(maître de conférences)

(maître de conférences)
YVES MARKOWICZ (maître de conférences) Laboratoire Adaptation et Pathogénie des Micro-organismes (CNRS UMR 5163) Bâtiment J. Roget - 508F Domaine de la Merci La Tronche Tél. : Fax : Courriel : Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier
Quelques livres à la B.U. Microbiologie (Prescott et al.) Microbe (Schaechter et al.) Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

BIO241 METABOLISME : SPECIFICITES
Malgré son titre plus général (« Spécificités microbiennes »), ce cours ne traite uniquement que des spécificités bactériennes, parce que : les microbes eucaryotes ont des métabolismes de type eucaryotes (mitochondries, chloroplastes), déjà traités dans d’autres parties de cette UE les virus n’ont pas de métabolisme BACTERIENNES Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

METABOLISME : SPECIFICITES MICROBIENNES
LA MORALE DU COURS Comme les plantes, les bactéries sont capables de synthétiser tout ce qui est nécessaire à leur croissance à partir de nutriments plus ou moins complexes (prototrophie) Au sein de l’immense biodiversité des procaryotes, on trouve des bactéries capables d’utiliser n’importe quels aliments En dehors de ces considérations, et des notions déjà apprises précédemment (dans cette UE ou d’autres enseignements) telles que les règles de l’oxydo-réduction, vous n’aurez rien à apprendre par cœur pour ce cours… Par contre, il vous est demander de bien connaître les bases des différents types de métabolismes présentés (de comprendre mécanismes et réactions), afin de pouvoir analyser des résultats expérimentaux mettant en jeu tel ou tel métabolisme microbien ! La grande majorité des bactéries disposent de plusieurs catabolismes alternatifs : elles peuvent s’adapter à d’importants changements environnementaux Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

LES CYCLES BIOGEOCHIMIQUES Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

LES CYCLES BIOGEOCHIMIQUES
QUAND PLUSIEURS METABOLISMES CO-EXISTENT DANS UN ECOSYSTEME… Il existe des bactéries capables de transformer des molécules organiques en molécules inorganiques (respirations), ou des molécules inorganiques en molécules organiques. Et donc, les bactéries, à l’échelle de la planète (et si tant est que l’homme ne déséquilibre pas trop l’écosystème), vont pouvoir assurer l’équilibre entre les différentes formes des principaux atomes. On parle de cycles biogéochimiques. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CYCLE DE L’AZOTE Recherchez les différents métabolismes évoqués dans le cours : lithotrophie (nitrification) ; respiration (dénitrification, assimilation de l’azote). Notons que les animaux se limitent, eux, à la partie « azote organique » du cycle… Seule réaction non évoquée dans ce cours, la fixation de l’azote, c.a.d. la conversion de l’azote diatomique (N2, gazeux) en ammoniaque (réaction très coûteuse sur le plan énergétique), est le fait de plusieurs genres bactériens, grâce à une enzyme appelée nitrogénase. Il s’agit soit de fixateurs libres (Azotobacter, cyanobactéries), soit de fixateurs symbiotiques (Rhizobium, Frankia), qui ne pourront faire cette réaction qu’après avoir pénétré dans des racines de plantes au sein desquelles elles se différencieront et formeront des structures cellulaires particulières, les nodules (zones de prolifération bactérienne entourée d’une épaisse paroi synthétisée par la plante, qui nourrira les bactéries en échange de l’ammoniaque qu’elles lui fourniront, et leur apportera l’oxygène, indispensable à leur respiration, à petites doses, ce gaz étant un inhibiteur de la nitrogénase !). C’est cette fixation de l’azote qui est à l’origine de pratiques agricoles ancestrales telles que l’assolement triennal : un an de culture de céréales ; un an de repos sans culture ; un an de culture de trèfle ou de luzerne, plantes qui vont héberger des bactéries fixatrices d’azote au niveau de nodules racinaires, aboutissant ainsi à un enrichissement des sols en ammoniaque… des sols qui seront alors prêts pour recommencer une culture de céréales, par exemple. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CYCLE DU SOUFRE Là aussi, recherchez les différents métabolismes évoqués dans le cours : lithotrophie ; respiration. De nouveau , les animaux se contentent de la partie « soufre organique » du cycle… Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CYCLE DU CARBONE Enfin, jetons rapidement un coup d’œil sur le cycle du carbone : nous y retrouvons méthanogenèse et oxydation du méthane (méthylotrophes), fermentations et respirations… et découvrons le dernier métabolisme qu’il nous reste à étudier, à savoir la fixation du CO2, très souvent (mais pas exclusivement) couplée à l’utilisation d’une énergie lumineuse. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

LA COLONNE DE WINOGRADSKY
CATABOLISMES LA COLONNE DE WINOGRADSKY Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

LA COLONNE DE WINOGRADSKY
CATABOLISMES LA COLONNE DE WINOGRADSKY A consulter : Diagram of a Winogradsky Column illustrating how microorganisms distribute themselves in a column of water between aerobic and anaerobic environments. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

L’USINE MICROBIENNE Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

L’USINE MICROBIENNE LA PROBLEMATIQUE les participants : matériaux (nutriments, substrats) énergie (catabolisme) plan de fabrication (génome) la ligne de montage : approvisionnements catabolisme biosynthèses polymérisations assemblages Envisageons la bactérie comme une usine à faire de la biomasse. Comme toute usine, la bactérie, pour produire une nouvelle bactérie, a besoin de matériaux, d’énergie, et d’un plan de fabrication. La production de biomasse met en jeu une ligne de fabrication qui commence par l’arrivée de matériaux, ou nutriments (approvisionnement). Elle se continue par l’utilisation de ces matériaux pour obtenir les matières premières nécessaires à toutes les réactions biochimiques de la cellule (métabolites précurseurs et énergie), dans un processus appelé catabolisme. Ensuite s’enchaînent les biosynthèses (synthèses de « briques élémentaires » à partir des métabolites précurseurs précédemment fabriqués), puis les polymérisations (des différentes briques élémentaires) pour obtenir des macromolécules, qui seront finalement assemblées pour former une nouvelle cellule. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

LA LIGNE DE MONTAGE DEUX TYPES D’ENERGIE phosphorylation au niveau du substrat X~ P + ADP  X + ATP ATP NADPH + H+ (pouvoir réducteur)  (biosynthèses et) polymérisations  transports, assemblages  biosynthèses ADP + Pi ATP ATPase phosphorylation oxydative photophosphorylation On a trop souvent tendance à ne considérer que l’ATP quand on parle d’énergie. Or le NADPH + H+ joue un rôle primordial, essentiellement au niveau des biosynthèses ! Alors que le pouvoir réducteur est produit uniquement au niveau de réactions d’oxydation de métabolites (dont les électrons sont transférés sur le NADP+), l’ATP peut être fabriqué via deux types de réactions : phosphorylation au niveau du substrat, c.a.d. des réactions cytosoliques (par exemple, dans la glycolyse, le transfert du phosphate du PEP sur une molécule d’ADP, moyennant la synthèse de pyruvate) ; phosphorylation oxydative et photophosphorylation, c.a.d. mise en jeu d’une chaîne de transfert d’électrons membranaire (respiration ou photosynthèse) qui expulse des protons avant de les faire réintégrer la cellule via une ATPase, et moyennant la synthèse d’ATP. XH2 + NADP+  X + NADPH + H+ oxydations Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

LA LIGNE DE MONTAGE ATP ET NADPH + H+ molécules ATP / g cellules NADPH + H+ / g cellules Protéines 7.287 11.523 ARN 6.540 427 ADN 1.090 200 Lipides 2.578 5.270 Peptidoglycane 248 193 LPS 470 564 Glycogène 154 TOTAL 18.367 18.177 Pour fabriquer un gramme de cellules, on voit qu’il faut presque autant de NADPH + H+ que d’ATP… mais ces deux formes d’énergie ne sont pas toujours impliquées dans les mêmes synthèses (en rouge, la source d’énergie majoritairement utilisée pour synthétiser un type de métabolite donné) ! Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

LA LIGNE DE MONTAGE ATP ET NADPH + H+ molécules ATP / monomère NADPH + H+ / monomère Ala, Asp, Glu, Gln, Gly, Ser 1 Arg 7 4 Asn 3 Cys 5 His 6 Ile 2 Leu, Val Lys Met 8 Phe, Tyr Pro Thr Trp ATP (dATP) 11 1 (2) CTP (dCTP) 13 0 (1) GTP (dGTP) 9 UTP (dTTP) 7 (10,5) 1 (3) Acides gras – C16 14 La même chose mais en plus détaillé. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

DOUZE METABOLITES PRECURSEURS VIA LE METABOLISME CENTRAL
LA LIGNE DE MONTAGE LE CATABOLISME : DOUZE METABOLITES PRECURSEURS VIA LE METABOLISME CENTRAL 6 carbones : glucose ~ 6 P - fructose ~ 6 P a-cétoglutarate - pentose ~ 5 P 5 carbones : succinyl-coA - oxaloacétate érythrose ~ 4 P - 4 carbones : Pour fabriquer une cellule, hors atomes de soufre, azote, phosphore et oligo-éléments, il suffit de 12 métabolites carbonés, appelés « métabolites précurseurs ». Quel que soit son type métabolique, la cellule devra trouver un moyen de disposer de ces 12 molécules, soit en les trouvant dans son approvisionnement, soit en les fabriquant (catabolisme) ! Ces 12 molécules participent aux trois grands ensembles du métabolisme central : glycolyse (en bleu), voie des pentoses phosphate (en vert), cycle de l’acide citrique (en rose). Le fait même que ces métabolites soient pour partie utilisés pour des synthèses, c.a.d. pour autre chose que la réaction suivante dans le métabolisme central, doit nous faire prendre conscience du fait que ce métabolisme central « fuit » : une molécule de glucose ne pourra pas, in vivo, donner 6 molécules de CO2, puisque une partie du carbone partira dans la synthèse de ces 12 molécules. Le catabolisme est donc partiellement incomplet… trioses ~ P - phosphoénolpyruvate (PEP) - pyruvate 3 P ~ glycérate - 3 carbones : acétyl-coA 2 carbones : Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

METABOLITES PRECURSEURS
VOIE D’EMBDEN-MEYERHOF-PARNAS glucose glucose ~ 6 P ATP ADP fructose ~ 6 P fructose ~ 1,6 bis P ATP ADP trioses ~ P x 2 3 P ~ glycérate x 2 2 (NADH + H+) 2 NAD+ 2 ATP 2 ADP 2 Pi 2 PEP 2 H2O 2 pyruvate 2 ADP 2 ATP Révisons la voie EMP (glycolyse) : glucose + 2 ADP + 2 Pi + 2 NAD+ → 2 pyruvate + 2 ATP + 2 (NADH + H+) + 2 H2O 2 pyruvate + 2 coA-SH + 2 NAD+ → 2 acétyl-coA + 2 CO2 + 2 (NADH + H+) 2 coA-SH 2 CO2 2 acétyl-coA 2 NAD+ 2 (NADH + H+) Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

VOIE D’EMBDEN-MEYERHOF-PARNAS glucose glucose ~ 6 P ATP ADP fructose ~ 6 P fructose ~ 1,6 bis P ATP ADP 2 ATP investis, puis remboursés trioses ~ P x 2 3 P ~ glycérate x 2 2 (NADH + H+) 2 NAD+ 2 ATP 2 ADP 2 Pi 2 PEP 2 H2O 2 pyruvate 2 ADP 2 ATP On note qu’il est nécessaire de fournir de l’ATP au départ (perte d’énergie initiale)… mais, in fine, il y a plus d’ATP produit que d’ATP hydrolysé ! L’ATP initialement fourni est donc un investissement qui sera plus que largement remboursé. 2 coA-SH 2 CO2 2 acétyl-coA 2 NAD+ 2 (NADH + H+) Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

VOIE D’EMBDEN-MEYERHOF-PARNAS : BILAN Glucose + 2 (ADP + Pi) + 2 NAD+  2 pyruvate + 2 H2O + 2 ATP + 2 (NADH + H+) + 2 coA-SH + 2 NAD+  2 acétyl-coA + 2 CO2 + 2 (NADH + H+) Ce bilan est nécessaire à l’étudiant qui découvre la glycolyse, et doit commencer par en apprendre le déroulement… Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

VOIE D’EMBDEN-MEYERHOF-PARNAS : BILAN Glucose + 2 (ADP + Pi) + 4 NAD+ + 2 coA-SH  2 acétyl-coA + 2 CO2 + 2 H2O + 2 ATP + 4 (NADH + H+) Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

VOIE D’EMBDEN-MEYERHOF-PARNAS : PAS DE BILAN !!! Glucose + < 2 (ADP + Pi) + < 4 NAD+ + < 2 coA-SH  < 2 acétyl-coA + < 2 CO2 + < 2 H2O + < 2 ATP + < 4 (NADH + H+) trioses ~ P glucose ~ 6 P fructose ~ 6 P 3 P ~ glycérate + < 1 + < 1 PEP + < 1 pyruvate … mais la réalité du métabolisme est beaucoup plus complexe puisque, comme dit précédemment, une partie des molécules précurseurs va quitter le catabolisme pour alimenter les biosynthèses, et donc, un strict bilan quantitatif est impossible dans l’absolu (mais il existe des méthodes pour mesurer les flux de molécules, cf. diapositive 22) ! Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

VOIE DES PENTOSES PHOSPHATE 6 P ~ gluconate H2O NADP+ NADPH + H+ glucose glucose ~ 6 P ATP ADP ribulose ~ 5 P NADP+ NADPH + H+ CO2 3 P ~ glycéraldéhyde sédoheptulose ~ 5 P xylulose ~ 5 P érythrose ~ 4 P fructose ~ 6 P ribose ~ 5 P Révisons la voie des pentoses phosphate : branche oxydante : glucose + ATP + 2 NADP+ + H2O → ribulose-5-phosphate + CO2 + 2 (NADPH + H+) + ADP branche non oxydante : 3 ribulose-5-phosphate → 2 fructose-6-phosphate + 3-phoshoglycéraldéhyde fructose ~ 6 P 3 P ~ glycéraldéhyde Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

VOIE DES PENTOSES PHOSPHATE : BILAN 3 Glucose + 3 ATP + 6 NADP+ + 3 H2O  1 CO2 + 6 (NADPH + H+) + 3 ADP fructose ~ 6 P 3 P ~ glycéraldéhyde Ce bilan est nécessaire à l’étudiant qui découvre la voie des pentoses phosphate, et doit commencer par en apprendre le déroulement… (3 Glucose + 3 ATP + 6 NADP+ + 3 H2O → 3 ribulose-5-phosphate + 3 CO2 + 6 (NADPH + H+) + 3 ADP) (3 ribulose-5-phosphate → 2 fructose-6-phosphate + 3-phoshoglycéraldéhyde) Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

VOIE DES PENTOSES PHOSPHATE : PAS DE BILAN !!! 3 Glucose + 3 ATP + < 6 NADP+ + < 3 H2O  < 1 + < < 3 CO2 + < 6 (NADPH + H+) + 3 ADP fructose ~ 6 P 3 P ~ glycéraldéhyde … mais, là aussi, la réalité du métabolisme est beaucoup plus complexe, et une partie des molécules précurseurs va quitter le catabolisme pour alimenter les biosynthèses, rendant un strict bilan quantitatif impossible dans l’absolu (mais il existe des méthodes pour mesurer les flux de molécules, cf. diapositive 22) ! + < 1 érythrose ~ 4 P pentose ~ 5 P Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CYCLE DE L’ACIDE CITRIQUE acétyl-coA oxaloacétate citrate coA-SH + H+ H2O malate H2O NADH + H+ NAD+ isocitrate a-cétoglutarate CO2 NAD+ NADH fumarate FADH2 FAD succinate GDP GTP + Pi succinyl-coA CO2 coA-SH NAD+ NADH Révisons le cycle de l’acide citrique (ou cycle des acides tricarboxyliques, ou cycle de Krebs) : acétyl-coA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2 H2O → 2 CO2 + 2 (NADH +H+) + 1 NADH + FADH2 + GTP + coA-SH Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CYCLE DE L’ACIDE CITRIQUE : BILAN 2 acétyl-coA + 4 H2O + 2 (GDP + Pi) + 6 NAD+ + 2 FAD+  4 CO2 + 2 coA-SH + 2 GTP + 4 (NADH + H+) + 2 NADH + 2 (FADH + H+) Encore une fois, ce bilan est nécessaire à l’étudiant qui découvre le cycle de l’acide citrique, et doit commencer par en apprendre le déroulement… Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CYCLE DE L’ACIDE CITRIQUE : PAS DE BILAN !!! 2 acétyl-coA + < 4 H2O + < 2 (GDP + Pi) + < 6 NAD+ + < 2 FAD+  < 4 CO2 + < 2 coA-SH + < 2 GTP + < 4 (NADH + H+) + < 2 NADH + < 2 (FADH + H+) … et encore une fois, la réalité du métabolisme est beaucoup plus complexe, et une partie des molécules précurseurs va quitter le catabolisme pour alimenter les biosynthèses, rendant un strict bilan quantitatif impossible dans l’absolu (mais il existe des méthodes pour mesurer les flux de molécules, cf. diapositive 22) ! + < 1 a-cétoglutarate + < 1 succinyl-coA + < 1 oxaloacétate Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

MORALITE catabolisme et biosynthèses sont interconnectés, donc pas de bilans cataboliques (dans ce cours) la cellule n’est pas un tube à essai ! Et voila quelque chose qu’il faut savoir par cœur ! Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

