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Techniques détude des interactions protéine-protéines à grande échelle Hervé PHILIPPE BIN1001 – hiver 2006.

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1 Techniques détude des interactions protéine-protéines à grande échelle Hervé PHILIPPE BIN1001 – hiver 2006

2 Pourquoi étudier les interactions protéine- protéine ? beaucoup de matériel à disposition focus sur létude des fonctions cellulaires capacité des protéines à former des complexes 5 partenaires pour chaque protéine importance des complexes protéiques dans laspect fonctionnel interactome

3 De nombreuses techniques détude Piehler J. Curr.Op.Struct.Biol. 2005; 15:4-14 in vivo maintien du contexte cellulaire in vitro caractérisation détaillée des interactions (cinétique, stochiométrie …) validation des résultats in vivo

4 Co-immunoprécipitation

5 Double hybride utilisation de facteurs de transcription modulaires chez la levure domaine dactivation domaine de liaison à lADN fusion des protéines à tester chacune avec un module du facteur de transcription expression du produit de transcription si les protéines testées interagissent Principe :

6 Double hybride DA DL mARN DA : domaine dactivation DL : domaine de liaison à lADN TF Système rapporteur Fusion protéines et modules du facteur de transcription Expression du système DA DL prot 1 prot 2 DL prot 3 pas dexpression expression du gène colonies de levures mARN

7 Double hybride expérience facile à mettre en placeAvantages : analyse qualitative faux positifs si les interactions préexistent chez la levure faux négatifs : problème dexpression des protéines cibles chez la levure non applicable aux protéines membranaires (30% du protéome) Inconvénients : identification des interactions criblage de banque de protéines Application : Fields S. & Song O. Nature. 1989; 340:

8 Interactome chez C. elegans Li S. et al.; Science 2004; 303:540–543

9 PCA : protein fragment complementation assay a)rapporteur (enzyme ou protéine fluorescente) b)fractionnement du rapporteur + fusion aux protéines à tester c)mesure de la reconstitution du rapporteur si les protéines testées interagissent Principe : Michnick SW. Curr Opin Biotechnol. 2003;14(6):610-7 Johnsson N & Varshavsky A. PNAS. 1994; 91:

10 PCA : protein fragment complementation assay Application : applicable pour les protéines membranaires réponse très rapide Avantages : décalage temporel de la réponse au signal dexpression nombreux faux positifs : accumulation du substrat et du produit de la réaction enzymatique Inconvénients : identification des interactions étude des réseaux dinteraction

11 FRET (fluorescence resonance energy transfer) 525 accepteur donneur excitation 475 nm 525 nm excitation dun fluorophore donneur par un photon émission fluorescence par le donneur excitation du fluorophore accepteur sil est suffisamment proche mesure du rapport de fluorescence Principe : R Å 475 nm émission L. Stryer; Annu Rev Biochem 1978; 47: 819–846

12 FRET (fluorescence resonance energy transfer) étude dynamique en temps réel applicable in vivo dans le système cellulaire originel peut être couplé à un signal biologique applicable dans tous les compartiments cellulaires Avantages : création de protéines chimériques qui peuvent modifier les interactions nécessite la surexpression des protéines testées Inconvénients : signification biologique des interactions localisation cellulaire par couplage avec des techniques de microscopie Application :

13 TAP-Tag : Tandem Affinity Purification Puig O. et al.; Methods 2001; 24:218–229 Principe : tag 1.constitution du complexe protéique in vivo puis lyse des cellules 2.fixation du complexe via la ProtA sur la colonne daffinité et élution douce des contaminants 3.clivage du tag par la protéase 4.fixation du complexe via le peptide de fixation à la calmoduline et élution douce des contaminants résiduels et de la protéase 5.élution du complexe et analyses subséquentes peptide de fixation à la calmoduline domaines de fixation de la ProtA aux IgG site de clivage à la TEV protéase

14 Spectrométrie de masse nécessite la purification des complexes méthode compliquée et coûteuse Inconvénients : Application :identification des protéines présentes dans un complexe Gingras et al. (2005) J Physiol 563:11-21

15 TAP-Tag : Tandem Affinity Purification seules les interactions très stables peuvent être détectées Inconvénients : seul lappât est modifié, pas les autres protéines du complexe taux dexpression biologique des protéines identification de complexes avec plus de 2 protéines Avantages : Application :identification des complexes protéiques


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