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Spectroscopie infrarouge impulsionnelle appliquée au transfert de ligands dans les hémoprotéines Thèse Présentée par Thomas Polack préparée au Laboratoire.

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1 Spectroscopie infrarouge impulsionnelle appliquée au transfert de ligands dans les hémoprotéines Thèse Présentée par Thomas Polack préparée au Laboratoire dOptique et Biosciences Directrice de thèse Antigoni Alexandrou

2 Transfert de ligands dans les hémoprotéines Différentes approches expérimentales Expériences pompe-sonde spectralement intégrées Résultats expérimentaux Analyse et Interprétation Détection du champ émis Mise en oeuvre Expérience Conclusions et Perspectives Plan de la présentation

3 Transfert de ligands dans les hémoprotéines Approches expérimentales Expériences pompe-sonde spectralement intégrées Résultats expérimentaux Analyse et Interprétation Détection du champ émis Mise en oeuvre Expérience Conclusions et Perspectives Plan de la présentation

4 F. Schotte, M. Lim, T. A. Jackson, A. V. Smirnov, J. Soman, J. S. Olson, G. N. Phillips Jr., M. Wulff, P. Anfinrud, Science 300, 1944 (2003). Transfert de ligands Transport, stockage, catalyse enzymatique, détection de ligands Liaison du ligand à lhème fonction de la protéine Dynamique du transfert du ligand site de liaison extérieur Sonder le transfert : rayons X absorption transitoire visible transitions électroniques de lhème absorption transitoire infrarouge vibration du ligand

5 Motivations Compréhension du processus de transfert entre la poche de lhème et lextérieur de la protéine Premières étapes du transfert Accès aux caractéristiques vibrationnelles du ligand aux temps courts Détection du champ émis : intervention de mouvements concertés dans le processus de transfert

6 Olson et al. Biochemistry (1994) Elber et al. Biophys. J. (1998) CO lié à lhème CO au docking-site Transfert C O Côté proximal Côté distal B1 Myoglobine : de lhème au docking-site Dissociation déclenchée par une impulsion pompe visible dans la bande de Soret à 400 nm.

7 CO lié à lhème CO sur le docking-site Anfinrud et al., Nat. Struct. Biol. (1997) Anfinrud et al. J. Chem. Phys. (1995) Δα B1 B2 Caractéristiques infrarouges du transfert Δα Ligand CO Vibration en dehors du continuum des autres modes vibrationnels de la protéine Forte absorption Modification de la vibration cm -1 Diminution force doscillateur dun facteur 30 Changement dorientation Temps de déphasage ~1ps

8 Effets de polarisation perturbée T 2 ~1ps Délai pompe-sonde négatif Polarisation perturbée par la pompe Oscillations spectrales Dynamique aux temps courts Transmission différentielle intégrées spectralement signal faible Détection du champ émis M. Joffre et al. Opt. Lett Domaine temporel Domaine spectral Polarisation P Polarisation perturbée par la pompe P

9 Transfert de ligands dans les hémoprotéines Approches expérimentales Expériences pompe-sonde spectralement intégrées Résultats expérimentaux Analyse et Interprétation Détection du champ émis Mise en oeuvre Expérience Conclusions et Perspectives Plan de la présentation

10 Montage expérimental Signal Idler RegA Coherent Mira Coherent 200 kHz, 150 fs 4 µJ Regen. Amp. Oscillator RegA Coherent Mira Coherent 200 kHz, 150 fs 4 µJ Regen. Amp. Oscillator RegA Coherent Vitesse Coherent 100 kHz, 150 fs OPA µm 100 nJ 6 µJ Amplificateur Régénératif 80 MHz, 100 fs 800 nm, 5 nJ Oscillateur BBO Verdi 10 W Translation-Rotation de léchantillon Pompe 400 nm 200 fs 250 nJ AgGaS 2 BBO Délai pompe-sonde /2 Détecteur HgCdTe IR Interféromètre Différence de fréquence 3-18 µm, 250 fs, 40 pJ = 100 cm -1

