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Modalités de contrôle post-transcriptionnel cytoplasmique 19 septembre 2007 Luc Paillard, CNRS UMR 6061

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Présentation au sujet: "Modalités de contrôle post-transcriptionnel cytoplasmique 19 septembre 2007 Luc Paillard, CNRS UMR 6061"— Transcription de la présentation:

1 Modalités de contrôle post-transcriptionnel cytoplasmique 19 septembre 2007 Luc Paillard, CNRS UMR 6061

2 Que sont les régulations post-transcriptionnelles? AAAAAA

3 Que sont les régulations post-transcriptionnelles? AAAAAA Régulation de la traduction Régulation de la stabilité des ARNm (Régulation de la stabilité des protéines) Un niveau de contrôle de la concentration cellulaire en chaque protéine

4 « How is gene expression controlled in eukaryotes? As in prokaryotes, control is exerted primarily at the level of transcription » Lubert Stryer, Biochemistry III, 1988

5 Importance du contrôle post-transcriptionnel chez les eucaryotes Des pathologies humaines sont associées à des défauts de contrôle post-transcriptionnel Des altérations de facteurs de régulation post-transcriptionnelle provoquent des perturbations phénotypiques

6 Des altérations de régulations post-transcriptionnelles provoquent des perturbations phénotypiques Mise en place de laxe antéro-postérieur chez la drosophile

7 Des pathologies humaines sont associées à des défauts de contrôle post-transcriptionnel Thalassémies ( ou ) et instabilité des ARNm ou globine Oncogenèse et stabilisation dARNm de cytokines/proto-oncogènes

8 Des approches systématiques destimation de lampleur des régulations post- transcriptionnelles? Transcriptome (puce, SAGE…) : niveau daccumulation des ARNm Transcription, stabilité des ARNm

9 Des approches systématiques destimation de lampleur des régulations post- transcriptionnelles? Transcriptome (puce, SAGE…) : niveau daccumulation des ARNm Transcription, stabilité des ARNm « Traductome » (gradient) : Accumulation des ARNm dans les polysomes Traduction des ARNm

10 Des approches systématiques destimation de lampleur des régulations post- transcriptionnelles? Transcriptome (puce, SAGE…) : niveau daccumulation des ARNm Transcription, stabilité des ARNm « Traductome » (gradient) : Accumulation des ARNm dans les polysomes Traduction des ARNm Protéome (2DE, MS et dérivés) : niveau daccumulation des protéines Traduction, stabilité des protéines

11 Des approches systématiques destimation de lampleur des régulations post- transcriptionnelles? Transcriptome (puce, SAGE…) : niveau daccumulation des ARNm Transcription, stabilité des ARNm « Traductome » (gradient) : Accumulation des ARNm dans les polysomes Traduction des ARNm Protéome (2DE, MS et dérivés) : niveau daccumulation des protéines Traduction, stabilité des protéines Relations Transcriptome/traductome/Protéome

12 1. Levures en phase de croissance Gygi et al MCB , 1720 Marquage métabolique (Met- 35 S) des cellules Séparation des protéines par 2DE Quantification des spots, identification Niveaux dexpression de 106 protéines

13 1. Levures en phase de croissance Gygi et al MCB , 1720 Données de SAGE Niveaux dexpression des ARNm correspondants

14 1. Levures en phase de croissance Gygi et al MCB , 1720 Corrélation entre niveau dexpression des ARNm et des protéines

15 1. Levures en phase de croissance Gygi et al MCB , 1720 Corrélation entre niveau dexpression des ARNm et des protéines Corrélation très mauvaise!

16 2. Réponse à un changement de milieu de culture Griffin et al MCP , 323 Culture de levures en galactose Transfert en galactose ou éthanol Ratio Gal/Eth mesuré pour 245 produits de gènes : protéine (ICAT : MS en conditions quantitatives), ARNm (microarray) log du ratio des protéines=f(log du ratio des ARNm) (log=0 pour un produit de gène dont labondance ne change pas)

17 2. Réponse à un changement de milieu de culture R 2 =0.21! Griffin et al MCP , 323

18 Conclusion 1.Les régulations post-transcriptionnelles sont un niveau MAJEUR de régulation de lexpression génétique 2. (En conséquence, les analyses transcriptomiques peuvent être insuffisantes)

19 Bref survol des modalités de régulations post- transcriptionnelles ORF AAA….AAA5'3' AUGSTOP 5'UTR3'UTR Structure de l'ARNm eucaryote : Coiffe Queue poly(A) Régions non codantes

20 Rappels sur la traduction eucaryote Initiation Recrutement de la petite sous-unité ribosomique (40S) à l extrémité 5 Scanning jusqu à la rencontre de l AUG initiateur Jonction de la grosse sous-unité (60S) = ribosome (80S) Elongation Lecture codon par codon Terminaison Relargage du peptide Le ribosome? Influence du contexte du codon stop

21 La 5UTR contrôle la traduction 1, Les uORF (upstream ORF) 5UTR de lARNm Gcn4 de levure : Gaba et al EMBO J , uORF avant lATG initiateur Réinitiation possible « dans certaines conditions » en 3 dune uORF Ces conditions contrôlent la traduction de GCN4

22 La 5UTR contrôle la traduction 1, Les uORF (upstream ORF) Plusieurs (nombreux) ARNm contiennent des uORF, même chez les métazoaires Fonction???