… ET ON LE PROUVE ! 40 58 2 6 10 80 1 20 21 17 83 6 94 Glucose : 6 x 100 = 600 Glucose : 6 x 100 = 600 Pyruvate : 3 x 169 = 507 (84,5%) Pyruvate : 3 x 194 = 582 (97%) Deux exemples de mesure des flux de carbone dans le métabolisme central par RMN du 13C (chez la bactérie Corynebacterium glutamicum, producteur n°1 d’acides aminés dans l’industrie agro-alimentaire) : à gauche, dans des conditions « normales » (croissance exponentielle), on observe que, au niveau du fumarate, on a déjà « perdu » (dans des réactions de biosynthèse, bien sûr) un tiers des carbones (notez également la répartition des molécules de glucose-6-phosphate entre glycolyse et voie des pentoses phosphate, qui montrent que celle-ci est tout sauf une voie métabolique mineure) ! à droite, dans des conditions favorisant la production et l’excrétion du glutamate, on voit que les flux ont changé, la bactérie ayant adapté son métabolisme central à ses conditions environnementales (et à son nouvel « objectif métabolique », qui est d’excréter plus de 50% des carbones consommés sous forme de glutamate) ! 13C NMR studies of the fluxes in the central metabolism of Corynebacterium glutamicum during growth and overproduction of amino acids in batch cultures K. Sonntag, J. Schwinde, A.A. de Graaf, A. Marx, B.J. Eickmanns, W. Wiechert & H. Sahm Appl. Microbiol. Biotechnol. (1995) 44: Glutamate : Glutamate : 5 x 66 = 330 (55%) Fumarate : 4 x 100 = 400 (66,7%) Fumarate : 4 x 62 = 248 (41,3%) Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

« BRIQUES ELEMENTAIRES »
LA LIGNE DE MONTAGE LES BIOSYNTHESES : « BRIQUES ELEMENTAIRES » sucres (25) acides gras (8) acides aminés (20)  PEP, ,  acétyl-coA  PEP,  pyruvate, acétyl-coA  oxaloacétate, succinyl-coA  a-cétoglutarate   , , … trioses ~ P glucose ~ 6 P fructose ~ 6 P 3 P ~ glycérate érythrose ~ 4 P pentose ~ 5 P Et voilà à quoi servent les molécules précurseurs (pour votre culture, pas pour le savoir par cœur…) : PEP : biosynthèses du chorismate (précurseur des AA aromatiques, du folate, des quinones et de l’entérobactine), du KDO (constituant du LPS) et du N-acétyl-muramate (peptidoglycane) glucose-6-phosphate : biosynthèses du glycogène, du tréhalose et du glucose-1-phosphate (utilisé pour la synthèse de sucres nucléotides (précurseurs des exopolysaccharides) et du rhamnose) fructose-6-phosphate : biosynthèses de la N-acétyl-glucosamine (peptidoglycane) et des sucres nucléotide acétyl-coA : biosynthèses des acides gras, de certains AA (Arg, Cys, Leu) et de la N-acétyl-glucosamine (peptidoglycane) érythrose-4-phosphate : biosynthèses du chorismate et du pyridoxal-phosphate (co-enzyme) pyruvate : biosynthèses de certains AA (Ala, Ile, Lys, Val), de la thiamine, du pyridoxal-phosphate et des isoprénoïdes (précurseurs des quinones) oxaloacétate : biosynthèse de l’Asp (précurseur de l’Arg, l’Asn, la Lys, la Met et la Thr, des purines et des pyrimidines, du NAD et du panthoténate (lui-même utilisé pour la synthèse du coenzyme A)) succinyl-coA : biosynthèses de la Lys et de la Met a-cétoglutarate : biosynthèses du Glu (précurseur de l’Ala, l’Arg, l’Asp, la Gln, l’His, l’Ile, la Leu, la Lys, la Phe, la Pro et la Ser (elle-même à la base des synthèses de la Cys, la Gly, le Trp, la Tyr et la Val)), du folate, du pyridoxal-phosphate, du glutathion, de l’hème, des quinones et du D-Glutamate (constituant du peptidoglycane) 3-phosphoglycérate : biosynthèse de la Ser pentoses-5-phosphate : biosynthèses du KDO (LPS), de la riboflavine, du FMN et du FAD, des nucléotides et des ribonucléotides trioses-phosphate : biosynthèses des isoprénoïdes, du pyridoxal-phosphate, de la thiamine, du NAD et des phospholipides nucléotides (8) coenzymes, vitamines, … Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

LA LIGNE DE MONTAGE POLYMERISATIONS lipides = polymères d’acides gras LPS = sucres + acides gras peptidoglycane = sucres + acides aminés protéines = polymères d’acides aminés ADN, ARN = polymères de nucléotides glycogène = polymère de sucres … Quelques exemples de polymérisations (et de polymères de briques élémentaires) Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

LA LIGNE DE MONTAGE ASSEMBLAGES enveloppe = membrane plasmique [acides gras + protéines] + peptidoglycane (+ acides téichoïques) (+ membrane externe [acides gras + protéines + LPS]) flagelles et pili = « polymères » de protéines ribosomes = ARN + protéines nucléoïde = ADN (+ ARN) + protéines … Quelques exemples de structures cellulaires, fruits de l’assemblage de polymères variés Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

LA LIGNE DE MONTAGE Résumé de l’introduction du cours Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

APPROVISIONNEMENT Il s’agit ici d’une révision rapide de notions vues dans l’enseignement de biologie cellulaire Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

APPROVISIONNEMENT LES PROBLEMATIQUES les bactéries vivent généralement dans un environnement où les nutriments sont moins concentrés que dans le cytosol : COMMENT CROITRE EXPONENTIELLEMENT MALGRE LA CARENCE ? les molécules importées ne doivent pas pouvoir ressortir (avant d’avoir été métabolisées) les molécules autres que nutriments ne doivent pas pouvoir sortir (sauf excrétion ou sécrétion) ! la plupart des molécules ne peuvent pas transiter à travers la membrane plasmique Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

TRAVERSER LA MEMBRANE PLASMIQUE ?
APPROVISIONNEMENT TRAVERSER LA MEMBRANE PLASMIQUE ? Seules les petites molécules hydrophobes (O2, CO2, N2, benzène) et les molécules polaires non chargées (H2O, glycérol, éthanol) diffusent librement à travers la membrane plasmique (dans le sens du gradient de concentration, c.a.d. du milieu le plus concentré vers le milieu le plus dilué). Les autres molécules, ions (H+, Na+, HCO3-, K+, Ca2+, Cl-, Mg2+) et molécules polaires de grande taille (AA, glucose, nucléotides), ne peuvent pas traverser librement cette barrière : il faudra donc que la cellule mette en jeu des transporteurs membranaires (protéines). Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

MODES D’APPROVISIONNEMENT
DIFFERENTS MODES D’APPROVISIONNEMENT diffusion simple (passive) diffusion facilitée transports actifs v = f (DC, P, A) v = f (P,A) à faible DC v = f (P,A) Selon le type de transport, la vitesse de transport varie selon plusieurs facteurs : pour la diffusion simple, la vitesse de diffusion est fonction du gradient de concentration (plus celui-ci est fort, plus le transport est rapide) de la perméabilité spécifique de la membrane pour la molécule en question, et de l’aire mise en jeu, c.a.d. la surface membranaire (à ce sujet, si les bactéries sont petites et majoritairement cylindriques, c’est parce que cette géométrie offre le meilleur rapport surface/volume, donc l’aire maximale pour un volume donné !) ; dans le cas de la diffusion facilitée, on retrouve les mêmes facteurs à deux détails près, à savoir que ce transport a une efficacité améliorée par rapport au précédent dans le cas d’un faible gradient de concentration, et qu’il met en jeu des transporteurs, donc risque d’être saturé à fort gradient de concentration ; tous les autres, dits transports actifs, fonctionnent en dépit du gradient de concentration… et s’ils fonctionnent à contre-sens, cela se paie au niveau énergétique !  coût énergétique Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

APPROVISIONNEMENT DIFFUSION SIMPLE : GRATUIT… MAIS LIMITE ! Deux possibilités pour la diffusion simple : au niveau de la membrane plasmique, il s’agit du transit à travers la bicouche lipidique de gaz (O2, CO2, NH3), de molécules apolaires (dont des antibiotiques !), et, dans une moindre mesure, de l’eau ; au niveau de la membrane externe des bactéries à Gram-, on trouve une diffusion simple mettant en jeu les porines, pores protéiques qui laissent librement passer toutes les molécules polaires de PM ≤ 600 kDa (sucres ou oligosaccharides allant jusqu’à 4 sucres, AA ou oligomères d’AA allant jusqu’à 7 AA, …). Un cas particulier de diffusion simple est l’osmose : l’eau se dirige du milieu le plus concentré en eau (le plus dilué en métabolites) vers le milieu le plus dilué en eau (le plus concentré en métabolites). En temps normal, le cytosol étant très concentré, l’eau aura donc tendance à pénétrer dans les cellules : cette entrée, et l’augmentation de volume qui en découlerait, sera limitée par la présence au pourtour de la cellule d’une paroi rigide (sinon, la cellule gonflerait, gonflerait… et exploserait : choc osmotique). Mais, si on augmente la concentration en métabolites à l’extérieur de la cellule en ajoutant sels ou sucres, l’eau va alors fuir la cellule, dont le cytoplasme va se rétracter à l’intérieur de la paroi (la membrane plasmique n’est alors plus en contact total avec la paroi), et le cytosol est tellement concentré que les réactions biochimiques ne peuvent plus fonctionner, le métabolisme s’arrête : les cellules sont en plasmolyse (cas des microbes dans les salaisons ou les confitures… les cellules en plasmolyse ne prolifèrent pas !). Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

APPROVISIONNEMENT DIFFUSION SIMPLE : GRATUIT… MAIS LIMITE ! Le mécanisme de la diffusion simple est lié au mouvement brownien des molécules : plus le milieu est concentré, plus l’agitation moléculaire va générer de chocs entre molécules. Celles-ci vont donc naturellement avoir tendance à se répartir (statistiquement) de façon à limiter les chocs, c.a.d. aller vers des régions moins concentrées, jusqu’à équilibre des concentrations de part et d’autre de la membrane. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

GRATUIT ET (RELATIVEMENT) EFFICACE
APPROVISIONNEMENT DIFFUSION FACILITEE : GRATUIT ET (RELATIVEMENT) EFFICACE La diffusion facilitée est un cas de diffusion mettant en jeu des transporteurs qui fonctionnent en deux temps : capture de la molécule d’un côté de la membrane ; transfert de la molécule capturée de l’autre côté de la membrane. Le schéma donne une idée assez imagée de ce type de mécanisme. Plus la molécule à transférer est concentrée, plus elle a de chances d’entrer en contact avec le transporteur : le transport aura donc principalement lieu du milieu le plus concentré vers le milieu le moins concentré, comme dans la diffusion simple. Mais, ici, le transporteur permet d’accélérer le transport, et donc de l’optimiser pour de faibles gradients de concentration. Les transporteurs impliqués dans la diffusion facilitée sont appelés MIP (Major Intrinsic Proteins). Deux exemples sont bien connus : - GlpF, transporteur du glycérol (qui intégrera le catabolisme au niveau des trioses-phosphate de la glycolyse) - AqpZ, ou aquaporine, qui permet d’augmenter les transferts d’eau à travers la membrane (l’au ayant du mal à diffuser librement à travers la membrane plasmique, fortement hydrophobe) « The aquaporin Z channel protein (AqpZ) in E. coli can accommodate a flow of water at rates six times higher than GlpF, making it the prime subject for studying the selectivity of a high-conducting water channel » Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

GRATUIT ET (RELATIVEMENT) EFFICACE
APPROVISIONNEMENT DIFFUSION FACILITEE : GRATUIT ET (RELATIVEMENT) EFFICACE Le schéma montre clairement la différence d’efficacité, pour de faibles gradients de concentration, entre diffusion facilitée et diffusion simple : à faible C (gauche du graphe), la vitesse de transport est supérieure pour la diffusion facilitée (en rouge). Par contre, on voit que, au-dessus d’une certaine valeur de gradient de concentration, la vitesse du transport n’augment plus dans le cas de la diffusion facilitée (alors que, pour la diffusion simple, la relation entre vitesse de transport et gradient de concentration est linéaire). Ceci est dû à la saturation des transporteurs membranaires, qui « travaillent » tous à vitesse maximale, et ne peuvent pas aller plus vite. On peut ainsi mesurer la constante de perméabilité de la membrane pour le métabolite concerné, liée aux nombres de transporteurs présents dans la membrane et à leur vitesse de transfert. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

LE GRADIENT DE CONCENTRATION
APPROVISIONNEMENT TRANSPORTS ACTIFS : « PAYER » POUR CONTRER LE GRADIENT DE CONCENTRATION Les transports actifs permettent de faire rentrer des molécules contre un gradient de concentration défavorable à l’import. Ils mettent en jeu des transporteurs protéiques de spécificité plus ou moins restreinte, appelés perméases. On note que, généralement, la concentration en AA est 100 fois plus élevée dans la cellule qu’à l’extérieure, celle en galactose 105 fois plus élevée, et celle en K+ 106 fois plus élevée ! Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

UNIPORTS - SYMPORTS - ANTIPORTS : ENERGIE = PROTONS (OU ION SODIUM)
TRANSPORTS ACTIFS UNIPORTS - SYMPORTS - ANTIPORTS : ENERGIE = PROTONS (OU ION SODIUM) Premier type de transports actifs, les transports mettant en jeu des MFS (Major Facilitator Superfamily) impliquent une transduction de l’énergie libre stockée sous forme de gradient électrochimiques (gradient de protons). On dénombre trois types de transports : uniport, dans lequel une seule molécule sera transportée (ex : YnfJ = uniport du Cl- ; KcsA = import du K+) symport, dans lequel deux molécules sont transportées simultanément, et dans le même sens (ex : LacY = symport H+/lactose ; MelB = symport Na+/mélibiose ; DctA = symport Na+/succinate ou fumarate ou malate ; EriC = symport H+/Cl-). antiport, dans lequel deux molécules sont transportées simultanément, mais en sens opposés (ex : NhaA = antiport Na+/H+) Ces transports peuvent être électrogènes ou neutres, selon qu’ils vont modifier ou non la différence de charge électrique de part et d’autre de la membrane (le gradient de proton ayant permis la mise en place préalable d’une différence de potentiel entre extérieur et intérieur de la cellule). Ainsi, les uniports du Cl- ou du K+ ou les symports mettant en jeu un sucre et un anion sont électrogènes, alors que les symports mettant en jeu deux charges électriques opposées (H+/Cl-) ou les antiports mettant en jeu deux charges électriques identiques (Na+/H+) sont neutres. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

TRANSPORTS ACTIFS UNIPORTS - SYMPORTS - ANTIPORTS : ENERGIE = PROTONS (OU ION SODIUM) On voit ici que le fonctionnement d’un antiport saccharose/H+ dépend du fonctionnement préalable d’un uniport qui excrète des protons. Cette sortie de protons peut résulter de deux types de transports : excrétion des protons au cours du transfert d’électrons à travers la chaîne de transporteurs d’électrons membranaires mise enjeu dans la respiration (ou la photosynthèse) (cf. diapositive 70) ; excrétion des protons par une ATPase membranaire, moyennant hydrolyse d’une molécule d’ATP pour 3 protons expulsés (c’est d’ailleurs cette fonction qui a donné son nom à l’ATPase, enzyme également connue pour effectuer la réaction inverse, à savoir la synthèse d’ATP moyennant l’entrée dans la cellule de protons !). On parle parfois de transports primaires et secondaires. Les transports primaires sont ceux qui mettent en jeu les protons, ou le gradient de proton ; les transports secondaires, eux, mettent en jeu un autre anion (Na+), dont l’excrétion résulte du fonctionnement de l’antiport H+/Na+, lui-même lié à l’existence préalable d’un gradient de protons (d’où le terme « secondaire »). Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

TRANSPORTS ACTIFS UNIPORTS - SYMPORTS - ANTIPORTS : ENERGIE = PROTONS (OU ION SODIUM) Une autre façon de se rappeler de l’origine du gradient de protons (à gauche du schéma). Au passage, on voit que l’énergie mise en jeu peut être de deux types : l’hydrolyse d’ATP ; la non production d’ATP, suite à l’utilisation à des fins de transport des protons excrétés par la chaîne respiratoire, protons qui ne serviront alors pas à synthétiser de l’ATP en rentrant dans la cellule via l’ATPase (et, si un manque à gagner n’est pas à proprement parler une dépense, il s’agit bien, à l’heure du bilan, d’une perte sèche !). Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

TRANSPORTS ACTIFS TRANSPORTEURS ABC : ENERGIE = ATP Deuxième famille de transports actifs, existant uniquement chez les bactéries à Gram-, les transports ABC mettent en jeu, comme leur surnom l’indique, trois dispositifs : un transporteur périplasmique, appelé protéine affine, qui va « récupérer » le métabolite à son entrée dans le périplasme (dans lequel le métabolite a pénétré passivement, via une porine) ; un transporteur membranaire, constitué de deux protéines, qui va transloquer le métabolite à travers la membrane plasmique, vers l’intérieur de la cellule, moyennant apport d’énergie ; une ATPase, qui va fournir l’énergie nécessaire à la translocation du métabolite vers l’intérieur de la cellule. Ainsi, dans le cas du maltose, interviennent successivement la protéine affine MalE, le transporteur membranaire MalFG et l’ATPase MalK (auxquels s’ajoutent une porine spécifique, appelée MalB). Ici, contrairement au cas précédent, l’énergie mise en jeu est uniquement l’hydrolyse d’ATP. Phénomène particulièrement intéressant dans ce type de transport, le fait que le métabolite soit lié à une protéine affine dans le périplasme aboutit à annuler la concentration en métabolite libre dans le périplasme, et donc à orienter obligatoirement la diffusion à travers la porine de l’extérieur de la cellule vers le périplasme ! Ce type de transport est également appelé « transport sensible au choc osmotique » : suite à un choc osmotique froid (4°C, saccharose), la rupture de la membrane externe entraîne la dilution dans l’environnement des protéines affines, et donc la perte de fonctionnement de ces transports. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

