Structure et propriétés des enzymes

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1 Structure et propriétés des enzymes
Objectifs de la leçon 1- Définir les termes enzymes, substrat, produits 2- Établir l’équation de Michaélis- Menten 3- Représenter graphiquement l’équation de Michaélis- Menten 4- Déterminer 3 méthodes de linéarisation de l’équation de Michaélis- Menten

2 I-Généralités Définition des enzymes : Composés protéiques
Biocatalyseurs spécifiques : modulateurs des réactions chimiques L’activité enzymatique est intimement liée à la structure tridimensionnelle Perte d’activité par dénaturation protéique

3 I- Généralités Propriétés générales des enzymes
Elles ne créent pas les réactions Elles accélèrent la vitesse des réactions chimiques Elles abaissent l’énergie d’activation et augmentent la concentration des substrats à l’état activé Elles ne se perdent pas dans la réaction Elles n’interviennent pas dans l’équilibre des réactions chimiques réversibles

4 I- Généralités Propriétés générales des enzymes (suite)
Les enzymes agissent à de très faibles concentrations Activité moléculaire spécifique (AMS) : 103<AMS<106

5 Les enzymes sont spécifiques : Spécificité de fonction
I- Généralités Propriétés générales des enzymes (suite) Les enzymes sont spécifiques : Spécificité de fonction Spécificité de substrat Spécificité optique Spécificité d’organe : exemple aminotransférases du foie et du coeur

6 II- Nomenclature des enzymes
Conceptions anciennes Rajout du suffixe " ase "  au nom du substrat Exemple substrat= urée ; Uréase = enzyme transformant l’urée en ammoniac + CO2 Rajout du suffixe " ase "  au type de réaction catalysée par l’enzyme Exemple : urée + H2O ammoniac +CO2 (hydrolase) Noms communs consacrés par l’usage : Exemple : pepsine, trypsine, chymotrypsine ….etc.

7 II- Nomenclature des enzymes
Conceptions actuelles Numéro d’ordre Recommandation de l’union internationale de Biochimie (UIB) : enzyme dénommée par 4 chiffres séparés par des points Exemple : = alcool déshydrogénase Nom systématique Nom commun recommandé (appellation consacrée par l’usage)

8 II- Nomenclature des enzymes
Les 4 chiffres recommandés par l’UIB - Premier chiffre(le plus important) = classe de l’enzyme Deuxième chiffre = sous-classe de l’enzyme (type de fonction du substrat participant à la réaction) Troisième chiffre = sous-sous-classe de l’enzyme (nature de l’accepteur) Quatrième chiffre = place de l’enzyme particulière à nommer dans la sous-sous- classe.

9 II-1 Nomenclature des enzymes selon le numéro d’ordre de l’UIB
Les 6 classes principales d’enzymes (Premiers chiffres selon UIB): 1. Classe des oxydo-réductases 2. Classe des transférases 3. Classe des hydrolases (OTHLIL) 4. Classe des lyases 5. Classe des isomérases 6. Classe des ligases

10 II-2 Autre nomenclature des enzymes ( noms systématique et recommandé)
Nom systématique : 3 éléments de référence du nom systématique : Nature du donneur Nature de l’accepteur Type de réaction catalysée Nom recommandé : Appellation consacrée par l’usage, comme dans le cas des conceptions anciennes

11 II-3.Application de la nomenclature des enzymes
Exemple : phosphorylation du glucose α-D-glucose + ATP  α-D-glucose-6-phosphate + ADP Numéro d’ordre = Nom systématique = ATP- α-D-glucose - 6- phosphate transférase Nom recommandé = Glucokinase

12 III-Grandes fonctions enzymatiques
III-1. Les réactions d’oxydo-réduction Transfert d’électrons avec ou non transfert de protons Support du transfert : corps donneur et corps accepteur Exemple : CH3-CH2OH + NAD  CH3-CHO + NADH2 Ethanol Acétaldéhyde Faits marquants : transfert d’hydrogènes et d’électrons

13 III-Grandes fonctions enzymatiques
III-2. Les réactions de transfert Exemple :phosphorylation du glucose Glucose + ATP  Glucose-6 P + ADP Enzymes de catalyses = transférases