23 La 5UTR contrôle la traduction 2, Fixation dune protéine dans la 5UTR La fixation dune protéine à proximité de la coiffe (<40nt) inhibe la traduction Exemple : Contrôle de la traduction de la ferritine par la séquence IRE et la protéine IRP

24 La 5UTR contrôle la traduction 3, Les IRES (Internal Ribosome Entry Site) Initiation indépendante de la coiffe (et de eIF4E) Traduction de certains ARNm quand les autres sont réprimés (stress, cycle cellulaire…)

25 La 3UTR contrôle la stabilité 1, Le récepteur de la transferrine L'IRP (Iron Response Protein) lie l'IRE (Iron Response Element) si la concentration cellulaire de fer libre est faible LARNm récepteur de la transferrine contient 5 IRE dans sa 5UTR (et un site de clivage endonucléolytique) Complexe IRE-IRP : inhibition de dégradation Contrôle de la concentration intracellulaire en fer libre

26 La 3UTR contrôle la stabilité 2, Les ARE (A/U Rich Element) Mise en évidence : ARNm de cytokines, proto-oncogènes… Cinétique de dégradation, en Northern, dun ARNm rapporteur sous contrôle dun promoteur inductible Sans AREAvec ARE Xu et al. MCB , 6960

27 La 3UTR contrôle la stabilité 2, Les ARE (A/U Rich Element) 3 classes dARE ClasseExempleDescription I c-fos, c-myc(AUUUA) répartis II GM-CSF, TNF (AUUUA) chevauchants III c-junPas de (AUUUA)

28 La 3UTR contrôle la stabilité 2, Les ARE (A/U Rich Element) Les ARE agissent en fixant une protéine (ARE-BP) hnRNPD/AUF1, HuR, TTP… Effet positif ou négatif de la fixation de la protéine

29 La 3UTR contrôle la stabilité 3, La queue poly(A) Un ARNm polyadénylé est généralement plus stable quun ARN désadénylé

30 La 3UTR contrôle aussi la traduction 1, Les ARE (A/U Rich Element) Transfection dun plasmide codant un ARN EGFP (avec ou sans ARE dans la 3UTR) Mesure de lARN (Northern) et de la protéine (western) EGFP Grosset et al. JBC , Vecteur vide EGFP EGFP-ARE

31 La 3UTR contrôle aussi la traduction 2, La queue poly(A) Tarun et Sachs (1995) Genes Dev 9, 2997 Incubation dans extrait de levure Mesure de luminescence +/-cap+/-poly(A) Même expérience en présence d anticorps anti PABP Pas de stimulation de la traduction par la queue poly(A) Luciferase

32 La 3UTR contrôle aussi la traduction 2, La queue poly(A) Searfoss et al 2001, MCB 21, 4900 Transfection dans les levures Mesure de luminescence +/-cap+/-poly(A)Luciferase "wt" pab1 La queue poly(A) stimule la traduction de façon dépendante de la PAB1

33 Mais tout cela est lié! 1, ARE et état dadénylation Cinétique de dégradation, en Northern, dun ARNm rapporteur contenant un ARE sous contrôle dun promoteur inductible Diminution de taille avant dégradation Peng et al. MCB , 1490

34 Mais tout cela est lié! 2, ARE, état dadénylation, traduction, stabilité… ARE AUG STOP AAAA...AAAAA Ri ' (et cest encore pire…) ARE-BP

35 La 3 UTR contrôle la traduction ET la stabilité Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codants Une histoire récente… Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519 miRNA RNAi siRNA Et alors?

36 Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519 Mécanismes biochimiques Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codants Une histoire récente…

37 Biosynthèse des miRNA Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519 Reconnaissance dun ARN double brin par Argonaute!

38 Fonction des miRNA LARN simple brin (22nt) shybride à un ARNm cible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN 1. Hybridation imparfaite sur les 22 nt : Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519 Conséquence : inhibition de la traduction de lARNm cible Voie miRNA « classique » chez lanimal

39 Fonction des miRNA LARN simple brin (22nt) shybride à un ARNm cible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN 2. Hybridation sur la totalité des 22 nt : Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519 Conséquence : dégradation de lARNm cible Voie miRNA « classique » chez la plante

40 Fonction des miRNA LARN simple brin (22nt) shybride à un ARNm cible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN 2. Hybridation sur la totalité des 22 nt : Conséquence : dégradation de lARNm cible Voie miRNA « classique » chez la plante… … Mais si lon apporte un ARN double brin parfaitement complémentaire dun ARNm cible chez lanimal, cela provoque sa dégradation… voie « siRNA » chez lanimal

41 Mise en évidence du RNAi Injection d'ARN sens, antisens ou double brin dans la gonade Phénotype de la descendance? Fire et al. (1998) Nature 391, 806 Prix NOBEL 2006

42 Reprenons… miRNA : ARN double brin (2*22nt) codé par le génome de la cellule (sous forme dun précurseur qui est maturé) Environ 200 chez lhumain Sapparie imparfaitement à un ARN cible et inhibe sa traduction (animal), ou sapparie parfaitement et provoque sa dégradation (plante) (Il y a des exceptions…) En général, un miRNA sapparie aux 3UTR dun ou plusieurs ARNm Une 3UTR peut être liée par plusieurs miRNA siRNA : ARN double brin (2*22nt) apporté par lexpérimentateur dans une cellule animale Sapparie parfaitement à un ARNm cible et provoque sa dégradation

43 Le RNAi, un mode de régulation post- transcriptionnel au service de lexpérimentateur Application en thérapeutique? Downward BMJ , 1245


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