TRANSPORTS ACTIFS TRANSPORTEURS ABC : ENERGIE = ATP Une autre vision du transport, qui intègre la porine. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

TRANSLOCATIONS DE GROUPES : COUTEUX… MAIS GRATUITS !
TRANSPORTS ACTIFS TRANSLOCATIONS DE GROUPES : COUTEUX… MAIS GRATUITS ! Dernière famille de transports actifs, les translocations de groupes offrent l’avantage de coûts de transports qui ne sont qu’apparents. En effet, il s’agit ici d’utiliser une énergie qui, de toutes façons, aurait été utilisée au cours du catabolisme de la molécule importée. Ainsi, le glucose entre sous la forme de glucose-6-phosphate, premier intermédiaire de la glycolyse (un glucose intracellulaire devrait de toutes façons être phosphorylé pouvoir être métabolisé). Et donc, le fait d’utiliser pour le transport une énergie qui n’est qu’une avance sur une dépense inéluctable permet in fine d’annuler le coût du transport : un transport actif gratuit !!! Deux types de modifications chimiques du substrat existent dans ce type de transport : phosphorylation (donneur de phosphate = PEP), le transport étant appelé PTS (Phosphoenolpyruvate Transfer System) ; acétylation (donneur d’acétyl = acétyl-coA), mise en jeu dans l’import d’acides gras (sous la forme d’acyl-AG). L’exemple illustré par la figure est celui du PTS, responsable de l’import de glucose chez Escherichia coli. Il met en jeu 4 protéines, dont deux (EI et HPr) sont communes à plusieurs imports de sucres différents (cf. diapositive suivante), et deux (EII et EIII) spécifiques du glucose. Le fait que, dans la chaîne métabolique, EIII se situe en amont d’EII s’explique par le fait qu’ EIII n’existe pas pour tous les sucres, alors qu’ EII oui (il s’agit du transporteur membranaire, toutes les autres protéines étant cytosoliques)… Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

TRANSLOCATIONS DE GROUPES : COUTEUX… MAIS GRATUITS !
TRANSPORTS ACTIFS TRANSLOCATIONS DE GROUPES : COUTEUX… MAIS GRATUITS ! Comme indiqué précédemment, le coupe EI/HPr alimente en phosphate plusieurs transporteurs : le couple EIIGlc/EIIIGlc, précédemment décrit ; le couple EIIMan/EIIIMan, responsable de l’import de mannose et de fructose ; EIIMnt, responsable de l’import de mannitol (et de glucitol). Informations complémentaires sur l’import de glucose via le PTS : EI (PtsI) est un homodimère (monomère de 58 kDa), présent en copies/cellule ; HPr (PtsH) est un monomère (PtsH) présent en copies/cellules ; EII peut faire entrer non seulement le glucose mais aussi glucosamine et 2-désoxyglucose. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

VOIE EMP ET PTS !!! glucose pyruvate glucose ~ 6 P fructose ~ 6 P fructose ~ 1,6 bis P ATP ADP trioses ~ P x 2 PEP 2 H2O 2 coA-SH 2 CO2 2 acétyl-coA 2 NAD+ 2 (NADH + H+) 3 P ~ glycérate x 2 2 (NADH + H+) 2 NAD+ 2 ATP 2 ADP 2 Pi pyruvate ADP ATP Nous venons de voir que, lors de la consommation de glucose extracellulaire, le phosphate du glucose-6-phosphate ne provenait pas de l’hydrolyse d’une molécule d’ATP mais d’une molécule de PEP… intégrons cela dans la glycolyse !? La cellule utilise donc un ATP de moins… mais produit un ATP de moins, puisque seule une des deux molécules de PEP donnera naissance à de l’ATP en produisant du pyruvate, l’autre fournissant son phosphate au glucose lors de sa conversion en pyruvate. Attention : ce schéma plus compliqué que celui que vous connaissiez jusqu’à présent ne s’applique que dans le cas de la consommation de glucose extracellulaire ; dans le cas de la consommation de glucose intracellulaire (issu de l’hydrolyse partielle du glycogène), il y aura bien hydrolyse d’ATP pour phosphoryler le glucose (mais cela passera par la formation de glucose-1-phosphate, transformé ensuite en glucose-6-hosphate; cf. diapositive 51). Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

DES MODES D’APPROVISIONNEMENT DESTINEES A ETRE CATABOLISEES
ADAPTES AUX MOLECULES DESTINEES A ETRE CATABOLISEES un même sucre n’est pas transporté de la même façon par toutes les bactéries exemple : E. coli Lactobacillus lactose symport PTS glucose PTS transport actif Bien évidemment, les bactéries essaient d’utiliser, pour leurs métabolites « préférés », les transports les moins coûteux… Ainsi, alors qu’Escherichia coli fait entrer le lactose par un transport actif (coûteux) et le glucose par le PTS (gratuit), Lactobacillus, qu‘on retrouve dans le lait, et qui utilisera donc préférentiellement le lactose, fait rentrer le lactose via un PTS (entrée de lactose-phosphate), et le glucose via un transport actif. Ajoutons que (mais ceci concerne le cours de génétique), quand il s’agit de transporter un métabolite rare, la bactérie fait généralement l’économie de la synthèse des protéines impliquées ans ce transport, sauf si le métabolite est présent. On parle alors d’induction par le substrat, comme dans le cas de l’opéron lactose chez Escherichia coli (la bactérie ne fabrique transporteur du lactose et enzyme responsable du catabolisme du lactose que si le milieu environnant contient du lactose). les métabolites préférentiels sont importés via les transports les moins coûteux les métabolites rares sont importés (et catabolisés) via des systèmes inductibles Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CATABOLISMES Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CATABOLISMES PROTOTROPHES VS. AUXOTROPHES prototrophes : poussent sur milieu minimum (synthétisent AA, bases azotées, vitamines) auxotrophes : ne poussent pas sur milieu minimum quelle que soit la source de carbone (problème de biosynthèse) On commence par quelques définitions… à savoir par cœur ! Au vu de la définition, nous pouvons dire que, au contraire des plantes et de la majorité des bactéries, l’homme n’est pas prototrophe (il a besoin de vitamines (amines vitales) et de certains AA, dits essentiels, apportés par l’alimentation)? Attention, il existe des bactéries qui ne sont pas prototrophes, qu’il s’agisse de mutants issus de parents prototrophes ou d’isolats naturels (souches, voire espèces, comme Leuconostoc mesenteroides, la bactérie impliquée dans la fabrication de choucroute à partir du chou). Les deux types d’auxotrophies impliquent deux comportements différents si l’on veut tout de même cultiver les bactéries en question sur milieu minimum : un auxotrophe « vrai », c.a.d. incapable de synthétiser un AA, une vitamine ou une base azotée (ou plusieurs de ces molécules, auquel cas on parle de polyauxotrophe) ne poussera sur milieu minimum que si on y rajouter la (les) molécule(s) qu’il ne sait pas biosynthétiser (on parle de supplémentation du milieu) ; un auxotrophe pour un catabolisme poussera sur milieu minimum sans qu’on y rajoute rien, mais à condition de remplacer la source de carbone non métabolisable par une source de carbone métabolisable ! sauf si on leur donne une source de carbone appropriée (problème de catabolisme) Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

UNE DIVERSITE CATABOLIQUE TRES SUPERIEURE A CELLE
CATABOLISMES UNE DIVERSITE CATABOLIQUE TRES SUPERIEURE A CELLE DU REGNE EUCARYOTE diversité des sources de carbone diversité des sources d’énergie diversité des sources d’électrons TYPES TROPHIQUES diversité des comportements vis-à-vis de l’oxygène Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CATABOLISMES TYPES TROPHIQUES autotrophes CO2 source de carbone : source d’énergie : source d’électrons : hétérotrophes autre(s) que CO2 (différents niveaux rédox) phototrophes lumière (photosynthèses) chimiotrophes oxydation de composés organiques / inorganiques Les autotrophes peuvent utiliser CO2, forme la plus oxydée du carbone, pour synthétiser toutes les molécules carbonées dont ils ont besoin, à commencer par les 12 molécules précurseurs. La réduction du CO2, qui n’est pas exclusive (ces organismes peuvent utiliser d’autres sources de carbone) nécessite bien évidemment de disposer d’énergie et d’électrons… Les hétérotrophes, eux, utilisent des formes plus ou moins réduites (oxydées) du carbone, qu’ils vont donc pouvoir oxyder ou réduire, selon les besoins, ces sources de carbone pouvant jouer à la fois le rôle de substrat catabolique (donc source éventuelle d’énergie ou d’électrons) ou de base pour les biosynthèses. Les phototrophes captent l’énergie lumineuse, qu’ils convertissent ensuite en énergie chimique, utilisée dans les différentes réactions métaboliques. On parle de photosynthèses au pluriel car il existe plusieurs types de photosynthèses sur terre : la photosynthèse oxygénique des plantes et des cyanobactéries (l’oxygène est produit via la photolyse de l’eau, qui génère également les électrons) ; les photosynthèses anoxygéniques des bactéries, qui ne produisent pas d’oxygène, et mettent en jeu un seul photosystème, voire pas de photosystème dans le cas de la synthèse d’ATP en réponse à une illumination chez les halobactéries (diapositive 130). Les chimiotrophes, eux, utilisent, pour produire leur énergie, l’oxydation de molécules organiques ou inorganiques. Les lithotrophes trouvent leurs électrons dans l’oxydation de molécules inorganiques : H2O, H2S, Fe2+, NO3-, NO2-, H2, … Les organotrophes trouvent, eux, leurs électrons dans les molécules organiques qu’ils réduisent… molécules qui vont souvent (mais pas exclusivement) leur servir également de sources d’énergie et de carbone. lithotrophes molécules inorganiques (réduites) organotrophes molécules organiques (réduites) Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

5 TYPES NUTRITIONNELS MAJEURS
TYPES TROPHIQUES 5 TYPES NUTRITIONNELS MAJEURS photo-lithotrophes autotrophes cyanobactéries, bactéries sulfureuses pourpres et vertes chimio-organotrophes hétérotrophes flores animales, pathogènes, ... photo-organotrophes hétérotrophes bactéries non sulfureuses pourpres et vertes Maintenant que vous connaissez les types trophiques, nous pouvons les manipuler pour caractériser les 5 groupes nutritionnels majeurs à la surface de la planète. Les photo-lithotrophes autotrophes utilisent l’énergie lumineuse, des électrons inorganiques, et sont capables d’utiliser CO2 comme source de carbone. Outre les bactéries indiquées, on trouve dans cette catégorie les plantes, qui utilisent l’énergie lumineuse (convertie en énergie chimique) et les électrons issus de l’eau pour réduire CO2. Notons qu’on trouve aussi, dans cette catégorie les bactéries sulfureuses (pourpres et vertes), qui font une photosynthèse anoxygénique. Les chimio-organotrophes hétérotrophes utilisent les molécules organiques comme sources d’énergie, d’électrons et de carbone. Cette catégorie correspond également aux animaux, dont les flores et pathogènes ont adopté les « mœurs »… Les photo-organotrophes hétérotrophes utilisent l’énergie lumineuse mais cette photosynthèse n’aboutit pas à la fixation du CO2, puisque ces bactéries ne peuvent pas l’utiliser : elles utilisent des molécules carbonées comme sources de carbone et d’électrons. Les chimo-lithotrophes autotrophes sont, au contraire, des bactéries capables de fixer le CO2, c.a.d. de le réduire en lui transférant des électrons (ici d’origine inorganique), mais qui utilisent pour cela une énergie chimique, liée à l’oxydation de nutriments variés. Ces bactéries ont des rôles majeurs dans de nombreux écosystèmes, en particulier les sols. A l’inverse des précédents, les chimo-lithotrophes hétérotrophes ne peuvent pas utiliser CO2 comme source de carbone, mais sont bien capables d’utiliser des électrons d’origine inorganique. chimio-lithotrophes autotrophes bactéries oxydant le soufre, l’hydrogène ou le fer, bactéries nitrifiantes chimio-lithotrophes hétérotrophes Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

Y’A PAS QUE LE GLUCOSE DANS LA VIE !
HETEROTROPHES Y’A PAS QUE LE GLUCOSE DANS LA VIE ! d’autres sucres réserves intra-cellulaires sucres simples disaccharides polysaccharides protéines et acides aminés A vrai dire, il y même surtout autre chose que le glucose dans la vie… avez-vous pensé à ce que votre organisme comme diversité nutritive aux bactéries de vos flores digestive ou buccale ? Et je ne vous parle pas (encore) des bactéries des sols ou des eaux, capables de « manger » tout et n’importe quoi… Attention, une même bactérie ne mange pas tout, bien évidemment. Certaines ont des capacités métaboliques étendues (on parle de « super chimistes », comme les genres Ralstonia, Comamonas ou Burkholderia), d’autres, au contraire, sont assez sélectives en matière de nutriment. Ce qui va suivre concerne donc le monde microbien, mais en aucun cas un seul genre bactérien !!! Remarque : non seulement nous allons regarder ce que les bactéries mangent, mais, en bon biochimistes, nous allons aussi nous poser la question d’où elles injectent ces nutriments dans leur métabolisme… sachant que, selon les cas, elles vont peut-être devoir remonter certaines voies métaboliques à contre-courant pour pouvoir synthétiser certains métabolites précurseurs théoriquement situés en amont de ces nutriments dans le catabolisme !!! lipides et acides gras acides organiques, alcools, hydrocarbures aliphatiques, composés aromatiques, ... Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

HETEROTROPHES LES REGLES DU JEU quelle que soit la source de carbone, elle devra servir de précurseur pour la fabrication des 12 métabolistes précurseurs selon le nombre de carbones du métabolite, ceux-ci seront injectés plus ou moins haut dans le métabolisme central tout en haut, pas de problème plus bas… il va falloir renvoyer des carbones en sens inverse ! si le métabolite est trop gros pour rentrer dans la cellule, il faudra le découper à l’extérieur enzymes extracellulaires Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

HETEROTROPHES CE QUE JE VOUS DEMANDE être capable de proposer un site d’injection dans le métabolisme central pour les carbones en fonction du métabolite consommé se rappeler que les réactions peuvent aller dans les deux sens réactions réversibles réactions inverses avoir en tête que tout métabolite carboné est (théoriquement) consommable par une bactérie à la surface de la planète ne pas connaître les réactions par coeur !!!!! Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

SOURCES DE CARBONE D’AUTRES SUCRES... réserves intra-cellulaires : glycogène Glcn + Pi  Glcn-1 + Glc ~ 1 P poly-b-hydroxybutyrate (PHB) HBn + 2 coA-SH  HBn acétyl-coA sucres simples fructose fructose Fru + Pi  Fru ~ 6 P Gal + ATP  Gal ~ P + ADP galactose (épimérisation) On connaît essentiellement deux formes de stockage intracellulaire de carbone (au lieu de « faire du gras », comme certains d’entre nous, les bactéries stockent leur carbone sous forme de sucres) : le glycogène (comme chez les animaux) ; le polyhydroxybutyrate, très fréquemment trouvé chez certaines bactéries des sols (bactéries aérobie strictes, comme Pseudomonas). Le glycogène donne du glucose-1-phosphate, moyennant la consommation d’ATP, qui sera ensuite conservé en glucose-6-phosphate,injecté au niveau de la voie EMP. Le PHB (rappelez vous : butanol = 4 carbones !) donnera, moyennant consommation de 2 molécules de coenzyme A, de l’acétyl-coA qui sera injecté au niveau du cycle de l’acide citrique. Si le fructose, une fois phosphorylé, est directement injecté dans la glycolyse (qu’il remontera pour partie pour donner du glucose-6-phosphate, la majorité du sucre continuant dans le sens normal du catabolisme), le catabolisme du galactose et de l’acide galacturonique est, lui, plus complexe. Il mobilise une voie appelée voie de Leloir, qui consiste à transformer le sucre phosphorylé en UDP-sucre (moyennant la consommation d’une molécule d’UTP), qui sera ensuite épimérisé en UDP-glucose, lui-même transformé en glucose-1-phosphate… la suite de l’histoire, vous la connaissez déjà ! Ainsi, là où,pour le glucose, on utilise une molécule d’ATP, il aura fallu, pour consommer une molécule de galactose, dépenser une molécule d’ATP et une molécule d’UTP (Gal + ATP + UTP + Pi Glc-1phosphate + ADP + UDP + PPi). Notons que cette voie de Leloir est également utilisée pour la synthèse des exopolysaccharides pariétaux des bactéries (sucres constituant la paroi), les polymérisations de sucres nécessitant que les sucres soient préalablement activés par l’ajout d’UDP, qui fournira l’énergie nécessaire à ces polymérisations.  Gal ~ P + UTP  UDP-Gal + PPi  UDP-Gal  UDP-Glc  UDP-Glc + Pi  Glc ~ 1 P + UDP galacturonate (épimérisation) galacturonate  galacturonate ~ P  UDP- galacturonate  UDP-Glc  Glc ~ 1 P Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

... ET ENCORE D’AUTRES SUCRES
SOURCES DE CARBONE ... ET ENCORE D’AUTRES SUCRES disaccharides : saccharose lactose maltose cellobiose Sac + H2O  Glc + Fru / Sac + Pi  Glc ~ 1 P + Fru Lac + H2O  Glc + Gal Mal + H2O  2 Glc / Mal + Pi  Glc + Glc ~ 1 P Cel + Pi  Glc + Glc ~ 1 P polysaccharides : amidon glycogène cellulose pectine Glcn    Mal (+ maltodextrines) amylases Glcn    Cel cellulases galacturonaten    galactose pectinases Il ne s’agit ici que de quelques possibilités de catabolismes. Ainsi, pour le lactose, on connaît d’autres solutions (chez certaines bactéries lactiques, le lactose entre sous forme lactose-phosphate, qui est clivé en glucose + galactose-6-phosphate, le glucose étant ensuite injecté dans la glycolyse alors que le galactose suit une voie équivalent, appelée voie du tagatose (le tagatose étant au galactose ce que le fructose est au glucose)). Au passage, vous en profiterez pour réviser vos connaissances sur la nature des disaccharides et de quelques polysaccharides connus. Les polysaccharides, contrairement aux disaccharides et aux petits oligosaccharides tels que les maltodextrines (enchaînements de glucose d’au plus 7 maillons), ne passent pas à travers les porines des bactéries à Gram-. Aussi les bactéries sécrètent-elles des enzymes spécialisées dans la dégradation de ces polymères (amylases, cellulases, polygalacturonases), qui commenceront le travail à l’extérieur des cellules, en produisant des molécules de taille suffisamment petite pour passer à travers les porines, puis être importées dans les cellules où la suite du catabolisme se produira comme indiqué plus haut. galacturonaten    galacturonate ~ 1 P Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

