- Les macroenzymes  Valeur diagnostique des macrocréatines kinases - Élévation macro CK de type 1 : sans valeur diagnostique, faux positif au cours de l’infarctus du myocarde - Élévation macro CK de type 2 :infarctus massif du myocarde (mauvais pronostic)

61 FIN


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