11 Transfert de ligands dans les hémoprotéines Approches expérimentales Expériences pompe-sonde spectralement intégrées Résultats expérimentaux Analyse et Interprétation Détection du champ émis Mise en oeuvre Expérience Conclusions et Perspectives Plan de la présentation

12 Intégration spectrale Faible signal D é lai pompe-sonde (ps) T/T x 10 5 Premiers résultats expérimentaux Nécessité daméliorer du rapport signal à bruit

13 Montage expérimental Signal Idler RegA Coherent Mira Coherent 200 kHz, 150 fs 4 µJ Regen. Amp. Oscillator RegA Coherent Mira Coherent 200 kHz, 150 fs 4 µJ Regen. Amp. Oscillator RegA Coherent Vitesse Coherent 100 kHz, 150 fs OPA µm 100 nJ 6 µJ Amplificateur Régénératif 80 MHz, 100 fs 800 nm, 5 nJ Oscillateur BBO Verdi 10 W Translation- Rotation de léchantillon Pompe 400 nm 200 fs 250 nJ AgGaS 2 BBO Délai pompe-sonde /2 Détecteur HgCdTe IR Interféromètre

14 AgGaS 2 Détecteur HgCdTe IR Détection différentielle infrarouge Hacheur mécanique haute fréquence Intensité de référence Echantillon Faisceau pompe 50 kHz Intensité sonde transmise Intensité de référence Laser (100 kHz) Détection synchrone

15 Transfert de ligands dans les hémoprotéines Approches expérimentales Expériences pompe-sonde spectralement intégrées Résultats expérimentaux Analyse et Interprétation Détection du champ émis Mise en oeuvre Expérience Conclusions Plan de la présentation

16 nombre donde ( cm -1 ) CO sur le docking site CO lié à lhème cm -1 Nombre donde Intensité (unités arbitraires) Sondes Infrarouges et absorption du ligand Sonde = 100 cm -1

17 x Délai pompe-sonde (fs) Fréquence initiale 1945 cm -1 Fréquence finale 2120 cm -1 Fréquence intermédiaire 2060 cm -1 -ΔT/T Aucun signal observé dans deoxymyoglobine Transmission différentielle dans MbCO Pompe 400 nm Sonde IR

18 Absorption différentielle Angle Magique Pompe 400 nm Sonde IR Fréquence initiale Fréquence finale -4

19 Transfert de ligands dans les hémoprotéines Approches expérimentales Expériences pompe-sonde spectralement intégrées Résultats expérimentaux Analyse et Interprétation Détection du champ émis Mise en oeuvre Expérience Conclusions Plan de la présentation

20 Modèle Phénoménologique : Polarisation induite linéairement par la sonde Modèle à 2 niveaux équations de Bloch Variation fréquence force doscillateur temps de déphasage orientation Simulations

21 Changement instantané de force doscillateur Changement abrupt de la force doscillateur nest pas compatible avec lexpérience Fréquence initiale Fréquence finale -4 Expérience Simulation

22 Changement progressif de force doscillateur Temps caractéristique de la diminution de la force doscillateur : 400 fs Fréquence initiale Fréquence finale -4 Expérience Simulation

23 Changement de fréquence vibrationnelle progressif Moins bon accord avec les expériences Fréquence initiale Fréquence finale -4 Expérience Simulation

24 Effet dun élargissement spectral Influence faible pour un élargissement inférieur à la largeur du spectre de sonde Fréquence initiale Fréquence finale -4 Avec élargissement Sans élargissement

25 Expériences intégrées spectralement Changement de fréquence quasi- instantané Diminution progressive de la force doscillateur Faible influence de lélargissement spectral Nouvelle observation Compatible avec les résultats de Anfinrud et al Indicateur de la distance Hème-CO Nécessité de calculs de force doscillateur Utilisation de la force dabsorption comme sonde du transfert