PROTEINES ET ACIDES AMINES
SOURCES DE CARBONE PROTEINES ET ACIDES AMINES protéines  acides aminés protéases acides aminés : transaminations : AA1 + a-cétoacide2  a-cétoacide1 + AA2 Asp + a-cétoglutarate  Glu + oxaloacétate Val + pyruvate  Ala + 2-cétoisovalérate désaminations : AA  a-cétoacide + NH3 Ser  pyruvate + NH3 Thr  2-cétobutyrate + NH3 Asp  fumarate + NH3 Comme pour les polysaccharides et (diapositive suivante) les lipides, la première étape de l’hydrolyse des protéines autres qu’intracellulaires se déroule à l’extérieur de la cellule, et implique la sécrétion préalable d’enzymes, dans ce cas-ci des protéases. Celles-ci libéreront des acides aminés, voire des dipeptides, qui seront importés dans la cellule pour y être catabolisés. Une fois dans la cellule, les acides aminés peuvent subir trois types de transformations : transfert de leur amine sur un autre acide (transamination) ; élimination de leur amine (désamination) ; oxydation plus ou moins complète (avec production éventuelle de NADH + H+). Comme vous pouvez le constater, les acides produits sont des métabolites situés soit dans le cycle de l’acide citrique, soit en sortie de glycolyse : il faudra donc que la bactérie redirige une partie de ces métabolites en sens contraire au catabolisme afin de produire tous les métabolites précurseurs dont elle a besoin ! Ceci se fait soit grâce à l’action des enzymes de la glycolyse, quand celles-ci sont capables d’effectuer des réactions réversibles, soit grâce à des enzymes capables d’effectuer les réactions inverses de celles de leur homologues de la glycolyse. Le pyruvate est produit via le catabolisme de l’alanine, de la glycine, de la sérine, de la cystéine et de la thréonine ; l’oxaloacétate résulte du catabolisme de l’asparagine et de l’aspartate ; l’-cétoglutarate est produit à partir du catabolisme du glutamate, de la glutamine, de l’histidine, de la proline et de l’arginine ; tyrosine, phénylalanine et aspartate généreront du fumarate, alors que méthionine, isoleucine, valine et thréonine généreront du succinyl-coA ; enfin, isoleucine, leucine et tryptophane donneront de l’acétyl-coA, et leucine, lysine, phénylalanine, tyrosine et tryptophane de l’acétoacétyl-coA (qui sera ensuite converti en acétyl-coA). oxydations : AA + ½ O2  a-cétoacide + NH3 AA + NAD+ + H2O  a-cétoacide + NADH +H+ + NH4+ Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

SOURCES DE CARBONE LIPIDES ET ACIDES GRAS lipides : triglycérides  glycérol lipases triacylglycérols  glycérol + acides gras lipases : b-oxydation acyln + coA-SH  acyln-coA (au cours du transport) acyln-coA + coA-SH + H2O + FAD + NAD+ acides gras  acyln-2-coA + acétyl-coA + FADH2 + NADH + H+ Ici, les enzymes excrétées sont des lipases. Elles généreront des acides gras, importés via un système de translocation de groupe impliquant leur acylation. Le catabolisme des acides gras met en jeu une réaction de dégradation itérative appelée -oxydation : à chaque tour, deux carbones sont retirés de l’acide gras sous forme d’acétyl-coA, jusqu’à ne plus obtenir que deux molécules d’acétyl-coA (à l’inverse, la synthèse des acides gras se fait par ajouts séquentiels de molécules d’acétyl, dans une réaction appelée hélice de Linen, qui ne génère donc que des molécules avec un nombre pair de carbones). Si ce catabolisme ne produit pas d’ATP, il est par contre une bonne source de coenzymes réduits (rappelons que la synthèse des acides gras consomme deux fois plus de NADPH + H+ que d’ATP). Restera ensuite à fabriquer les métabolites précurseurs situés en amont de l’acétyl-coA… Le catabolisme du glycérol, lui, produira l’un des deux trioses-phosphate, le DHAP, injecté dans la glycolyse en aval du fructose-1,6-bisphosphate. glycérol glycérol + ATP + NAD+  dihydroxyacétone ~ P + ADP + NADH + H+ Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

BETA - OXYDATION Ici, il s’agit de la dégradation d’acides gras intracellulaires, qui nécessite également une acylation préalable de l’acide gras, réaction qui consommera de l’ATP. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

SOURCES DE CARBONE ET ENCORE… acides organiques acétate + coA-SH + ATP  acétyl-coA + AMP + PPi propionate + coA-SH + ATP  propionyl-coA + AMP + Ppi  propionyl-coA + H2O    pyruvate + coA-SH  propionyl-coA + CO2 + ATP    succinyl-coA 2 lactate  propionate + acétate / lactate + acétate  butyrate + CO2  propionate + 3 H2O  acétate + CO2 + 3 H2 + H+  butyrate + 2 H2O  2 acétate + 2 H2 + H+ Les acides organiques, produits par fermentation (cf. infra), peuvent servir de source de carbone à certaines bactéries, à commencer par l’acide acétique, c.a.d. le vinaigre. On retrouve, comme pour les autres acides (acides aminés, acides gras), des produits de dégradation qui seront injectés dans le cycle de l’acide citrique, ou en sortie de glycolyse, avec les conséquences que cela aura sur la production de métabolites précurseurs... Puisque nous avons parlé de vinaigre, rappelons nous qu’il est le résultat de l’action de bactéries sur l’alcool : comme le montre la réaction (qui implique le coenzyme PQQ), il s’agit d’une oxydation en deux temps, qui aboutit à la production d’acide acétique et d’électrons. L’acétate sera ensuite transformé en acétyl-coA, injecté dans le cycle de l’acide citrique : l’éthanol est donc bien une source de carbone pour la bactérie. éthanol Gluconobacter, Acetobacter éthanol + PQQ  acétaldéhyde + PQQ-H2  acétaldéhyde + PQQ + H2O  acétate + PQQ-H2 Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

SOURCES DE CARBONE … MAIS AUSSI... méthanol et méthane méthylotrophes CH4 + NADH + H+ + O2  CH3OH + NAD+ + H2O méthanol + PQQ  CH2O + PQQ-H2  CH2O + NAD+ + H2O  HCOOH (formate) + NADH + H+  formate + NAD+  CO2 + NADH + H+ hydrocarbures aliphatiques XXX-CH3 + O2 + AH2  XXX-CH2OH + H2O + A  XXX-CH2OH + NAD+  XXX-CHO + NADH + H+  XXX-CHO + H2O + NAD+  XXX-COOH + NADH + H+  XXX-COOH  b-oxydation... Encore plus fort : les produits et sous-produits de la pétrochimie peuvent servir de sources de carbone ! Les bactéries méthylotrophes (genres Methylococcus et Methylomonas) oxydent méthane et méthanol : non seulement elles en tirent les électrons nécessaires à leur métabolisme énergétique, mais elles utilisent le formaldéhyde produit comme base de la synthèse de molécules à 2, 3, … carbones, selon deux voies différentes, l’une conduisant à la formation de sérine, l’autre à celle de sucres (fructose-6-phosphate, ribulose-5-phosphate). Une entreprise norvégienne, Norferm,a mis en place des cultures à grandes échelles de bactéries méthylotrophes, utilisant comme nutriment le méthane et le méthanol des plate-forme pétrolières off-shore de ce pays, bactéries qui sont commercialisées comme aliment protéique pour les animaux (on parle de SCP = Single Cell Protein) sous la marque Bioprotein. D’autres bactéries, dont plusieurs des genres Nocardia et Mycobacterium (le même genre que le bacille de Koch, sachant que toutes ne sont pas pathogènes), sont même capables de dégrader les hydrocarbures, c.a.d. le pétrole. Ce processus métabolique, certes lent, est utilisé pour le traitement de pollutions pétrolières, en particulier des marées noires. Il s‘agit pour les bactéries de transformer l’extrémité de la chaîne carbonée, un groupement méthyle, en acide ; le produit résultant, une chaîne carbonée plus ou moins insaturées conclue par une fonction acide est tout simplement un acide gras, qui sera ensuite métabolisé via la -oxydation précédemment décrite… (A + NADH + H+  AH2 + NAD+) pseudomonades, nocardiformes, mycobactéries, ... Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

SOURCES DE CARBONE … ET ENFIN (QUOIQUE...) aromatiques Phe  Tyr   homogentisate    fumarate + acétoacétate toluène  catéchol (id. pour Trp, benzène, naphtalène, phénol, …)  catéchol  succinate + acétyl-coA ou catéchol  pyruvate + acétaldéhyde + formate vanillate  protocatéchuate (id. pour shikimate, benzoate, …) Toujours plus fort : l’ouverture du noyau aromatique. Cette réaction est très complexe car les électrons délocalisés du cycle benzénique doivent, pour pouvoir ouvrir le cycle, être « bloqués ». L’une des possibilités consiste en l’oxydation préalable du noyau aromatique, qui va donner, selon le substrat (toluène, anthracène, benzène, phénol, naphtalène, Trp, … pour l’un, vanillate, shikimate, benzoate, … pour l’autre), du catéchol ou du protocatéchuate, deux dialcools dont les fonctions alcools sont localisées sur deux carbones contigus. Ensuite, il sera possible d’ouvrir le noyau aromatique (dans le dialcool, les électrons sont bloqués, il n’y a plus de double liaison délocalisée) pour produire des métabolites injectables soit dans le cycle de l’acide citrique, soit en fin de glycolyse. Autre voie métabolique possible : le passage par l’homogentisate (encore un dialcool, mais dans lequel les deux fonctions alcool sont situées en position 1 et 4 du noyau aromatique. Cette voie est, entre autres, utilisée dans le catabolisme de la Phe et de la Tyr. Là aussi, les produits finaux seront injectés au niveau du cycle de l’acide citrique.  protocatéchuate  succinate + acétyl-coA + CO2 ou protocatéchuate  2 pyruvate + formate Pseudomonades (Ralstonia, Burkholderia, …) Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

LA VOIE D’EMBDEN-MEYERHOF-PARNAS (phosphofructokinase)
CATABOLISMES LA VOIE D’EMBDEN-MEYERHOF-PARNAS N’EST PAS UNIVERSELLE ! exemple : Zymomonas mobilis glucose glucose ~ 6 P ATP ADP fructose ~ 6 P pas de PFK (phosphofructokinase) Avant d’en finir avec le catabolisme des molécules carbonées, voici une alternative originale à la glycolyse traditionnelle, observée chez certaines bactéries telles que Zymomonas mobilis, une bactérie connue pour fermenter le jus d’agave, mais aussi chez de nombreuses bactéries aérobie strictes (Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Azotobacter). Ici, l’absence d’une enzyme clé de la glycolyse empêche de dépasser « l’étape fructose-6-phosphate » : comment la bactérie a-t-elle, au cours de l’évolution adapté son métabolisme pour pouvoir fabriquer tous les métabolites précurseurs dont elle a besoin ?  comment fabriquer , , PEP, pyruvate, acétyl-coA et énergie ?? trioses ~ P 3 P ~ glycérate Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

UNE GLYCOLYSE ALTERNATIVE : LA VOIE D’ENTNER-DOUDOROFF
CATABOLISMES UNE GLYCOLYSE ALTERNATIVE : LA VOIE D’ENTNER-DOUDOROFF (VOIE DU KDPG) 6 P ~ gluconate H2O NADP+ NADPH + H+ céto-désoxy- 6 P ~ gluconate (KDPG) H2O glucose glucose ~ 6 P ATP ADP PEP NADH NAD+ + H+ ATP ADP + Pi H2O La réponse tient à une voie nouvelle, dont la première étape est commune à la glycolyse et à la voie des pentoses phosphate, et la seconde à la seule voie des pentoses phosphate. Mais le 6-phospho-gluconate, au lieu d’être carboxylé, va, dans ce cas-ci, être déshydraté en cétodésoxyphosphogluconate (ou KDPG, les anglophones utilisant le terme « keto ») : ce métabolite sera alors clivé en deux molécules à trois carbones, le 3-phoshoglycéraldéhyde (un des deux trioses-phosphate de la glycolyse) qui réintégrera la deuxième partie de la glycolyse (seule l’étape fructose-1,6-bisphosphate aura donc été shuntée), et le pyruvate. glycéraldéhyde ~ 3 P pyruvate pyruvate ADP ATP Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

LA VOIE D’ENTNER-DOUDOROFF
CATABOLISMES LA VOIE D’ENTNER-DOUDOROFF EST MOINS ENERGETIQUE QUE LA VOIE EMP… Glucose + (ADP + Pi) + NAD+ + NADP+  2 pyruvate + H2O + ATP + NADH + H+ + NADPH + H+ Si l’on compare le bilan de la voie du KDPG à celui de la glycolyse (OK, OK, on avait dit pas de bilan… mais rien qu’un peu, histoire de comparer !), on note : une production d’ATP divisée par deux le « remplacement » d’une molécule de NADH + H+ par une molécule de NADPH + H+ Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

LA VOIE D’ENTNER-DOUDOROFF
CATABOLISMES LA VOIE D’ENTNER-DOUDOROFF EST MOINS ENERGETIQUE QUE LA VOIE EMP… Glucose + (ADP + Pi) + 3 NAD+ + NADP+ + 2 coA-SH  2 acétyl-coA + 2 CO2 + H2O + ATP + 3 (NADH + H+) + NADPH + H+ Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

… ET N’EST PAS COMPATIBLE AVEC L’IMPORT DE GLUCOSE
CATABOLISMES … ET N’EST PAS COMPATIBLE AVEC L’IMPORT DE GLUCOSE VIA LE PTS ! 6 P ~ gluconate H2O NADP+ NADPH + H+ céto-désoxy- 6 P ~ gluconate (KDPG) H2O glucose pyruvate glucose ~ 6 P PEP NADH NAD+ + H+ ATP ADP + Pi H2O L’intérêt d’une vision globale du métabolisme, c’est qu’elle nous amène à découvrir des contraintes particulières que la simple analyse des réactions d’une seule chaîne métabolique ne permettrait pas. Ainsi, on vient de voir que la voie du KDPG ne produisait qu’une seule molécule de PEP. Or, sachant qu’il y a des « fuites », c’est en fait moins d’une molécule de PEP qui sera produite par glucose consommé. Et, si le glucose pénétrait via le PTS, cela voudrait dire que, pour chaque glucose consommé, le PEP produit ne permettrait pas de faire rentrer une nouvelle molécule de glucose… donc, le catabolisme s’arrêterait petit à petit !? IMPOSSIBLE !!! Et, du coup, les bactéries qui utilisent la voie du KDPG importent les glucose par un transport actif qui n’est pas le PTS (il s’agit ici de transports actifs mettant en jeu des MFS)… glycéraldéhyde ~ 3 P pyruvate Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CATABOLISME DES SUCRES : DIFFERENTES STRATEGIES
CATABOLISMES CATABOLISME DES SUCRES : DIFFERENTES STRATEGIES Et pour finir cette partie du cours, un tableau qui met en évidence une partie de la diversité catabolique chez les bactéries : des trois voies précédemment exposées, on voit que certaines bactéries en possèdent une seule, d’autres deux, voire même les trois, sachant que, quand elles en possèdent plusieurs, on considère généralement qu’il y aura une voie majoritairement utilisée (M), l’autre (les autres) étant utilisée de façon moindre (m). Attention : ce n’est pas parce qu’une bactérie ne possède pas une voie métabolique dans son entier qu’elle n’en possède pas cependant une partie… Ainsi, Acetobacter xylinum (la mère du vinaigre), bien qu’elle ne possède que la voie des pentose phosphate, va-t-elle disposer d’une partie de la voie EMP pour synthétiser tous les métabolites secondaires dont elle a besoin (rappelons nous que la voie des pentoses phosphate produit du fructose-6-phosphate et aussi du 3-phoshoglycéraldéhyde, qui sera injecté dans la deuxième partie de la glycolyse (cf. voie du KDPG). Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

