Détection optique de biomolécules uniques

Présentation au sujet: "Détection optique de biomolécules uniques"— Transcription de la présentation:

1 Détection optique de biomolécules uniques
Maxime Dahan Laboratoire Kastler Brossel Département de physique Ecole normale supérieure

2 Mesure de l’activité enzymatique

3 Mesure optique de l’activité d’une cholestérol oxydase
réduit (compatible avec une réaction en deux étapes) Lu et al., Science (1998)

4 Résolution/Localisation

5 Résolution spatiale vs Localisation
localisation spatiale : déterminée par la précision de pointé du centre de la PSF (réponse impulsionnelle du système optique)

6 Résolution spatiale Pour un bon objectif: NA = 1.4, R = 250 nm

7 PSF expérimentale Taille pixel : 216 nm
Yildiz et al., taille du pixel: 86 nm Taille pixel : 216 nm

8 Réponse impulsionnelle
Une molécule unique peut être considérée comme une source ponctuelle pour le système optique. La réponse impulsionnelle (la PSF, point spread function) est une fonction d’Airy, souvent approximée par une courbe gaussienne 2D. Rayon d’Airy (premier zéro) : Fonction d’Airy Gaussienne Gaussienne 2D : où NA = 1.45, l = 600 nm

9 Localisation La précision du pointé dépend de la capacité à déterminer la position du pic De manière générale, la précision s dépend de : nombre de photons collecté N taille a des pixels niveau de bruit b Dans le cas d’un signal dominé par le bruit de photons:

10 Explication qualitative
On imagine que le point d’arrivée Xi de chaque photon peut être localisé sur le détecteur avec une précision infinie (pixel infiniment petit). On collecte N photons dont la distribution des positions (Xi) correspond à la PSF (de position moyenne m et de largeur s). On a un estimateur de la position moyenne.

11 Mouvement d’un moteur moléculaire : la myosin V
Myosin V Walks Hand-Over-Hand: Single Fluorophore Imaging with 1.5-nm Localization: A. Yildiz et al., Science 300, (2003 ).

12 Déplacement de la myosin
CY3 Déplacement de la myosin

13 Mouvement de la kinésine
Yildiz, Science (2004)

14 Peut-on gagner en résolution ?
si il existe un moyen de distinguer les deux objets : spectre d’émission, durée de vie, polarisation,… Lacoste, PNAS (2000) Si deux fluorophores identiques: photobleaching Gordon et al., PNAS (2004)

15 PhotoActivated Localization Microscopy (PALM)
Photoactivation of a few PA-GFP tagged molecules with a blue laser at 405 nm Detection, localization (with nm resolution) and photobleaching with a laser at 488 nm

16 Current limitations: long aquisition time (hours) no z resolution

17 Les « motility assays » myosine/actine kinésine/microtubules Protéines/ADN

18 Interactions ADN-Protéines: visualisation optique en molécules uniques
Mesurer des interactions qui ne se traduisent pas par un changement de longueur de l’ADN Ex: mécanisme de reconnaissance des sites d’activité (polymérase, endonuclease,…) Etudier des propriétés qui dépendent de la séquence

19 Location of target sites by DNA-binding proteins: a long-standing biological question
Site-specific proteins must locate short targets on long DNA molecules. The location can be much faster than predicted by 3D diffusion. Ex: Lac repressor (Riggs 1970): experiments  kA>1010 M.s-1 (kA~108 M.s-1 expected) Proposed mechanisms involve interactions with non-target DNA: sliding : correlated motion along DNA hopping : small jumps between non-adjacent sites jumping : jumps between distant DNA sites

20 Stretching DNA Transverse fluctuations Wide field: stretched DNA
of a DNA molecule Exposure time: 20 ms. Wide field: stretched DNA molecules Exposure time: 200 ms. A. Crut et al.,Phys. Rev. E 67, (2003)

21 Experimental results Interaction between EcoRV and DNA:
(a) T7 DNA/SybrGreen (b) Qdot-EcoRV qdot 605 nm Exposure time: 20 ms Analysis of the trajectories: (a) (b) 2D Gaussian fit: center of the PSF (10-20 nm) Transverse motion: DNA thermal fluctuations Longitudinal motion: DNA fluctuations + diffusion ?