14 III-Grandes fonctions enzymatiques
III-3. Réactions d’hydrolyse réactions réversibles Enzymes de catalyse : hydrolases Exemple : CH3-CO-O-CH2-CH2-N+(CH3)3  cH3-COOH + OH-CH2-CH2- N+(CH3)3 Acétylcholine Acide acétique Choline

15 III-Grandes fonctions enzymatiques
III-4.Réactions catalysées par les lyases Addition ou retrait de groupements à des carbones impliqués dans des liaisons Création ou saturation de doubles liaison

16 III-Grandes fonctions enzymatiques
III-5. Réactions d’isomérisation Réarrangements intramoléculaires Enzymes de catalyse : isomérases Catégories d’isomérases Racémases :(série D  Série L) Mutases : transfert interne de radical (exemple : Glucose-6-phosphate  Glucose-1- phosphate) Epimérase ( exemple: Galactose glucose) Cis trans-isomérase (exemple : Fumarate  Malate)

17 IV- Cinétique enzymatique
Complexe enzyme-substrat (complexe ES) fixation du Substrat sur le site actif de l’enzyme S + E ES  P + E Remarque : S= substrat; E = Enzyme; P = Produit Disparition de S se traduit par l’apparition de P

18 IV- Cinétique enzymatique
Vitesse de la réaction (V) -Nombre de molécules de substrat (S) transformées en produit (P) par unité de temps. V = ‑ d[S] = d[P] dt dt Ordre de réaction 0, 1 ou 2 en cinétique chimique A…B V = ‑ d[A] = K[A] dt α = ordre de la réaction; K = constante de vitesse

19 IV- Cinétique enzymatique
Réaction du premier ordre : - transformation d’un seul substrat [S] est une fonction exponentielle décroissante du temps et de K la constante de vitesse: Ln [S] = -Kt + Ln [S0] d’où V = ‑ d[S] = d[P] = K1[S] dt dt T1/2=durée de consommation de la moitié de [S] T1/ = Ln2/K1

20 IV- Cinétique enzymatique
Réaction de second ordre : réaction où deux substrats réagissent entre eux pour donner un ou deux produits A + B …… C V = d[C] = K[A] [B] dt Remarque : V en Ms-1 et K en M -1 S –1 T1/ = /(K2 [A0])

21 IV- Cinétique enzymatique
Application à la réaction enzymatique 2 étapes essentielles : formation du complexe ES et étape de catalyse avec apparition de produit (P) E + S ES E + P Remarque : ES = complexe de Michaëlis – Menten ES se dissocie en P et en E. La constante est appelée constante catalytique Kcat (en s -1 ) K1 K2 K-1

22 IV- Cinétique enzymatique
Vitesse initiale V0 = d[P] = Kcat [ES] dt Hypothèse de Brigg et Haldane notion d’état stationnaire : Va = K1[E][S] = Vd= K-1 [ES] + Kcat [ES]

23 IV- Cinétique enzymatique
Equation de Brigg – Haldane K1[E][S] = K-1 [ES] + Kcat [ES]= (K-1 + Kcat) [ES] et (K-1 + Kcat)/ K1 = Km D’où [E][S] = Km [ES] Km = constante de Michaëlis . Remarque : Km s’exprime en molarité (ou M), c’est une concentration.

24 IV- Cinétique enzymatique
Equation de Michaelis – Menten [E]totale = [E]0 = [E] + [ES] d’où [E]= [E]0 - [ES] On a [E][S] = Km [ES] ( équation de Brigg – Haldane) Alors ([E]0 - [ES]) [S] = Km [ES]

25 IV- Cinétique enzymatique
Equation de Michaëlis – Menten [E]0 [S] - [ES] [S] = Km [ES] d’où [E]0 [S] = [ES] [S] + Km [ES] = ([S] + Km ) [ES] [E]0 [S] = ([S] + Km ) [ES] d’où [ES] = [E]0 [S] / ([S] + Km ) Donc V0 = Kcat [ES] = Kcat [E]0 [S] / ([S] + Km ) = équation de Michaëlis-Menten Remarque : si [ES] = [E]0 =[E]totale

26 IV- Cinétique enzymatique
Equation de Michaelis – Menten (MM) si [ES] = [E]0 = [E]totale alors V0 = Vmax = Kcat [E]0 et on avait V0 = Kcat [ES] = Kcat [E]0 [S] / ([S] + Km ) V0 = Vmax[S] = équation de MM Km + [S]