RE-OXYDER LES COENZYMES REDUITS : SPECIFICITES BACTERIENNES
CATABOLISMES RE-OXYDER LES COENZYMES REDUITS : SPECIFICITES BACTERIENNES système de transport (membranaire) des électrons (STE) : un complexe, donc une sortie de protons, en moins  chez les bactéries, c’est moins énergétique ! 2 ATP par NAD(P)H + H+ ré-oxydé ATP par FADH2 ré-oxydé de nombreuses bactéries sont capables de suppléer à l’absence d’oxygène en sortie du STE Maintenant que vous maîtrisez le devenir des métabolites carbonés issus du catabolisme, et que vous avez pu prendre conscience des différentes formes d’énergie qui en sont tirées, quid des coenzymes réduits ?! Car, bien évidemment, la bactérie ne peut pas en produire indéfiniment : si elle veut pouvoir continuer à oxyder des métabolites, il va lui falloir reconstituer son stock de coenzymes oxydés, donc ré-oxyder les coenzymes réduits. Pour cela, la voie la plus intéressante consiste à ré-oxyder NADH + H+ ou FADH2 au niveau d’une chaîne de transporteurs d’électrons membranaire : les électrons injectés vont cheminer au sein de la membrane, dans le sens des potentiels rédox croissants, jusqu’à un accepteur final, qui pourra être l’oxygène (respiration aérobie), mais pas uniquement l’oxygène (respirations anaérobies). L’intérêt de ce moyen de ré-oxydation des coenzymes réduits est qu’il s’accompagne d’une expulsion de protons, dont la rentrée via l’ATPase produira de l’ATP en quantité (au passage, vous noterez que les chaînes de transporteurs électrons bactériennes, plus simples que leurs homologues mitochondriales, expulsent moins de protons, ce qui aboutit à une synthèse d’un ATP en moins par coenzyme réduit !). Et, s’il n’y a pas d’accepteur d’électrons en bout de chaîne, certaines bactéries pourront toujours ré-oxyder le NADH + H+ directement dans le cytosol, en réduisant des métabolites carbonés, dont certains sont issus des oxydations précédentes : on parlera alors de fermentations. respirations anaérobies (accepteur d’électrons alternatif) fermentations (pas d’accepteur final d’électrons) Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CATABOLISMES BACTERIES ET OXYGENE Mais avant de regarder de plus près les différentes respirations, intéressons nous d’abord au comportement des bactéries en présence d’oxygène. Si l’on inocule un tube contenant une gélose nutritive avec une culture pure de bactéries (il faut, pour cette expérience, que le tube soit assez long, de l’ordre de 10 cm, afin que s’établisse un gradient en oxygène du haut en bas de la gélose), puis que l’on laisse incuber le tube suffisamment longtemps pour que la croissance bactérienne soit observable à l’œil nu, on aboutit à 5 situations possibles : les bactéries n’ont poussé qu’en haut du tube ; les bactéries ont poussé partout, et de la même façon quelle que soit leur position dans la gélose ; les bactéries n’ont poussé qu’en haut du tube, mais pas en surface (un peu en dessous de la surface) ; les bactéries n’ont poussé qu’au fond du tube ; les bactéries ont poussé partout, mais la croissance est plus forte en haut du tube. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

5 COMPORTEMENTS DIFFERENTS
BACTERIES ET OXYGENE 5 COMPORTEMENTS DIFFERENTS anaérobie facultative aérobie stricte microaérophile anaérobie stricte Comment expliquer ces différences phénotypiques ? 1. les bactéries n’ont poussé qu’en haut du tube, car, plus bas, il n’a plus assez d’oxygène pour leur permettre de respirer : ces bactéries ont absolument besoin d’oxygène pour vivre, elles sont dites « aérobie strictes » (en fait, en absence d’oxygène, elle pourront se débrouiller avec du nitrate…) 4. les bactéries n’ont poussé qu’au fond du tube, là où il n’y a (quasiment) plus d’oxygène : l’oxygène (ou, plus exactement, ses dérivés, cf. diapositive suivante) sont toxiques pour les bactéries, qui sont dites « anaérobie strictes » 5. les bactéries ont poussé partout, mais la croissance est plus forte en haut du tube : l’oxygène n’est pas toxique pour les bactéries, qui sont de plus capables de s’en passer pour leur métabolisme… mais poussent alors moins bien, le métabolisme anaérobie étant moins favorable d’un point de vue énergétique (plus les bactéries disposent d’énergie, plus elles fabriquent de biomasse), et on parle donc de bactéries « anaérobie facultatives » (et non « aérobie facultatives », puisque nous voyons que, quand il y a de l’oxygène, elles l’utilisent, donc c’est bien leur choix n°1) 2. les bactéries ont poussé partout, et de la même façon quelle que soit leur position dans la gélose : elles n’utilisent pas l’oxygène (aucun impact de la présence d’oxygène sur le métabolisme énergétique), mais sont capables de résister à ses effets toxiques, les bactéries sont donc dites « anaérobie aérotolérantes » 3. les bactéries n’ont poussé qu’en haut du tube, mais pas en surface (un peu en dessous de la surface) : si elles ont bien besoin d’oxygène pour vivre (pas de croissance en dessous d’une certaine concentration en oxygène), elles ne résistent pas à ses effets toxiques lorsque celui-ci est à concentration atmosphérique… ces bactéries, issues des sols et des eaux, sont habituées à des environnements carencés en oxygène, on les appelle « microaérophiles « (qui aiment l’oxygène mais à petite dose) anaérobie aérotolérante Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

POURQUOI CES DIFFERENCES
BACTERIES ET OXYGENE POURQUOI CES DIFFERENCES DE COMPORTEMENT ? deux enzymes clés : superoxyde dismutase (SOD) 2 O H+  H2O2 + O2 catalase 2 H2O2  H2O + O2 aucune des deux enzymes : anaérobie strictes Nous venons de voir que l’oxygène pouvait être dangereux via ses sous-produits : effectivement, le métabolisme de l’oxygène génère des molécules hautement réactives, appelées radicaux libres (superoxyde, péroxyde d’hydrogène, radical hydroxyle), qui, si elles ne sot pas neutralisées, vont réagir avec les lipides membranaires (entre autres), aboutissant à la destruction des membranes, dont la membrane plasmique. Pour survivre à l’oxygène (et ceci est également valable pour nous, qui ne pouvons pourtant vivre sans oxygène), les bactéries peuvent disposer de certaines enzymes qui vont neutraliser les radicaux libres : la SOD élimine l’ion superoxyde en produisant du péroxyde d’hydrogène (eau oxygénée, dont on connaît les vertus antiseptiques) ; la catalase (et plus généralement, les péroxydases) va redonner de l’eau et de l’oxygène à partir du péroxyde d’hydrogène. Si une bactérie ne dispose d’aucune de ces enzymes, elle sera sensible à la toxicité de l’oxygène. Si elle possède les deux, elle y sera au contraire insensible (si tant est que les enzymes soient capables d’éliminer tous les radicaux libres produits,nous entrons là dans des problèmes de constantes cinétiques des enzymes concernées, cf. les bactéries microaérophiles). Les bactéries anaérobie aérotolérantes ne possèdent, elles, que la SOD, mais comme elles n’utilisent pas l’oxygène pour leur métabolisme, la quantité de péroxyde d’hydrogène qu’elles pourraient produire est suffisamment faible pour ne pas nécessiter de disposer d’une catalase pour protéger les membranes cellulaires. les deux enzymes : aérobie strictes anaérobie facultatives microaérophiles seulement la SOD : anaérobie aérotolérantes Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

SYSTEME DE TRANSPORT DES ELECTRONS :
RESPIRATION AEROBIE SYSTEME DE TRANSPORT DES ELECTRONS : COMPOSITION ATPase FMN FeS b562 NADH déshydrogénase o transport d’électrons UQ Parlons maintenant de chaînes de transporteurs d’électrons, et, avant toute chose, voyons quelles sont les bases de ces systèmes : il y obligatoirement à l’entrée un (plusieurs ?) injecteur(s), transporteur d’électrons qui va accepter les électrons du coenzyme réduit ; il y a obligatoirement à la sortie une protéine qui va transférer les électrons sur un accepteur (final) d’électrons ; entre injecteur et accepteur, on observe une stricte alternance entre transporteurs d’électrons et transporteurs d’électrons et de protons. L’alternance des deux types de transporteurs (observée pour la respiration et la photosynthèse) est à l’origine de l’établissement du gradient de protons : quand un transporteur d’électrons et de protons transfère ses électrons à un transporteur d’électrons, ce dernier n’acceptant pas les protons, le donneur les évacue à l’extérieur (donc, expulsion de protons) ; quand un transporteur d’électrons transfère ses électrons à un transporteur d’électrons et de protons, ce dernier va devoir récupérer des protons du côté intérieur de la membrane. Et chaque alternance aboutira alors au pompage d’électrons dans le cytosol, qui seront expulsés à l’extérieur de la cellule. La résultante de ces expulsions de protons est la mise en place d’une différence de potentiel (), puisqu’il y a maintenant plus de charges positives à l’extérieur, et d’une différence de pH entre les deux faces de la membrane (pH). La résultante de ces deux phénomènes physico-chimiques est appelée force proton-motrice (fpm =  + pH), qui sera le moteur de la rentrée des protons dans la cellule, via l’ATPase (moyennant production d’ATP), un transporteur membranaire (symport à protons), le moteur du flagelle (mise en mouvement de la bactérie), … Cette notion de fpm a été développée par Mitchell au début des années 1960, et sert de base à la théorie chimio-osmotique, ou théorie de Mitchell. transport d’électrons et de protons transport de protons Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

SYSTEME DE TRANSPORT DES ELECTRONS :
RESPIRATION AEROBIE SYSTEME DE TRANSPORT DES ELECTRONS : RE-OXYDATION DU NAD(P)H + H+  ≤ 2 ATP 2 H+ e- 2 H+ 2 H+ H+ 6 H+ ATPase FMN FeS b562 NADH déshydrogénase o UQ La chaîne respiratoire d’Escherichia coli est constituée de : trois transporteurs d’électrons et de protons : l’injecteur (NADH déshydrogénase) ; une quinone (selon les cas, ubiquinone ou ménaquinone), qui pourra servir d’injecteur pour les électrons du FADH2 ; le cytochrome terminal, ici le cytochrome o ; deux transporteurs d’électrons : une protéine à FMN et centre Fe/soufre ; le cytochrome b562. La quinone est mobile : elle peut passer d’une face de la membrane à l’autre et donc, malgré sa petite taille, emporter des protons prélevés à l’intérieur vers l’extérieur de la cellule (puisqu’elle ne peut les donner au cytochrome qui lui succède). A l’arrivée, il y a 6 protons expulsés par paire d’électrons injectée dans la membrane. La rentrée dans la cellule de ces 6 protons entraînera la synthèse de deux molécules d’ATP. On parle de phosphorylation oxydative, car cette synthèse d’ATP résulte de l’utilisation d’électrons issus de l’oxydation d’un substrat. Ces électrons sont transférés sur ½ molécule d’oxygène, moyennant consommation de deux protons supplémentaires, le produit final étant l’eau. 2 H+ + ½ O2 H2O NAD(P)H NAD(P)+ + H+ 2 (ADP + Pi) 2 ATP Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

SYSTEME DE TRANSPORT DES ELECTRONS : RE-OXYDATION DU FADH2  1 ATP
RESPIRATION AEROBIE SYSTEME DE TRANSPORT DES ELECTRONS : RE-OXYDATION DU FADH2  1 ATP 2 H+ e- 2 H+ H+ 3 H+ ATPase FMN FeS FeS b562 NADH déshydrogénase o UQ En ce qui concerne le FADH2, dont nous avons vu qu’il est produit dans le cycle de l’acide citrique lors de l’oxydation du succinate en fumarate, ses électrons sont injectés au milieu de la chaîne de transporteurs, via la quinone. Résultat : moins de protons expulsés, et donc un ATP produit en moins (comme dans les mitochondries). SDH 2 H+ + ½ O2 H2O FADH2 FAD fumarate succinate ADP + Pi ATP Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

SYSTEME DE TRANSPORT DES ELECTRONS : SI L’OXYGENE EST LIMITANT ?
RESPIRATION AEROBIE SYSTEME DE TRANSPORT DES ELECTRONS : SI L’OXYGENE EST LIMITANT ? 2 H+ e- 2 H+ H+ b558 + b595 d FMN FeS b562 o NADH déshydrogénase UQ Quand l’oxygène n’est pas limitant : utilisation de deux cytochromes b568 et o (2 protons excrétés par électron transloqué) les protéines mises en jeu sont CyoA (interaction avec la quinone), CyoB (qui lie les deux hèmes), et CyoC et CyoD (fonction ??) Mais, si l’oxygène devient limitant,la bactérie va modifier la partie droite de sa chaîne de transporteurs d’électrons en remplaçant : les cytochromes b568 et o par les cytochromes b558 + b595 et d les protéines CyoA, CyoB, CyoC et CyoD par les protéines CydA (qui lie les 3 hèmes) et CydB (lie seulement b595 et d). La mise en place de ce nouveau complexe aboutit à un système moins efficace en termes d’expulsion de protons (1 proton excrété par électron transloqué), et donc à une synthèse d’ATP moindre pour chaque paire d’électrons transférée : < 2 ATP par NADH + H+ ré-oxydé ; < 1 ATP par FADH2 ré-oxydé ! 2 H+ + ½ O2 H2O NAD(P)H NAD(P)+ + H+ < 2 ATP par NAD(P)H + H+ ré-oxydé Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

SYSTEME DE TRANSPORT DES ELECTRONS : S’IL N’Y A PAS D’OXYGENE ???
CATABOLISMES SYSTEME DE TRANSPORT DES ELECTRONS : S’IL N’Y A PAS D’OXYGENE ??? il y a un autre accepteur d’électrons utilisable  respiration anaérobie il y n’a pas d’accepteur d’électrons (utilisable)  fermentation Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

RESPIRATIONS ANAEROBIE
LES RESPIRATIONS ANAEROBIES CHEZ ESCHERICHIA COLI pas d’oxygène mais du nitrate : respiration sur nitrate même en présence d’oxygène : respiration sur nitrite respiration sur sulfate respirations « exotiques » Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

ESCHERICHIA COLI : RESPIRATION SUR NITRATE FMN FeS b562 NADH déshydrogénase nitrate réductase UQ En absence d’oxygène, et à condition qu’il y ait du nitrate dans le milieu environnant, Escherichia coli va pouvoir respirer celui-ci en remplaçant le cytochrome o par une nitrate réductase, qui catalyse le transfert des électrons sur une molécule de nitrate, aboutissant à la production de nitrite. Une fois encore, la moindre efficacité de ce système en termes d’expulsion de protons va aboutir à une synthèse d’ATP inférieure à ce qui est observé en présence d’oxygène non limitant. L’efficacité de la production d’ATP peut exprimée sous la forme du rapport P/O (quantité de molécules d’ADP phosphorylées par atome d’oxygène réduit). Pour la réduction du NADH + H+,ce rapport est de 3 chez les mitochondries, 2 chez E. coli si l’oxygène est non limitant, et inférieur à 2 dans tous les autres cas. Pour la réduction du FADH2, P/O est égal à 2 chez les mitochondries, 1 chez E. coli si l’oxygène est non limitant, et inférieur à 1 dans tous les autres cas. 2 H+ + NO3- NO2- + H2O < 2 ATP par NAD(P)H + H+ ré-oxydé Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

ESCHERICHIA COLI : RESPIRATION SUR NITRITE FMN FeS b562 NADH déshydrogénase nitrite réductase UQ Pas de nitrate mais du nitrite ? Pas de problème, la bactérie installe en fin de chaîne une nitrite réductase, qui convertit le nitrite en ammoniaque. Et qui va ensuite assimiler cet ammoniaque en l’utilisant pour la fabrication de ses acides aminés… 6 H+ + NO2- NH OH- ASSIMILATION < 2 ATP par NAD(P)H + H+ ré-oxydé Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

ESCHERICHIA COLI : RESPIRATION SUR SULFATE sulfate + ATP  adénosine phosphosulfate (APS) + PPi + ATP  phospho-adénosine phosphosulfate (PAPS) + ADP PAPS + H2O + 2 R-(SH)2  SO32- + RS2 + AMP-3’-phosphate (thiorédoxine) Respirer sur sulfate est d’autant plus difficile que le potentiel rédox du couple SO42-/SO32-, et que donc, pour que les électrons aillent du NADH + H+ vers le sulfate (c.a.d. dans le sens des potentiels rédox décroissants, ce qui est énergétiquement impossible), il faut dans un premier temps injecter de l’énergie dans le système. C’est pourquoi les deux premières étapes nécessitent d’investir de l’ATP : activation du sulfate en APS, puis en PAPS. Et c’est ce PAPS qui va pouvoir être réduit en sulfite (SO32-) grâce à l’action d’une thiorédoxine. Puis, les électrons du NADPH + H+ seront transférés sur le sulfite pour donner du sulfure (S2-), qui sera assimilé en étant intégré à la production de cystéine. Cette production génère une molécule d’acétate dont le métabolisme permettra de produire un peu d’énergie, histoire de compenser celle investie dans l’activation préalable du sulfate. Au final, cette respiration peu rentable sur le plan énergétique a cependant un P/O supérieur à 0… sinon, elle n’existerait pas ! SO (NADPH + H+)  S H2O + 3 NADP+ S H+ + o-acétyl-L-Ser  acétate + L-Cys ASSIMILATION Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

DES RESPIRATIONS « EXOTIQUES » respiration sur fumarate : fumarate + 2 H+ + 2 e-  succinate (!) respiration sur diméthylsulfoxyde : DMSO + 2 H+ + 2 e-  diméthylsulfide + H2O H3C - S - CH3 O = Parmi les autres respirations identifiées chez E. coli, notons celle du fumarate, qui aboutit à la production de succinate : si vous connaissez bien votre cycle de l’acide citrique, vous constatez qu’il s’agit ici d’une réaction allant dans le sens inverse de celui de ce cycle ! respiration sur triméthylamine-N-oxyde : TMAO + 2 H+ + 1 e-  triméthylamine + H2O CH3 H3C - N - CH3 O- - - - Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

RESPIRATIONS CHEZ ESCHERICHIA COLI O2 O2 limitant nitrate DMSO fumarate TMAO En guise de résumé : Diversity of Escherichia coli respiratory chain enzymes. The respiratory chain comprises primary dehydrogenases (on the left), quinone species (middle) and terminal reductases (on the right). Expression of enzymes is regulated in response to the presence of reducing substrates and oxidants. Current topological models for the individual enzymes are represented with the cytoplasmic side of the membrane being ‘up’ in the figure. FAD, flavin adenine mononucleotide; FMN, flavin mononucleotide; b, haem b; o, haem o; NAD, nicotinamide adenine dinucleotide; DHAP, dihydroxyactone phosphate; TMAO, trimethylamine-N-oxide; DMSO, dimethylsulfide. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