22 Analyse des trajectoires : la fonction de déplacement quadratique moyen
Moyenne des déplacements quadratiques pendant Dt

23 Analyse des trajectoires : la fonction de déplacement quadratique moyen
Moyenne des déplacements quadratiques pendant 2Dt

24 Analyse des trajectoires : la fonction de déplacement quadratique moyen
Moyenne des déplacements quadratiques pendant 3Dt

25 Analyse des trajectoires : la fonction de déplacement quadratique moyen

26 Analysis of the transverse motion
Trajectory : DNA thermal fluctuations + motion of the enzyme To extract the 1D-diffusion : Mean Square Displacement Transverse motion : <(x(t+)-x(t))2> = 2sx2 (1-e-  / f )  2 sx2 (Desbiolles et al., unpublished)

27 Analysis of the longitudinal motion
Longitudinal motion: <(y(t+)-y(t))2> = 2 sy2 + 2D  Diffusion coefficient : D  mm2.s-1  (200 bp)2.s-1 (24 events) (qdot-EcoRV D3  10 mm2.s-1 )

28 Mesure en polarisation : étude de la dynamique rotationnelle de F1-ATPase

29 L’émission d’un dipole linéaire est polarisée
Permet de réperer l’orientation du fluorophore Récemment : développement de colorant bifonctionnel

30 Relation entre changement de conformation et fonction: approche par transfert d’énergie

31 Transfert d’énergie ~ 1 ps laser distance R molécule donneuse
acceptrice

32 Couplage dipole-dipole
Si r << l, seulement le champ proche: Terme de couplage:

33 Transfert d’énergie Taux de transfert kT :
R0 : rayon de Forster, en général de l’ordre de 5 nm tD: durée de vie de l’état excité du donneur en absence d’accepteur Efficacité du transfert : Mesure de distance à l’échelle: 0.5 R0 à 1.5 R0, soit entre 2.5 à 7.5 nm (comparable à la taille d’une protéine)

34 Rayon de Forster

35 Comment mesurer E ? mesure des intensités émises par le donneur et l’accepteur : mesure de la durée de vie du donneur : en l’absence d’accepteur en présence d’accepteur

36 Un vernier spectroscopique
Deniz et al. PNAS (1999)

37 Etude de conformation de biomolécules
Relier la dynamique des changements conformationels à la fonction: Ex: nuclease

38 Applications à l’étude du repliement des protéines
Paradoxe de Lévinthal: on considère une chaine peptidique de 100 a.a. et on fait l’hypothèse qu’il y a trois conformations possibles par a.a. et que chaque conformation est explorée pendant s Trep~ 1026 années !! Idée: Il existe des états intermédiaires qui sont de durées de vie brèves et sont difficilement accessibles par des mesures d’ensemble.

39 cold-shock protein from the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima
Bon système à deux états Schuler et al., Nature (2002) Mesure à l’équilibre : permet néanmoins de mettre une borne sur la barrière de potentiel.

40 Cinétique de repliement dans un mixeur microfluidique
La temps de mélange tm est déterminé par la diffusion transverse wf2/D dans le canal. L’évolution temporelle se lit selon la distance dans le canal. 10 µm L tm ~ 10 µs T = L/v Si v est très grand : pas le temps de faire des mesures sur molécules uniques Knight et al., PRL (1998)

41 Cinétique de repliement dans un mixeur microfluidique (2)
Lipman et al., Science (2003)

42 Visualisation de molécules uniques en cellules vivantes

43 Cells as interaction networks
a complex network of biochemical interactions: Kholodenko, Nat. Rev. Mol. Cell. Bio (2006) organized in time and in space Single molecule imaging

44

45 compartimentalisation membranaire

46 The fluid-mosaic model
Singer and Nicolson (1972) « fast » proteins diffuse with D ~ 0.1 µm²/s (movie from A. Kusumi’s lab)

47 Des molécules uniques comme des sondes de la membrane à l’échelle nanométrique

48 Tracking membrane proteins
for d < 1 µm, diffusion is not affected by the probe with diffusion in a 2D medium

49 Deux problèmes avec le modèle de mosaïque fluide
1. Diffusion dans la membrane plasmique est plus lente que dans une membrane modèle d’un facteur 5 à 50 diffusion d’un lipide dans une membrane modèle: D ~ 1 µm²/s diffusion d’un lipide dans la membrane plasmique: D ~ 0.1 µm²/s 2. Lors d’une oligomérization, la diffusion est considérablement ralentie