27 V- Représentation graphique
Cinétique Michaélienne Courbe de Michaelis-Menten Km Vmax v [S] Vmax/2

28 V- Représentation graphique
Linéarisation de l’équation de MM Équation de Lineweaver- Burk (LB) -1/Km 1/Vmax 2/Vmax 1/V 1/[S] Droite de Lineweaver-Burk

29 V- Représentation graphique
Linéarisation de l’équation de MM Transformation d’Eadie-Hofstee Vmax/Km Vmax V v/[S]

30 V- Représentation graphique
-Km Km/Vmax [S]/V [S] Linéarisation de l’équation de MM par Transformation selon Hanes

31 Modulation de l’activité enzymatique
Objectifs de la leçon 1- Décrire les différents types d’inhibition enzymatique 2- Déterminer les constantes Km et Vmax en absence et en présence d’un inhibiteur compétitif non compétitif ou incompétitif 3- Représenter la cinétique en absence et en présence de de chacun des différents inhibiteurs ( compétitif non compétitif ou incompétitif) 4- Comparer les profils cinétiques de l’enzyme à la cinétique michaëlienne et de l’enzyme allostérique

32 VI- Modulation de l’activité enzymatique
Effecteurs physiques Effet du pH sur l’activité enzymatique activité enzymatique maximale au pH optimum. Effet de la température sur l’activité enzymatique - activité enzymatique maximale à température optimale  Augmentation de la température peut dénaturer (perte de l’activité enzymatique)

33 Récapitulatif des effets pH et température sur l’activité de l’enzyme
Activité relative Activité relative pH Température

34 VI- Modulation de l’activité enzymatique
Activateurs et Inhibiteurs enzymatiques Certains composés agissent sur l’activité enzymatique : en la favorisant (ce sont les activateurs), ou en la défavorisant (ce sont les inhibiteurs Inhibiteurs réversibles compétitifs Inhibiteurs réversibles non compétitifs Inhibiteurs incompétitifs.

35 VI- Modulation de l’activité enzymatique
Inhibiteurs réversibles compétitifs (IRC) Les IRC se lient de manière réversible au site actif de l'enzyme et en bloquent l'accès au substrat. IRC et substrat (S) souvent analogues structuraux d’où la compétition entre IRC et substrat (S)

36 Cinétique enzymatique en présence d’inhibiteurs Réversibles compétitifs

37 Cinétique enzymatique en présence d’inhibiteurs Réversibles compétitifs
Devenir des constantes cinétiques KM et Vmax KM Dans l’équation de Michaelis-Menten KM est remplacé par : KM' = KM • (1 + [I]/KI ) où KI = ki/k-i est la constante de dissociation de l'inhibiteur. Vmax La vitesse maximale vmax reste la même.

38 Cinétique enzymatique en présence d’inhibiteurs Réversibles compétitifs
Représentation graphique de Lineweaver-Burk 1/V E + S E + S + IRC

39 VI- Modulation de l’activité enzymatique
Inhibiteurs réversibles non compétitifs (IRNC) - IRNC se lient de manière réversible ailleurs qu'au site actif de l'enzyme et n'en empêchent pas l'accès du substrat (S).

40 Cinétique enzymatique en présence d’inhibiteurs Réversibles non compétitifs

41 Cinétique enzymatique en présence d’inhibiteurs Réversibles non compétitifs
Devenir des constantes cinétiques KM et Vmax KM KM ne change pas Vmax Vmax change vmax' = vmax / (1 + [I]/KI )

42 Cinétique enzymatique en présence d’inhibiteurs Réversibles non compétitifs
Représentation graphique de Lineweaver-Burk 1/V E + S E + S + IRNC

43 VI- Modulation de l’activité enzymatique
Inhibition incompétitive l'inhibiteur incompétitif ne se lie que sur le complexe Enzyme-substrat (ES)

44 VI- Modulation de l’activité enzymatique
Effet des activateurs petites molécules : cations métalliques Association à l’enzyme ou au complexe ES Effets délétères des chélateurs de ces ions sur l’activité enzymatique

45 VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation des enzymes
Site actif centre catalytique constitué de groupements fonctionnels groupements fonctionnels non forcément voisins sur la structure I aire mais rapprochés à la faveur des autres structures (II aire, IIIaire et IV aire) Site actif = cible pour le marquage chimique

46 VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation des enzymes
Marquage du site actif de l’enzyme marqueurs présentant une affinité des groupements du sites Marqueur inactive l’enzyme Exemple de marqueurs : diisopropylfluorophosphate (cible :ser); iodacétamide (cible : Cys); acétylation (cible : - NH2); estérification (cible : groupe C00H)

47 VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation des enzymes
Importance relative des AA dans l’activité de l’enzyme AA du site actif : rôle de fixation,d’orientation et d’activation AA collaborateurs : pas d’action directe mais leur fragilisation fragilise l’enzyme AA auxiliaires : participent fixation de S et expulsion de P AA non collaborateurs : rôle non établi.