D’AUTRES RESPIRATIONS ANAEROBIES dénitrification (dissimilation) Pseudomonas stutzeri, Bacillus licheniformis, Paracoccus denitrificans respiration sur sulfate (dissimilation) Desulfovibrio respiration sur sulfure (dissimilation) Desulfuromonas Dans le monde bactérien, on trouve bien d’autres respirations anaérobies que celles décrites pour Escherichia coli. En voici quelques exemples… respiration sur fer Bacillus, Pseudomonas respiration sur carbonate Clostridium, Acetobacterium méthanogénèse méthanogènes (Archaea) Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

DENITRIFICATION 2 NO H+ + 4 e-  2 NO H2O nitrate réductase 2 NO H+ + 4 e-  N2O + 3 H2O nitrite réductase X-Fe2+ − N+=O l -O− N=O X-Fe2+ − N− O- ll -O − N− O- NO H+ + X-Fe2+  X-Fe2+ − N≡O+ + H2O NO2- + X-Fe2+ − N≡O+  + 2 e-  + 4 H+ + 2 e-  N2O + 2 H2O + X-Fe2+ La dénitrification est un métabolisme voisin de la respiration sur nitrate/nitrite, mais qui se caractérise par un devenir différent de l’azote, qui n’est pas assimilé sous forme d’amine mais dissimilé sous forme d’azote diatomique. Cet azote gazeux regagnera l’atmosphère (constituée comme chacun sait pour 2/3 d’azote diatomique). N2O + 2 H+ + 2 e-  N2 + H2O N2O réductase Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

RESPIRATION SUR SULFATE (DESULFOVIBRIO) LITHOTROPHIE SO42- + 8 H+ + 8 e- + ATP  S2- + 2 H2O + AMP + 2 Pi lactate + 2 ADP + 2 Pi  2 acétate + 2 CO2 + 2 ATP + 8 H+ + 8 e- Proche de la respiration sur sulfate mentionnée pour Escherichia coli, en ce sens qu’elle commence, elle aussi, par l’activation du sulfate en APS, la respiration sulfate chez les bactéries du genre Desulfovibrio se caractérise par : l’absence de passage par « la cas » PAPS ; la production de sulfure, qui sera dissimilé, par exemple sous la forme de sulfure d’hydrogène (H2S) ; l’utilisation d’électrons qui peuvent provenir soit de l’oxydation d’une molécule organique comme l’acide lactique (mais aussi glycérol, éthanol ou hydrocarbures aliphatiques et aromatiques), les électrons étant orientés vers une chaîne de transport d’électrons qui met en jeu une ménaquinone (MQ), soit de l’oxydation de l’hydrogène gazeux (H2) par une hydrogénase (cf. chapitre sur la lithotrophie). Schematic representation of the respiratory electron transfer chain in Desulfovibrio, with H2 or organic compounds as energy source and sulphate as terminal electron acceptor (no PAPS!). Oxydation du lactate : 2 accepteurs d’électrons différents = X (lactate → pyruvate) et ferrédoxine (pyruvate + coA-SH → acétyl-coA + CO2) acétyl-coA + Pi → acétyl-phosphate + coA-SH acétyl-phosphate + ADP → acétate + ATP Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

RESPIRATION SUR SOUFRE (DESULFUROMONAS ACETOXIDANS) oxydation de molécules organiques  H+ + e- S0 + 2 H+ + 2 e- H2S Il n’y a pas que le sulfate qui peut être réduit : le soufre élémentaire peut également être utilisé comme accepteur final d’électrons par certaines bactéries, et il sera alors transformé en sulfure. Le transfert des électrons prélevés à la matière organique sur le soufre élémentaire est à la base de travaux scientifiques sur la réalisation de batteries bactériennes (fuel cells), l’idée étant alors de récupérer les électrons sur une électrode plongée dans des sédiments, alors que l’autre électrode resterait dans un milieu aqueux. De telles batteries fonctionneraient moyennant l’oxydation de sédiments, c.a.d. un procédé de dépollution par les bactéries qui produirait en plus de l’électricité. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

RESPIRATION SUR SOUFRE (DESULFUROMONAS ACETOXIDANS) Electrode-Reducing Microorganisms That Harvest Energy from Marine Sediments Bond et al. (2002) Science 295: Will soldiers someday wear vests containing microbes that signal contact with biological weapons? Could un-manned submarines or underwater sensing devices run on microbe-power? Research conducted by University of Massachusetts microbiologists and reported in this week's issue of the journal Science concludes that certain microorganisms can transform organic matter commonly found at the bottom of the ocean into electrical energy. Aside from raising the possibility that microbes someday could be used to produce power in subsurface settings, the findings have implications for many industrial and military applications, according to Derek R. Lovley, UMass microbiologist and team leader. An understanding of how microbes generate and use electrical energy may also prompt the development of new technologies to decontaminate polluted water and sediment containing organic materials, including petroleum and other aromatic hydrocarbons, he says. In the Science article, Lovley explains how the team used water and sediment from Boston Harbor, a collection of mason jars, ordinary electrical wiring, and sterile graphite electrodes to determine the science behind the mechanics of a simple, sediment battery. The researchers added a layer of common mud to water in the jars, put one graphite electrode in the mud, another in overlying water. The resulting electrical current was strong enough to activate a lightbulb, or a simple computer. "Even using a primitive electrode made from graphite," Lovely said, "it is possible to produce enough current to power basic electronic marine instruments." Through more refined experiments, Lovley's group found that a family of energy-harvesting microorganisms, commonly referred to as Geobacters, were key to the production of the electrical current. Whereas most life forms, including humans, get their energy by oxidizing organic compounds with oxygen, Geobacters can grow in environments lacking oxygen by using the iron naturally present in soil, in place of oxygen. This new research demonstrates that Geobacters can also substitute an unnatural substance, such as an electrode, for the iron, according to Lovley. A large number of a Geobacter species known as Desulfuromonas acetoxidans (D. acetoxidans) were found on the anode end of the primitive batteries. When the researchers destroyed the D. acetoxidans in the sediment, the current stopped. "In the mud, a community of microorganisms cooperates to break down larger, more complex organic compounds to acetate. Geobacters then transfer the electrons from the acetate to the electrode generating the electrical energy," he said. Lovley's group also has found that some Geobacters can convert toxic organic compounds, such as toluene, to electricity. Lovley says this suggests that some Geobacters can be used to harvest energy from waste matter, or can be included in technology used to clean up subsurface environments contaminated by organic matter, especially petroleum. Earlier studies had shown bacteria could produce electricity under artificial conditions in which special chemicals were added, but the UMass study was the first to prove that the nearly ubiquitous microbes living in a typical marine environment could produce electricity under the conditions naturally found in that environment. "Once we know more about the genome of Geobacters, we will be able to manipulate these organisms to make them receptive to a variety of organic or inorganic contaminants. Theoretically, when they begin to degrade the contaminant, they will throw electrons on an electrode, and that could set off a light, a sound or some other form of signal," Lovely said. "An understanding of how this phenomenon operates has a number of extremely timely applications, especially in developing technologies to recognize toxins and organic contaminants." Lovley cites, for example, the potential for using such technology to develop military equipment that could alert soldiers to the presence of toxins or biological warfare agents in the immediate environment. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

RESPIRATION SUR SOUFRE ET CHATEAUX DE SABLE... Souvenir de vacances sur une plage aux alentours de Perros-Guirrec… En creusant le sable, à partir d’une certaine profondeur (là où il n’y a plus, ou plus assez, d’oxygène), on découvre que le sable a changé de couleur, et on sent une forte odeur de boule puante !? La réponse au pourquoi de ce double phénomène est évidente : respiration sur sulfate !!! En effet, l’odeur est due au sulfure d’hydrogène (H2S), produit final de cette respiration, et la couleur au sulfure de fer (FeS). Ajoutons que les bactéries du genre Desulfuromonas sont connues pour habiter les sédiments anaérobies marins ou estuariens… CQFD ! Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

RESPIRATION SUR FER (SHEWANELLA) Fe3+ + e-  Fe2+ Fe3+ + e-  Fe2+ Asv + H2S + e-  As2S3 Cultures représentatives de bactéries « respirant » le fer ou l’arsenic, ou oxydant le fer. La bouteille du centre contient une culture de Shewanella oneidensis (souche MR-1), qui croît sur lactate avec FeIII [Fe(OH)3] comme accepteur terminal d’électrons (respiration anaérobie) : FeIII est réduit en FeII qui, avec le temps, s’accumule dans la culture et s’adsorbe au minéral parental, créant un fer minéral de valence mixte de couleur noire (ex : magnétite). La bouteille de droite contient une culture de Shewanella oneidensis (souche ANA-3), qui croît sur lactate avec AsV comme accepteur terminal d’électrons (respiration anaérobie) : AsV est réduit en AsIV, l’ajout de sulfure au milieu et la diminution du pH en dessous de 7 entraînent la formation d’un précipité jaune de trisulfure d’arsenic (As2S3). La bouteille de gauche contient une culture de Rhodobacter (souche SW2), qui croît en photo-autotrophie sur du FeII (qui lui sert de source d’électrons, voir la partie du cours consacrée à la lithotrophie). L’oxydation du FeII produit du FeIII : la coloration « rouille » est due au précipité de Fe(OH)3. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

RESPIRATION SUR FER (SHEWANELLA) Pour en savoir plus sur la respiration du fer chez Shewanella (XH2 = donneur d’électrons) : Metal ion reduction by Gram-negative bacteria. (a) A hypothetical scheme showing the involvement of inner-membrane, periplasmic and outer-membrane multi-haem cytochromes in Fe(III) respiration by Shewanella frigidimarina. (b) A hypothetical electron-transfer system for soluble metal ion reduction and sulphite reduction in sulphate-reducing bacteria involving multi-haem cytochromes of the cytochrome c3 family. HmcA, B, C, E and F are the products of orfs 1, 2, 3, 5 and 6 of the hmc operon. The model is based on the data of Rossi et al. (1993) and the arguments of Berks et al. (1995) . Haem groups are represented by black ovals. OM, outer membrane; IM, inner membrane. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

RESPIRATION SUR CARBONATE (ACETOGENES) 2 CO2 + 8 H+ + 8 e-  CH3COOH + 2 H2O (2 HCO3-)  4 H2 LITHOTROPHIE Clostridium aceticum Desulfosporosinus orientis Vous connaissiez le gaz carbonique comme produit de la respiration : le voici en tant que substrat ! Et ici, les électrons utilisés pour réduire CO2 (qui est, rappelons le, la forme la plus oxydée du carbone) en acétate proviennent directement de l’hydrogène (rôle de l’hydrogénase) !!! Ces bactéries sont donc (chimio-)autotrophes et lithotrophes. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

METHANOGENESE La méthanogenèse, c’est l’art de transformer le carbone le plus oxyde en le carbone le plus réduit ! Elle est le fait d’une catégories de bactéries totalement à part, appelées méthanogènes, et qui sont en fait l’une des trois familles du règne des Archaea (ou archéobactéries, c.a.d. des organismes qui ressemblent beaucoup aux bactéries mais aussi aux eucaryotes, d’où leur positionnement à part dans la nouvelle classification des organismes vivants). Ici, le méthane est produit à partir de l’acétate (lui-même pouvant résulter de la réduction du CO2, cf. diapositive précédente). Les électrons prélevés sur l’acétate, lors du clivage de celui-ci en méthyle et CO2, vont être transférés, via la chaîne respiratoire membranaire (création d’une fpm), sur le méthyle pour donner le méthane. Scheme of methanogenesis from acetate in Methanosarcina species. Recent data indicate that the 2 [4Fe-4S] ferredoxin (Fd) from M. barkeri mediates electron transfer between CO dehydrogenase/acetyl-CoA synthase and Ech hydrogenase. CH3-H4MPT, methyltetrahydromethanopterin; MPox, methanophenazine in the oxidized form; MPred, methanophenazine in the reduced form; Hdr, heterodisulfide reductase; Vho, viologen-reactive hydrogenase one. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

METHANOGENESE Comme l’indique ce schéma plus général, plusieurs sources de carbone peuvent donner du méthane : méthanol, acétate, et CO2. Toutes convergent vers le méthyle-coenzyme M, qui servira de support à la synthèse de méthane à partir du méthyle. Scheme of methanogenesis from H2/CO2, methanol, and acetate. As a central intermediate of the various pathways, methyl-coenzyme M (CH3-S-CoM) is formed and is converted to methane and the heterodisulfide of coenzyme M and coenzyme B (CoM-S-S-CoB). CoM-S-S-CoB thus generated functions as the terminal electron acceptor of the various respiratory chains. H2 and reduced coenzyme F420 (F420H2) are the electron donors for the reduction of CoM-S-S CoB. The unknown mechanism of electron transfer from the reduced ferredoxin (Fdred) to CoM-S-S-CoB in acetate metabolism is symbolized by a question mark. The role of H2 as an intermediate of this reaction is discussed in the text. CH3-H4MPT, methyl tetrahydromethanopterin; F420H2, reduced form of coenzyme F420 ; Fd, ferredoxin; pFd, polyferredoxin. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

POURQUOI L’OXYGENE EST-IL L’ACCEPTEUR D’ELECTRONS PREFERENTIEL ? les formes réduite (H2O) et oxydée (O2) diffusent librement à travers l’enveloppe la forme oxydée est (presque) toujours biodisponible la forme réduite n’est pas toxique le couple O2 / H2O a le potentiel rédox le plus élevé (après le couple N2 / N2O) Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

A PROPOS DE POTENTIELS REDOX... forme oxydée forme réduite E’0 (mV) SO42- HSO NAD(P)+ NAD(P)H + H FAD FADH HSO3- HS fumarate2- succinate quinone quinone-H TMAO triméthylamine + 130 DMSO diméthylsulfate + 160 NO2- NO + 360 NO3- NO ½ O2 H2O + 815 Et, en plus, un rappel de thermodynamique : G’0 = -nF E’0… donc, plus la différence de potentiel rédox entre donneur et accepteur d’électrons est élevée, plus l’énergie produite sera importante ! Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

D’AUTRES POTENTIELS REDOX... forme oxydée forme réduite E’0 (mV) 2 H+ H ferrédoxine oxydée ferrédoxine réduite - 432 HS2O3- H2S + HSO CO2 acétate S0 HS CO2 CH acétaldéhyde éthanol - 197 pyruvate lactate HSO3- S0 - 38 Fe3+ Fe N2O N Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

POURQUOI RESPIRER L’OXYGENE EST PLUS ENERGETIQUE forme oxydée forme réduite E’0 (mV) SO42- SO32- + H2O - 516 NAD(P)+ NAD(P)H + H FAD FADH HSO3- HS fumarate2- succinate TMNO triméthylamine + 130 DMSO diméthylsulfate + 160 NO2- NO + 360 NO3- NO ½ O2 H2O + 815 - 320 815 - (- 320) = 1135 E’0 (NAD+/NADH + H+) = mV - E’0 (O2/H2O) = mV  E’0 = (-320) = mV. +815 Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

POURQUOI RESPIRER L’OXYGENE EST PLUS ENERGETIQUE forme oxydée forme réduite E’0 (mV) SO42- SO32- + H2O - 516 NAD(P)+ NAD(P)H + H FAD FADH HSO3- HS fumarate2- succinate TMNO triméthylamine + 130 DMSO diméthylsulfate + 160 NO2- NO + 360 NO3- NO ½ O2 H2O + 815 - 220 815 - (- 220) = 1035 E’0 (FAD/FADH2) = mV - E’0 (O2/H2O) = mV  E’0 = (-220) = mV… ré-oxyder le FADH2 est moins énergétique que ré-oxyder le NADH + H+. + 815 Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

POURQUOI RESPIRER L’OXYGENE EST PLUS ENERGETIQUE - 836 ! forme oxydée forme réduite E’0 (mV) SO42- SO32- + H2O - 516 NAD(P)+ NAD(P)H + H FAD FADH HSO3- HS fumarate2- succinate TMNO triméthylamine + 130 DMSO diméthylsulfate + 160 NO2- NO + 360 NO3- NO ½ O2 H2O + 815 - 320 421 - (- 320) = 741 + 204 E’0 (NAD+/NADH + H+) = mV - E’0 (NO3-/ NO2-) = mV  E’0 = (-320) = mV… utiliser le nitrate comme accepteur d’électrons est moins énergétique de d’utiliser l’oxygène. E’0 (NAD+/NADH + H+) = mV - E’0 (SO42-/ SO32-) = -516 mV  E’0 = (-320) = mV : les électrons ne peuvent aller sans apport d’énergie du NADH + H+ vers le sulfate (d’où la nécessité de passer par les étapes APS puis PAPS). Par contre, E’0 (SO42-/ SO32-) = mV - E’0 (HSO3-/ HS-) = mV  E’0 = (-516) = mV… même s’il a fallu injecter de l’énergie dans le système, au final, la respiration sur sulfate est tout de même (faiblement) énergétique. + 421 Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

AUCUN ACCEPTEUR D’ELECTRONS ??
CATABOLISMES ET S’IL N’Y A AUCUN ACCEPTEUR D’ELECTRONS ?? les coenzymes réduits ne peuvent plus être ré-oxydés et s’accumulent dans le cytoplasme : il faut arrêter d’en produire ! blocage du cycle de Krebs : inhibitions allostériques successives  a-cétoglutarate déshydrogénase (NADH + H+, succinyl-coA)  citrate synthase (NADH + H+, a-cétoglutarate) effets allostériques au niveau du couple PEP / pyruvate En cas d’absence d’accepteur d’électrons au niveau de la chaîne respiratoire membranaire, deux types de réactions de sauvegarde) se mettent en place : des inhibitions ou activation allostériques d’enzymes, destinées à répondre au plus vite au problème vécu par la bactérie (comme vous le voyez, les coenzymes accumulés sont des effecteurs allostériques) ; des activations ou répressions de gènes, afin d’assurer un changement métabolique sur le moyen (voire le long) terme, en attendant que les conditions redeviennent plus favorables. Deux problèmes sont à gérer : arrêter de produire des coenzymes réduits, tout en continuant à produire des métabolites précurseurs (donc, difficile de toucher à la glycolyse et à la voie des pentoses phosphate, seul le cycle de l’acide citrique pourra être remanié, cf. diapositives suivantes) ; ré-oxyder les coenzymes réduits produits au cours de la glycolyse et de la voie des pentoses phosphate, via des réactions cytoplasmiques utilisant les substrats disponibles, en premier lieu le pyruvate (fermentations).  pyruvate déshydrogénase    (acétyl-coA, NADH + H+ : effecteurs négatifs)  PEP carboxylase    (acétyl-coA : effecteur positif) activation / répression de régulateurs de l’expression des gènes Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