26 Transfert de ligands dans les hémoprotéines Approches expérimentales Expériences pompe-sonde intégrées spectralement Résultats expérimentaux Analyse et Interprétation Détection du champ émis Mise en oeuvre Expérience Conclusions Plan de la présentation

27 E T = E I + E R t E Incident E Rayonné Champ émis E R Transmission |E T | 2 E Transmis Champ transmis et Champ rayonné

28 Expériences de détection du champ émis E excitation E POMPE E référence Nécessité dun contrôle de la phase ref exc

29 Transfert de ligands dans les hémoprotéines Approches expérimentales Expériences pompe-sonde spectralement intégrées Résultats expérimentaux Analyse et Interprétation Détection du champ émis Mise en oeuvre Expérience Conclusions Plan de la présentation

30 Montage expérimental Signal Idler RegA Coherent Mira Coherent 200 kHz, 150 fs 4 µJ Regen. Amp. Oscillator RegA Coherent Mira Coherent 200 kHz, 150 fs 4 µJ Regen. Amp. Oscillator RegA Coherent Vitesse Coherent 100 kHz, 150 fs OPA µm 100 nJ 6 µJ Amplificateur Régénératif 80 MHz, 100 fs 800 nm, 5 nJ Oscillateur BBO Verdi 10 W Translation-Rotation de léchantillon Pompe 400 nm 200 fs 250 nJ AgGaS 2 BBO Délai pompe-sonde /2 Détecteur HgCdTe IR Interféromètre

31 Montage expérimental AgGaS 2 Détecteur HgCdTe échantillon AgGaS 2 Deux générations IR Phase relative difficile à stabiliser Modification de la configuration expérimentale

32 HeNe PZT Microcontrôleur Montage expérimental AgGaS 2 Détecteur HgCdTe échantillon Impulsion de référence engendrée dans le même cristal Interferomètre asservi Impulsions vérouillées en phase Impulsion de référence engendrée dans le même cristal Interferomètre asservi Impulsions vérrouillées en phase Détection synchrone à la somme de fréquence f pompe + f excitation Détection synchrone f pompe f excitation

33 Deux approches possibles Détection homodyne référencée Détection homodyne auto-référencée facilité de mise en oeuvre

34 Transfert de ligands dans les hémoprotéines Approches expérimentales Expériences pompe-sonde spectralement intégrées Résultats expérimentaux Analyse et Interprétation Détection du champ émis Mise en oeuvre Expérience Conclusions et Perspectives Plan de la présentation

35 Expérience de détection du champ émis pompe référence excitation t pompe référence excitation t 500 fs Expériences de détection du champ émis Changement avec la phase Contribution pompe-sonde Impulsion excitatrice

36 Transfert de ligands dans les hémoprotéines Approches expérimentales Expériences pompe-sonde spectralement intégrées Résultats expérimentaux Analyse et Interprétation Détection du champ émis Mise en oeuvre Expérience Conclusions et Perspectives Plan de la présentation

37 Conclusions Expériences pompe-sonde spectralement intégrées Mesure labsorption intégrée et le décalage en fréquence Expérience adaptée aux grands changements de fréquence > 100 cm -1 (myoglobine) Mise en évidence dune décroissance non-instantanée de la force doscillateur, cest une nouvelle observation Utilisation de cette force doscillateur comme sonde du transfert Expériences de détection du champ émis Démonstration expérimentale Expérience adaptée aux faibles changements de fréquence et transfert cohérent

38 Etude du transfert de ligand dans diverses hémoprotéines à laide des méthodes développées Expérience de détection du champ émis dans la cytochrome c oxydase Perspectives Ursula Liebl and Gérard Lipowski and Michel Négrerie and Jean-Christophe Lambry and Jean-Louis Martin and Marten H. Vos, Nature 401 (1999) Fe = cm -1 Cu =2062 cm -1


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