48 VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation des enzymes
Niveau d’organisation des enzymes systèmes poly enzymatiques :cas des enzymes cellulaires (succession des réactions ) Exemple de chaîne séquentielle :   E E E E4 A → B → C → D → Produit final

49 VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation des enzymes
Enzymes allostériques Caractéristiques enzymes volumineuses, fragiles (purification difficile) enzymes inactives à 0°C; activité optimale à +20°C Enzymes formées de plusieurs sous-unités Coopérativité des sous-unités par transition allostérique

50 VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation des enzymes
Enzymes allostériques Cinétique des enzymes allostériques -Allure sigmoïdale (Enzyme allostérique) contrairement à celle hyperbolique (Enzyme à cinétique michaëlienne)

51 VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation des enzymes
cinétique d’enzyme allostérique v [S]

52 VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation des enzymes
Enzymes allostériques Désensibilisation des enzymes allostériques perte de l’effet coopératif Insensibilité aux modulateurs Activité enzymatique : l’allure sigmoïde est remmplacée par une hyperbole (cinétique michaélienne)

53 VIII- Les Coenzymes Généralités sur les coenzymes
Enzymes distinguées en holoenzymes et en hétéroenzymes Hétéroenzyme : apoenzyme + partie non protéique Partie non protéique : Cofacteur = ion métallique Coenzyme = molécule organique (groupement prostétique, co substrat) Exemples de coenzymes : NAD; NADP; FAD; FMN, phosphate de pyridoxal; pyrophosphate de thiamine, Coenzyme A

54 IX- Les isoenzymes Généralités sur les isoenzymes
Isoenzymes = formes moléculaires d’une même enzyme Formes actives sur le même substrat principal Éléments de différence : Charge pH optimum d’activité Thermostabilité Substrats secondaires Inhibiteurs chimiques

55 IX- Les isoenzymes Intérêts bio cliniques des isoenzymes
Exemple de la lacticodéshydrogénase (LDH) - 5 isoenzymes LDH1, LDH2, LDH3,LDH4 et LDH5 Chaque isoenzyme, tétramérique, est formées à partir de deux types de sous-unités M et H origine tissulaire des sous-unités : M : prédominant dans le muscle H : prédominant dans le cœur (H = Hearth)

56 - + IX- Les isoenzymes Intérêts bio cliniques des isoenzymes
Profil électrophorétique des isoenzymes LDH M4 M3H M2H M1H H4 LDH5 LDH LDH LDH LDH1 Dépôt - +

57 IX- Les isoenzymes Intérêts bio cliniques des isoenzymes
Exemple de la créatine kinase (CK) 3 isoenzymes : CK-BB, CK-MB et CK-MM Chaque isoenzyme, dimérique, est formée à partir de deux types de sous-unités M et B M : prédominant dans le muscle B : prédominant dans le cerveau (B = Brain) CK-BB, CK-MB et CK-MM sont séparables par électrophorèse CK-MB augmente au cours de l’infarctus du myocarde

58 X- Les macroenzymes Généralités : macroenzymes : formes inhabituelles
Complexes divers : - association enzymes et immunoglobulines - enzymes autoagrégées - association enzymes et lipoprotéines - enzymes de fragment membranaire circulant

59 X- Les macroenzymes Intérêts bio cliniques des macroenzymes Exemples :
Macroamylase : élévation dans affection pancréatique Macrocréatine kinases : macro CK de type 1 et macro CK de type 2

60 X- Les macroenzymes Valeur diagnostique des macrocréatines kinases
Élévation macro CK de type 1 : sans valeur diagnostique, faux positif au cours de l’infarctus du myocarde Élévation macro CK de type 2 :infarctus massif du myocarde (mauvais pronostic)

61 FIN