VOIES ANAPLEROTIQUES :
CATABOLISMES VOIES ANAPLEROTIQUES : PEP CARBOXYLASE H2O oxaloacétate acétyl-coA coA-SH + H+ pyruvate NADH + H+ NAD+ coA-SH CO2 PDH citrate CO2 Pi CO2 + H2O PC isocitrate CO2 NAD+ NADH PEP ATP ADP Le freinage de la synthèse d’-cétoglutarate (cette synthèse ne peut être entièrement stoppée puisqu’il s’agit d’un métabolite précurseur) et le blocage du cycle en aval de ce métabolite amènent la bactérie à remanier ce cycle afin de continuer à produire oxaloacétate et succinyl-coenzyme A. Pour l’oxaloacétate, deux voies sont mises en place : synthèse à partir du PEP par la PEP carboxylase ; synthèse à partir du pyruvate par la pyruvate carboxylase. Ces deux enzymes, auxquelles s’ajoute la pyruvate déshydrogénase, vont pouvoir réguler les quantités respectives de pyruvate, d’acétyl-coA et d’oxoloacétate, en fonction des besoins de la cellule… mais quid du succinyl-coA ??? a-cétoglutarate et le succinyl-coA ??? Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

VOIES ANAPLEROTIQUES :
CATABOLISMES VOIES ANAPLEROTIQUES : LE SHUNT DU GLYOXYLATE H2O oxaloacétate acétyl-coA coA-SH + H+ acétyl-coA malate citrate NADH + H+ NAD+ isocitrate CO2 NAD+ NADH succinate glyoxylate fumarate H2O FADH2 FAD succinyl-coA GDP GTP + Pi coA-SH Pour continuer à synthétiser le succinyl-coA, la bactérie met en place une voie originale appelée « shunt du glyoxylate » : une partie de l’isocitrate produit, au lieu d’être décarboxylée en -cétoglutarate, va être clivée en glyoxylate et succinate, qui sera alors transformé en succinyl-coA. Le glyoxylate, molécule à 4 carbones, sera ensuite condensé avec une molécule d’acétyl-coA pour donner du malate, nouvelle source d’oxaloacétate ou de fumarate (qui peut lui-même être réduit en succinate…). Le cycle de l’acide citrique n’est donc plus cyclique mais coupé en deux parties qui fonctionnent en sens inverse : la voie qui va de l’acétyl-coA à l’-cétoglutarate est appelée branche oxydante du cycle ; la voie (inverse) qui permet de produire du succinyl-coA est appelée voie réductrice. a-cétoglutarate Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

QUID DES COENZYMES REDUITS PRODUITS (AU COURS DE LA GLYCOLYSE) ?
CATABOLISMES QUID DES COENZYMES REDUITS PRODUITS (AU COURS DE LA GLYCOLYSE) ? utilisation de pyruvate ou de ses dérivés  substrats destinés à être réduits (via la ré-oxydation des coenzymes) = FERMENTATIONS Xox + NADH + H+ → Xréd + NAD+  le seul ATP produit l’est par phosphorylation au niveau du substrat Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

PHOSPHORYLATIONS AU NIVEAU DU SUBSTRAT
CATABOLISMES PHOSPHORYLATIONS AU NIVEAU DU SUBSTRAT X~ P + ADP  X + ATP 1,3-bisphosphoglycérate + ADP  ATP (glycolyse) PEP + ADP  pyruvate + ATP (glycolyse) 3 P ~ glycérate acétyl-phosphate + ADP  acétate + ATP (acétogenèse) butyryl-phosphate + ADP  butyrate + ATP (fermentation butyrique) Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

FERMENTATIONS FERMENTATIONS Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

FERMENTATIONS FERMENTATIONS : QUELQUES GENERALITES faible rendement en ATP (YATP) : < 3 ATP par glucose consommé mais… s’il n’y a pas d’accepteur d’électrons disponible : alternative à l’arrêt total du catabolisme ! strict équilibre entre oxydations et réductions mais… le carbone n’est que (très) partiellement assimilé et l’essentiel du carbone se trouve dans des produits non utilisés... sauf par les hommes !!! Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

QU’Y A-T-IL A RE-OXYDER ? REDUIRE ?
FERMENTATIONS PETITS RAPPELS : QU’Y A-T-IL A RE-OXYDER ? REDUIRE ? glycolyse (voie EMP) : voie des pentoses phosphates : voie d’Entner-Doudoroff : glucose + 2 (ADP + Pi) + 2 NAD+  2 pyruvate + 2 H2O + 2 ATP + 2 (NADH + H+) glucose + 1 H2O + 1 ATP + 2 NADP+  (1/3 pyruvate + 2/3 fructose ~ 6 P CO2 + 1 ATP + 2 (NADPH + H+) glucose + 1 (ADP + Pi) + NAD+ + NADP+  2 pyruvate + ATP + 1 (NADH + H+) + 1 (NADPH + H+) Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

FERMENTATIONS ALCOOLIQUES : SACCHAROMYCES CEREVISIAE
glucose 2 ATP 2 ADP fructose ~ 1,6 bis P trioses ~ P x 2 2 Pi 2 PEP 2 (NADH + H+) 2 NAD+ 2 H2O 2 pyruvate 2 ADP 2 ATP Imaginons qu’on se mette à faire des bilans de glycolyse lors d’un métabolisme fermentaire… glucose + 2 ADP + 2 Pi → 2 éthanol + 2 ATP + 2 CO2 + 2 H2O (la voie « classique » est : glucose + 2 ADP + 2 Pi + 4 NAD+ + 2 coA-SH → 2 acétyl-coA + 2 CO2 + 2 ATP + 4 (NADH + H+) + 2 H2O) Nous voyons bien qu’oxydations et réductions sont strictement équilibrés : aucune production de NADH + H+ ! Et seulement deux ATP produits… mais aussi de l’éthanol !! Cette fermentation concerne les jus sucrés et l’amidon (dans le cas du pain, le gaz carbonique va être à l’origine des trous dans la mie, puisqu’il se dilate au cours de la cuisson, et l’éthanol s’évaporera lors de la cuisson). 2 éthanol 2 CO2 2 acétaldéhyde Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

FERMENTATION HOMOLACTIQUE
FERMENTATIONS FERMENTATION HOMOLACTIQUE glucose fructose ~ 1,6 bis P 2 ATP 2 ADP trioses ~ P x 2 2 Pi 2 PEP 2 (NADH + H+) 2 NAD+ 2 H2O 2 pyruvate 2 ADP 2 ATP Encore un petit bilan (encore plus simple) à ne pas apprendre : glucose + 2 ADP + 2 Pi → 2 lactate + 2 ATP + 2 H2O Cette fermentation est à la base de très nombreux produits lactés (yaourts, fromages, …). 2 lactate Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

FERMENTATIONS ALCOOLIQUES :
ZYMOMONAS MOBILIS 6 P ~ gluconate ATP ADP H2O NADP+ NADPH + H+ céto-désoxy- 6 P ~ gluconate (KDPG) H2O glucose ??? Pi PEP NADH + H+ NAD+ Dans certains cas, des métabolismes plus complexes donnent des fermentations en apparence surprenantes : glucose + ADP + Pi + NADP+ + NADH + H+ → 2 éthanol + 1 ATP + 2 CO2 + 2 H2O + NADPH + H+ + NAD+ Donc : un seul ATP produit ; production de NADPH + H + et consommation de NADH + H+ !??? glycéraldéhyde ~ 3 P pyruvate pyruvate ADP ATP éthanol + CO2 éthanol + CO2 NADH + H+ NAD+ Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

INTERCONVERSION NADH - NADPH : LES TRANSHYDROGENASES
FERMENTATIONS INTERCONVERSION NADH - NADPH : LES TRANSHYDROGENASES NADPH +H+ NADP+ glucose H2O 6 P ~ gluconate NAD+ NADH + H+ pyruvate éthanol CO2 Encore un bel exemple de flexibilité métabolique : les bactéries peuvent réguler leurs stocks respectifs de NADPH + H+ et de NADH + H+, grâce à une enzyme appelée transhydrogénase : NADPH + H+ + NAD+  NADP+ + NADH + H+ Du coup, le bilan de la réaction précédent devient équilibré au niveau rédox : glucose + ADP + Pi → 2 éthanol + 1 ATP + 2 CO2 + 2 H2O Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

FERMENTATION HETEROLACTIQUE
FERMENTATIONS FERMENTATION HETEROLACTIQUE 6 P ~ gluconate ATP ADP H2O NADP+ NADPH + H+ glucose ribulose ~ 5 P NADP+ NADPH + H+ CO2 NADH + H+ NAD+ Pi PEP H2O xylulose ~ 5 P pyruvate ADP ATP acétyl ~ P 3 P ~ glycéraldéhyde Pi Encore plus tortueux, une fermentation à la sortie de la voie des pentoses phosphate, très utilisée également dans l’industrie laitière, et qui tourne elle aussi grâce à l’aide de la transhydrogénase : glucose + ADP + Pi → éthanol + lactate + 1 ATP + CO2 + 2 H2O Notons que la voie qui mène à l’éthanol peut s’arrêter en cours de route et produire des arômes importants, acétaldéhyde ou acétate (produit à partir de l’acétyl-phosphate moyennant une phosphorylation au niveau du substrat). acétyl-coA coA-SH acétaldéhyde NADH + H+ NAD+ éthanol NADH + H+ NAD+ lactate Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

D’AUTRES FERMENTATIONS...
fermentation du diacétyle Lactococcus lactis 3 citrate  lactate + 3 acétate + diacétyle + 5 CO2 fermentation propionique Propionibacterium 3 lactate  2 propionate + acétate + CO2 fermentation butyrique Clostridium butyricum glucose  butyrate + 2 CO2 + 2 H2 Les deux premières fermentations sont importantes en industrie laitière : le diacétyle est l’arôme de la crème et du beurre ; le propionate est responsable du goût piquant (qui s’intensifie avec l’affinage) des fromages à pâte pressée cuite comme le beaufort. Les autres fermentations sont amenées à devenir de plus en plus importantes avec l’épuisement progressif des ressources pétrolifères, car elles permettent de produire des molécules normalement issues de la pétrochimie (avec des sources de carbone qui peuvent être du glucose, bien sûr, mais aussi des molasses de betterave, de la cellulose, …). fermentation acéto-butanolique Clostridium acetobutylicum glucose  acétone + butanol + 5 CO2 + 4 H2 Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

… ET LA FERMENTATION ACETIQUE ! (CLOSTRIDIUM - ACETOBACTERIUM)
FERMENTATIONS … ET LA FERMENTATION ACETIQUE ! (CLOSTRIDIUM - ACETOBACTERIUM) glucose + 4 ADP + 4 Pi  3 acétate + 4 ATP glucose + 2 ADP + 2 Pi  2 pyruvate + 2 ATP + 2 (NADH + H+) 2 pyruvate + 2 coA-SH + 2 Fd  2 acétyl-coA + 2 CO2 + 2 FdH2 2 acétyl-coA + 2 ADP + 2 Pi  2 acétate + 2 coA-SH + 2 ATP CO2 CO2 + XH2  formate + X CO2 CO2 + XH2  [CO] + X + H2O formate + ATP + THF  10-formyl-THF + ADP + Pi 10-formyl-THF  5,10-méthényl-THF + H2O 5,10-méthényl-THF + NADH + H+  5,10-méthylène-THF + NAD+ 5,10-méthylène-THF + FdH2  5-méthyl-THF + Fd 5-méthyl-THF + E-B12  5-méthyl-E-B12 + THF D’accord, c’est compliquée… mais ne trouvez-vous pas que c’est beau !? Dans un premier temps, le glucose donne de l’acétyl-coA (glycolyse presque classique… on note que le coenzyme est ici une ferrédoxine), qui est converti en acétate moyennant production d’ATP. Mais le meilleur reste à venir : utiliser les électrons stockés au niveau de la ferrédoxine pour aller réduire les deux molécules de CO2 produites, afin de donner une troisième molécule d’acétate ! Bref, une utilisation extrêmement rationnelle du carbone et des électrons, qui se ressent au niveau énergétique : 4 ATP produits, plus que bon pour une fermentation !  5-méthyl-E-B12 + [CO] + coA-SH  acétyl-coA  acétyl-coA + ADP + Pi  acétate + coA-SH + ATP Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

FERMENTATION ACIDE-MIXTE
FERMENTATIONS ESCHERICHIA COLI : FERMENTATION ACIDE-MIXTE lactate succinate éthanol acétate CO2 H2 formate Et pour finir, les deux fermentations qui règnent dans nos intestins (fermentations des entérobactéries) : fermentation acide-mixte et fermentation butane-diol. Deux métabolismes tellement complexes dans leurs possibilités que l’idée même de bilan ne viendrait même pas au biochimiste le plus radical ! Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

KLEBSIELLA AEROGENES : FERMENTATION BUTANE-DIOL
FERMENTATIONS KLEBSIELLA AEROGENES : FERMENTATION BUTANE-DIOL Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

ENCORE LES POTENTIELS REDOX…
FERMENTATIONS ENCORE LES POTENTIELS REDOX… forme oxydée forme réduite E’0 (mV) NAD(P)+ NAD(P)H + H acétaldéhyde éthanol - 200 pyruvate lactate - 190 fumarate succinate + 31 - 190 - (- 320) = + 130 - 320 - 190 Et, histoire de vous convaincre de la relation entre potentiels rédox et production d’énergie, voici le bilan rédox de la fermentation lactique : E’0 (NAD+/NADH + H+) = mV - E’0 (pyruvate/lactate) = mV  E’0 = (-320) = mV… contre mV pour la respiration aérobie et ( =) +204 mV pour la respiration sur soufre ! Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

ET SI L’ORIGINE DES ELECTRONS inorganiqueréd  inorganiqueox + e- + H+
CATABOLISMES ET SI L’ORIGINE DES ELECTRONS N’ETAIT PAS ORGANIQUE !? LITHOTROPHIE inorganiqueréd  inorganiqueox + e- + H+ + O2  H2O chaîne respiratoire Attention à bien sérier les problèmes : lithotrophie = source d’électrons inorganiques, et c’est tout ! Que deviennent ces électrons ? Le plus souvent, ils sont transférés dans la chaîne respiratoire, vers un accepteur final d’électrons qui sera souvent l’oxygène… mais aussi, par exemple, CO2 (cf. diapositive 88).  gradient de protons ATP ! Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

LITHOTROPHIE SOURCES D’ELECTRONS INORGANIQUES H2  2 H+ + 2 e- Pseudomonas saccharophila Ralstonia eutropha  2 H+ + 2 e- + ½ O2  H2O CO + H2O  CO2 + 2 H+ + 2 e- Pseudomonas carboxydovorans 2 Fe2+  2 Fe e- Thiobacillus ferrooxidans Qui dit molécules inorganiques dit des substrats qu’on a du mal à considérer comme tels… mais les bactéries qui les utilisent sont très efficaces, et intéressent les spécialistes des biotechnologies (imaginez une pile à hydrogène… sans parler de l’utilisation millénaire de Thiobacillus ferrooxidans pour la lixiviation !). nitrification oxydation du soufre Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

LITHOTROPHIE NITRIFICATION oxydation de l’ammoniaque Nitrosomonas NH4+ + 1½ O2  NO H+ + H2O NH3 + O2 + XH2  NH2OH + X + H2O  NH2OH  [NOH] + 2 H+ + 2 e-  [NOH] + X + ½ O2 + H+ + 2 e-  NO2- + XH2 oxydation du nitrite Nitrobacter Plaie des régions à forte production maraîchère, telle la Bretagne, la présence de nitrates (et nitrites) dans les sources et nappes phréatiques résulte d’une activité microbienne, et bien sûr de l’apport dans les sols de substrats adéquats, engrais ou lisiers de porc, riches en ammoniaque ! Contrairement à la dénitrification, réalisable par une seule bactérie, aucune bactérie ne peut, seule, produire du nitrate à partir de l’ammoniaque : certaines bactéries oxyderont l’ammoniaque en nitrite, qu’elles excréteront dans l’environnement, où il sera récupéré par d’autres bactéries capable de l’oxyder en nitrate. Ammoniaque et nitrite sont des sources d’électrons, électrons qui seront alors envoyés dans la chaîne respiratoire de la bactérie jusqu’à l’oxygène (ici, pas de respiration sur le nitrate ou le nitrite produit). NB : NH2OH = hydroxylamine ; dans le cas de l’oxydation de l’ammoniaque, il est probable que XH2 soit un cytochrome P460. NO2- + ½ O2  NO3- Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