50 Modèle d’organisation en microdomaine
Murase et al. Biophys. J. (2004)

51 « Fence » and « Picket » Kusumi et al. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2005)

52 Morone et al. JCB (2006)

53 Dynamique de récepteurs aux neurotransmetteurs et plasticité synaptique

54 Transmission synaptique

55 Le récepteur de la Glycine
Cl - Canal ionique pour le chlore (inhibiteur) Glycine Composé de 5 sous-unités sous-unité a sous-unité b Interaction de la géphyrine avec les sous-unités b Gephyrine

56 Lateral dynamics of Glycine receptors
Change in the number of receptors at synapses during synaptic plasticity and synaptogenesis

57 Single quantum dot tracking of proteins in live neurons
Acquisition time: 75 ms Total time : 65 s Red : marker for synapses Dahan et al., Science (2003)

58 Single QD tracking directly reveals entry and exit of receptors at synapses
In red : marker for presynaptic vesicles (FM 4-64)

59 Dynamic equilibrium in the neuronal membrane: diffusion properties

60 Dynamic equilibrium in the neuronal membrane: kinetic parameters
kout kin

61 Plasticité synaptique : modulation du potentiel d’interaction ?

62 Visualisation de l’expression génique

63 Visualisation de la synthèse protéique chez E
Visualisation de la synthèse protéique chez E. Coli à la molécule unique Protéine membranaire taggée GFP Yu et al. Science (2006)

64 Fluctuations stochastiques
Les protéines sont exprimées en « burst »: 4.2 protéines/burst, 1.2 burst/cycle La distribution du nombre de protéines suit une loi géométrique : rn(1-r) où r est la probabilité de traduction par le ribosome et (1-r) celle de dégradation du mRNA par les ribonucléases

65 Mouvement de moteurs moléculaires

66 Kinesin motors Kinesines are linear molecular motors with a crucial role in intracellular transport and cell division A lot of information from single molecule in vitro assays Stall force Fs  6 pN Steps = 8 nm Processivity = 1 m

67 Tracking individual kinesins in vivo
Movie duration : 70 s accelerated 6x 5 µm cultured Hela cells The loading of QD-tagged kinesins is based on the osmotic lysis of pinocytic vesicles (Okada and Rechsteiner (1982)).

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69 Velocity and processivity in vivo
<velocity> = (0.57  0.02) m.s-1 <processivity> =(1.73  0.06) s In vitro <velocity> = (0.60  0.01) m.s-1 <processivity> = (1.73  0.09) s

70 Diffusive motion of kinesins unbound from MTs
D ~ µm²/s F necessary to carry a QD is ~ 0.6 pN, well below the stall force 6 pN

71 Des niveaux hiérarchiques d’information

72 De la molécule unique à la biologie « systémique »
  « Systems biology is an emergent field that aims at system-level understanding of biological systems. What does it mean to understand at "system level"? Unlike molecular biology which focus on molecules, such as sequence of nucleotide acids and proteins, systems biology focus on systems that are composed of molecular components. Although systems are composed of matters, the essence of system lies in dynamics and it cannot be described merely by enumerating components of the system. »

73 From single molecules to systems biology
Conclusion From single molecules to systems biology Describe quantitatively the spatio-temporal dynamics of molecular networks by accounting for: Diffusion (« Arguably, the most important defining characteristic of protein-based networks is that they are governed by diffusive processes » D. Bray, Nature 1995) Stochastic nature of biochemical equilibria

74 Conclusion A-t-on toujours un lien simple entre mesure d’ensemble et mesure en molécules uniques ? (théorie ergodique) inhomogénéités dépend de l’observable fluctuations temporelles : que se passe t-il s’il n’y a pas de valeur moyenne ?

75 1/t1.2 CCW T (s) « In this system, the time average of single-cell behaviour differs from population behaviour for timescales ranging from few to 103 seconds. » « The temporal fluctuations are a selected property of the network »