LITHOTROPHIE OXYDATION DU SOUFRE S O2  SO42- Thiobacillus S H2O  SO H+ + 8 e- S2-  [S] + 2 e-  [S] + 3 H2O  SO H+ + 4 e-  SO32- + H2O  SO H+ + 2 e-  8 H+ + 8 e- + 2 O2  4 H2O S0 + H2O + 1½ O2  H2SO (S0  [S]) Thiobacillus S0 + 4 H2O  SO H+ + 6 e-  6 H+ + 6 e- + 1½ O2  3 H2O Voici quelques exemples d’utilisation de molécules soufrées comme sources d’électrons. Vous constaterez que, eu égard au produits finaux de ces métabolismes (sulfate et protons), ces bactéries baignent dans des milieux très acides (pH de l’ordre de 1) : on les dits acidophiles ! NB : S2O32- = thiosulfate ; S2- = sulfure ; [S] = sulfure ; SO32- = sulfite S2O32- + H2O + 2 O2  H2SO4 + SO42- Thiobacillus S2O H2O  2 SO H+ + 8 e-  8 H+ + 8 e- + 2 O2  4 H2O Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

PHOSPHORYLATION AU NIVEAU DU SUBTRAT
LITHOTROPHIE OXYDATION DU SOUFRE ET PHOSPHORYLATION AU NIVEAU DU SUBTRAT S H2O + AMP + Pi  SO42- + ADP + 6 H+ + 8 e- S2-  [S] + 2 e-  [S] + 3 H2O  SO H+ + 4 e-  SO32- + AMP  APS + 2 e-  APS + Pi  SO42- + ADP Mieux, les bactéries qui oxydent le soufre sont capables de produire de l’énergie de deux façons : phosphorylation oxydative (les électrons circulant dans la chaîne respiratoire membranaire avant d’arriver sur l’oxygène) ; phosphorylation au niveau du substrat, le sulfite produit passant par l’étape APS pour donner du sulfate ! Donc, autant la respiration sur sulfate est une mauvaise affaire d’un point de vue énergétique, autant la production de sulfate est, elle, intéressante.  SO ½ O2  3 H2O S2- + 1½ O2 + AMP + Pi  SO42- + ADP + 2 e- Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

L’OXYDATION DU SOUFRE ET DU FER, BASE DE LA LIXIVIATION
LITHOTROPHIE L’OXYDATION DU SOUFRE ET DU FER, BASE DE LA LIXIVIATION 2 FeS2 + 7½ O2 + H2O  Fe2(SO4)3 + H2SO4 2 CuFeS2 + 8½ O2 + H2SO4  Fe2(SO4)3 + 2 CuSO4 + H2O UO2 + Fe2(SO4)3  (UO2)SO4 + 2 FeSO4 Surtout, les bactéries capables d’oxyder le soufre et les métaux, en particulier le fer, peuvent conjuguer cette double activité pour le plus grand bonheur de l’industrie minière. Il s’agit ici du lessivage des minerais, ou lixiviation, activité pratiquée depuis des millénaires et qui permet d’augmenter fortement les rendements d’extractions minières (25% de la production annuelle de cuivre résulte de cette pratique), mais dont la compréhension scientifique (c.a.d. la mise en évidence du rôle joué par des bactéries) date seulement des années 1950. Ainsi, l’oxydation de la pyrite (FeS2 (minerai de fer)),forme insoluble du fer liée à la roche, produit elle du sulfate ferreux (Fe2(SO4)3), c.a.d. du FeIII qui sera à la fois soluble sous cette forme… et précipitable une fois le sulfate éliminé ! Il en est de même pour l’oxydation du chalcopyrite (CuFeS2), qui donnera du sulfate de cuivre, ou du dioxyde d’uranium (UO2), qui donnera elle de l’uranyle (UO22+). Certains chercheurs ont même mis au point des procédés utilisables pour des métaux à haute valeur ajoutée comme l’or : on parle maintenant de biométallurgie. BIOX® : la lixiviation au service de l’extraction d’or (bioleaching) Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

LITHOTROPHIE POTENTIELS REDOX : GROS PROBLEME !!! forme oxydée forme réduite E’0 (mV) SO42- SO32- + H2O - 516 2 H+ H NAD(P)+ NAD(P)H + H FAD FADH SO32- S0 - 38 NO2- NH NO3- NO Fe3+ Fe ½ O2 H2O + 815 - 320 - 421 = - 741 -320 A l’exception des bactéries qui oxydent l’hydrogène, les lithotrophes posent un problème quant à la production de pouvoir réducteur : en effet, les molécules oxydées ont un potentiel rédox supérieur à celui du couple NAD(P)H + H+ / NAD(P)+, et aucun coenzyme réduit n’est produit lors de leur oxydation !? Seule solution… faire transiter une partie des électrons injectés dans la chaîne respiratoire EN SENS INVERSE, moyennant bien évidemment une consommation d’énergie !!! 815 - 421 = 394 + 421 +815 Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

AUTOTROPHIE : « FIXER » LE CARBONE
LITHOTROPHIE AUTOTROPHIE : « FIXER » LE CARBONE pour transformer CO2 en carbone organique (trioses), il faut :  énergie  pouvoir réducteur (réduire CO2)  enzymes : cycle de Calvin OU… cycle TCA inversé ! l’énergie mise en jeu peut être d’origine  chimique (chimiolithotrophes autotrophes)  lumineuse (photolithotrophes autotrophes, photohétérotrophes organotrophes) le pouvoir réducteur est d’origine  minérale (chimio- et photolithotrophes autotrophes)  organique (photohétérotrophes organotrophes) Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

UTILISATION DE L’ENERGIE LUMINEUSE : DEUX PHASES DISTINCTES
CATABOLISMES UTILISATION DE L’ENERGIE LUMINEUSE : LES PHOTOSYNTHESES DEUX PHASES DISTINCTES captage de l’énergie lumineuse (photons) par une antenne collectrice (spectre variable) lumineuse ! + conversion de l’énergie lumineuse (photons) en énergie chimique (ATP, NADH + H+) Les photons apportent l’énergie nécessaire au transit des électrons du couple rédox le plus oxydant vers le couple le plus réducteur, c.a.d. à l’inverse du système de transport des électrons de la chaîne respiratoire ! Attention : la phase obscure ne s’effectue pas obligatoirement à l’obscurité, bien au contraire… ce terme désigne un métabolisme impliqué dans la photosynthèse mais qui ne met pas en jeu la lumière (d’ailleurs, on retrouve ce métabolisme chez les fixateurs de carbone non photosynthétiques…) ! obscure !? utilisation de l’énergie produite pour réduire (fixer) CO2 (ou autre source de carbone) et synthétiser les constituants cellulaires Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

UNE PHASE LUMINEUSE PRIMITIVE CHEZ LES HALOBACTERIES
PHOTOSYNTHESES UNE PHASE LUMINEUSE PRIMITIVE CHEZ LES HALOBACTERIES hn H+ 3 H+ ATPase bactério rhodopsine Avant même de regarder les photosynthèses microbiennes, voici un modèle simple à l’extrême, trouvé chez l’un des trois groupes d’Archaea, les halobactéries. Ces bactéries ne vivent que dans les milieux fortement salins (dans un milieu de culture classique, elles meurent) : leur paroi est riche en glutamate et aspartate, et les nombreuses charges négatives présentes à leur surface, si elles ne sont pas neutralisées par interaction ionique avec Na+, se repoussent tant et si bien que la paroi va se craqueler et laisser l’eau pénétrer dans la cellule qui va alors éclater ! Ces bactéries possèdent un pigment membranaire appelé bactériorhodopsine, voisin de la rhodopsine de nos cellules rétiniennes ! Ici, pas de transmission de signal nerveux suite à la photoactivation du pigment, bien évidemment, mais une stimulation qui va aboutir à une expulsion de protons, et donc à la mise en place d’une force proton-motrice qui sera ) l’origine de la synthèse d’ATP. Aussi simple que ça ! ADP + Pi ATP Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

DES BACTERIES FRANCHEMENT ROUGES
PHOTOSYNTHESES DES BACTERIES FRANCHEMENT ROUGES Deux photos de vacances (celle de droite, ce sont les marais salants vus des remparts d’Aigues Mortes) : si l’eau, riche en sel (notez les concrétions salines) est violacée, voire franchement rouge, ne cherchez pas, ceci témoigne de la présence de bactéries photosynthétiques halophiles, à la pigmentation rouge caractéristique ! Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CHEZ LES BACTERIES PHOTOSYNTHETIQUES :
PHOTOSYNTHESES LA PHASE LUMINEUSE CHEZ LES BACTERIES PHOTOSYNTHETIQUES : PRINCIPES GENERAUX l’ATP est généré presque exclusivement par photophosphorylation le pouvoir réducteur provient de sources d’électrons variables  bactéries sulfureuses  bactéries non sulfureuses  cyanobactéries (H2O) Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CHEZ LES BACTERIES PHOTOSYNTHETIQUES :
PHOTOSYNTHESES LA PHASE LUMINEUSE CHEZ LES BACTERIES PHOTOSYNTHETIQUES : PRINCIPES GENERAUX localisation des photosystèmes : membrane plasmique, éventuellement invaginée, voire structures membranaires intracytoplasmiques bactéries pourpres : « tubes » invaginés bactéries vertes : chlorosomes cyanobactéries : phycobilisomes (+ pseudo-thylacoïdes) Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

PHOTOPHOSPHORYLATIONS CYCLIQUE ET NON-CYCLIQUE
PHOTOSYNTHESES PHOTOPHOSPHORYLATIONS CYCLIQUE ET NON-CYCLIQUE Après excitation du photosystème par les photons, les électrons activés sont injectés dans le STE, ce qui entraîne le pompage de protons vers le périplasme (alternance transporteurs d’électrons / transporteurs de protons et d’électrons) A la sortie du STE, les électrons sont dirigés vers un accepteur : photophosphorylation non-cyclique (photosynthèse oxygénique uniquement) A la sortie du STE, les électrons sont réinjectés dans le STE : photophosphorylation cyclique (le donneur primaire d’électrons est également l’accepteur final… les électrons tournent en rond !) Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CHEZ LES BACTERIES POURPRES :
PHOTOSYNTHESES LA PHASE LUMINEUSE CHEZ LES BACTERIES POURPRES : PHOTOSYSTEME II antenne collectrice : caroténoïdes 400/550 nm bactériochlorophylle a 850/910 nm ou bactériochlorophylle b 1020/1035 nm centre réactionnel : 2 x 2 bactériochlorophylles P870 2 x bactériophéophytine STE : complexe fer-quinone cytochromes b et c1 (centre Fe/S) cytochrome c2 + ubiquinone Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CHEZ LES BACTERIES POURPRES
PHOTOSYNTHESES LA PHASE LUMINEUSE CHEZ LES BACTERIES POURPRES Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CHEZ LES BACTERIES POURPRES
PHOTOSYNTHESES LA PHASE LUMINEUSE CHEZ LES BACTERIES POURPRES NAD+ + 2 H+ NADH + H+ hn 2 H+ centre réactionnel b + c1 Fe-Q UQ 2 H+ c2 Double transfert transmembranaire de protons : synthèse NADH + H+ + photolyse de XH2 ubiquinone = transporteur de protons et d’électrons XH2 X + 2 H+ c2 Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CHEZ LES BACTERIES POURPRES :
PHOTOSYNTHESES LA PHASE LUMINEUSE CHEZ LES BACTERIES POURPRES : SOURCES D’ELECTRONS bactéries pourpres sulfureuses Thiocapsa, Chromatium XH2 = H2  2 H+ + 2 e- H2S  2 H+ + S2- S0 (accumulation intracellulaire) composés organiques (AA, sucres, acides, …) … Les bactéries pourpres non sulfureuses peuvent pousser à l’obscurité (chimiotrophie) ! bactéries pourpres non sulfureuses Rhodopseudomonas XH2 = H2 (H2S) composés organiques (AA, sucres, acides, …) … Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

LES BACTERIES POURPRES SONT AUSSI
PHOTOSYNTHESES LES BACTERIES POURPRES SONT AUSSI CHIMIOTROPHES La bactérie Rhodopseudomonas palustris a été cultivée : à gauche, dans l'obscurité ; au milieu, sous 660 nm et à droite sous 740 nm. La coloration rouge qui indique la synthèse de l'appareil photosynthétique a été induite par l'action du bactériophytochrome. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

LES BACTERIES POURPRES SONT AUSSI
PHOTOSYNTHESES LES BACTERIES POURPRES SONT AUSSI CHIMIOTROPHES Deux comportements possibles : pendant la journée, la chaleur fait s‘évaporer l’eau, et l’oxygène dissous est de moins en moins disponible dans une eau chargée en sel  induction de la synthèse de pigments photosynthétiques (les bactéries deviennent rose/rouge)  phototrophisme ; quand le soleil n’est plus là, l’eau ne s’évaporant plus, l’oxygène redevient plus accessible, et la bactérie passe alors à un métabolisme chimiotrophe (respiration aérobie). Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CHEZ LES BACTERIES VERTES :
PHOTOSYNTHESES LA PHASE LUMINEUSE CHEZ LES BACTERIES VERTES : PHOTOSYSTEME I antenne collectrice : caroténoïdes 400/550 nm bactériochlorophylle a 805/810 nm et bactériochlorophylle c 745/760 nm ou bactériochlorophylle d 725/745 nm ou bactériochlorophylle e 715/725 nm centre réactionnel : 2 x 2 bactériochlorophylles P840 2 x protéine Fe/S STE : ferrédoxine cytochromes b + protéine Fe/S cytochrome c553 + ménaquinone Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CHEZ LES BACTERIES VERTES
PHOTOSYNTHESES LA PHASE LUMINEUSE CHEZ LES BACTERIES VERTES NAD+ + 2 H+ NADH + H+ hn centre réactionnel b + Fe/S Fd MQ c553 Moins de fpm que chez les bactéries pourpres (car pas de transporteur de protons + électrons), mais potentiel rédox 5 fois plus électronégatif (-500 contre – 100 mV), donc plus énergétique pour une même fpm ! XH2 X + 2 H+ c553 Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

PHOTOSYNTHESES LA PHASE LUMINEUSE CHEZ LES BACTERIES VERTES Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CHEZ LES BACTERIES VERTES :
PHOTOSYNTHESES LA PHASE LUMINEUSE CHEZ LES BACTERIES VERTES : SOURCES D’ELECTRONS bactéries vertes sulfureuses Chlorobium XH2 = H2S  2 H+ + S2- S0 (accumulation extracellulaire) … bactéries vertes non sulfureuses Chloroflexus XH2 = H2 (H2S) composé organique (AA, sucre, acide, …) Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CHEZ LES CYANOBACTERIES :
PHOTOSYNTHESES LA PHASE LUMINEUSE CHEZ LES CYANOBACTERIES : PHOTOSYSTEMES I ET II antenne collectrice : caroténoïdes 400/550 nm chlorophylle a 665 (+ 430) nm phycobilines = phycoérythrine 550 nm = phycocyanine 620/640 nm centres réactionnels : PSII  chlorophylle P680 PSI  chlorophylle P700 STE : plastoquinone cytochromes b6 et f plastocyanine Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CHEZ LES CYANOBACTERIES
PHOTOSYNTHESES LA PHASE LUMINEUSE CHEZ LES CYANOBACTERIES Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

CHEZ LES CYANOBACTERIES
PHOTOSYNTHESES LA PHASE LUMINEUSE CHEZ LES CYANOBACTERIES Electron flow in oxygenic (green plant) photosynthesis, the “Z” scheme. Two photosystems (PS) are involved, PS I and PS II. Ph, Pheophytin; Q, quinone; Chl, chlorophyll a; Cyt, cytochrome; PC, plastocyanin; FeS, nonheme iron-sulfur protein; Fd, ferredoxin; Fp, flavoprotein; P680 and P700 are the reaction center chlorophylls of PS II and PS I, respectively. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

PHASE OBSCURE CHEZ LES CYANOBACTERIES ET LES BACTERIES POURPRES
PHOTOSYNTHESES PHASE OBSCURE CHEZ LES CYANOBACTERIES ET LES BACTERIES POURPRES réduction du CO2 via le cycle de Benson et Calvin (rôle essentiel de la RubisCO) nécessite CO2, ATP et NADPH + H+ Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

PHASE OBSCURE CHEZ LES CYANOBACTERIES ET LES BACTERIES POURPRES
PHOTOSYNTHESES PHASE OBSCURE CHEZ LES CYANOBACTERIES ET LES BACTERIES POURPRES The Calvin cycle. For each six molecules of CO2 incorporated, one fructose 6-phosphate is produced. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

PHOTOSYNTHESES PHASE OBSCURE CHEZ LES BACTERIES VERTES la réduction du CO2 fait intervenir le cycle de l’acide citrique… qui tourne à l’envers ! cycle réducteur des acides tricarboxyliques nécessite CO2 et ferrédoxine réduite Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

PHOTOSYNTHESES PHASE OBSCURE CHEZ LES BACTERIES VERTES Unique autotrophic pathways in phototrophic green bacteria. (a) The reverse citric acid cycle is the mechanism of CO2 fixation in the green sulfur bacterium Chlorobium. Ferredoxinred indicates carboxylation reactions requiring reduced ferredoxin (2 H each). Reduced ferredoxin is generated in Chlorobium by light-driven reactions. Starting from oxalacetate, each turn of the cycle results in three molecules of CO2 being incorporated and pyruvate as the product. The cleavage of citrate by the ATP-dependent enzyme citrate lyase regenerates the C4 acceptor oxalacetate and produces acetyl-CoA for biosynthesis. The conversion of pyruvate to phosphoenolpyruvate consumes two high-energy phosphate bond equivalents. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

PHOTOSYNTHESES PHASE OBSCURE CHEZ LES BACTERIES VERTES Unique autotrophic pathways in phototrophic green bacteria. (b) The hydroxypropionate pathway is the means of autotrophy in the green nonsulfur bacterium Chloroflexus. Acetyl-CoA is carboxylated twice to yield methylmalonyl-CoA. This intermediate is rearranged to yield acetyl-CoA and glyoxylate. The latter is converted to cell material probably through a serine or glycine intermediate. Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

LITHOTROPHIE CYCLE DE L’AZOTE Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

LITHOTROPHIE CYCLE DU SOUFRE Mars/Avril 2010 Yves Markowicz - LAPM (CNRS UMR 5163) - Université J. Fourier

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