Séparation magnétique des plasmocytes dans le cadre des myélomes multiples Elodie DAVID Equipe Onco-hématologie en cytogénétique Prolonger votre offre de soins, jour après jour

Sommaire Le Myélome Multiple : Définition 2. La purification des plasmocytes : Pourquoi ? 3. La séparation magnétique : Principe 4. Les outils de séparation : Différents appareils

Plasmocytes immatures 1. Le Myélome Multiple Définition : prolifération maligne d’un clone plasmocytaire produisant de manière inadaptée et exagérée une immunoglobuline ou l’un de ses fragments 3 stades (classification de Durie et Salmon) : Plasmocytes matures Stade I Plasmocytes immatures Cytoplasme important Stade II Plasmoblastes Formation d’agrégats Stade III

1. Le Myélome Multiple Incidence: Augmente avec l’âge Légèrement plus fréquent chez l’homme que chez la femme Moyenne d’âge de 64 ans Signes cliniques: Lésions osseuses Hypercalcémie Anémie Insuffisance rénale… Diagnostic : Mise en évidence d’une gammapathie monoclonale sérique et/ou urinaire Mise en évidence d’une prolifération plasmocytaire médullaire

1. Le Myélome Multiple  sans anomalies de structure associées  Anomalies cytogénétiques : Hyperdiploïdie : 48-74 chromosomes : +3, +9, +15, +19… Hypodiploïdie t(4;14) Délétion totale ou partielle des chromosomes 13 et 17  sans anomalies de structure associées  Valeur pronostique permettant un traitement adapté Diagnostic et suivi : Cytogénétique conventionnelle : vue d’ensemble du caryotype  hyperdiploïdie Cytogénétique moléculaire : plus précis et sensible  anomalies fines comme t(4;14), del(13), del(17) ET

2. Pourquoi une purification des plasmocytes? Etude du Myélome Multiple = étude des plasmocytes  Plasmocytes dilués dans la masse cellulaire Tri magnétique des plasmocytes avec étude des chromosomes 4, 14, 13 et 17

3. Séparation magnétique des plasmocytes Plasmocytes = CD138+ Principe : 1. Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD138 couplé à une bille magnétique 2. Tri sur colonne magnétique 3. Création d’un champ magnétique 4. Récupération des plasmocytes en cassant le champ magnétique 3 appareils (Miltenyi) : - VarioMACS - AutoMACS - AutoMACS Pro

3. Séparation magnétique des plasmocytes VarioMACS et AutoMACS Réalisation d’un ficoll Récupération des globules blancs au niveau de l’anneau Filtration de la moelle totale Lavage Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD138 couplé à une bille magnétique Passage de l’échantillon dans une colonne de billes magnétiques Création d’un champ magnétique Récupération de la fraction négative Cassure du champ magnétique Récupération fraction positive 1 3 4 6 7 5 Plasma Cellules mononuclées Ficoll Polynucléaires et globules rouges 2

3. Séparation magnétique des plasmocytes VarioMACS et AutoMACS  Perte cellulaire dans le ficoll : - cellules de tailles différentes I II III - agrégations protéique et plasmocytaire  Colonnes et valves souvent saturées  Technique lourde (temps) Utilisation de l’AutoMACS Pro

3. Séparation magnétique des plasmocytes AutoMACS Pro Sélection du programme Tri magnétique sur AutoMacs Pro 3 tubes : échantillon, fraction négative et positive Après cassure du champ magnétique, récupération fraction positive Après technique, 3 lames étalées : t(4;14),13 et 17 Filtration de la moelle totale Lavage Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD138 couplé à une bille magnétique 1 3 4 2 5 6 7 8

3. Séparation magnétique des plasmocytes AutoMACS Pro  Travail sur moelle totale : Ac anti-CD138 plus concentrés rendement augmenté (>86% : panel FISH complet)  Adaptation du programme de séparation pureté augmentée (<5% d’échec de purification)  Tampons plus agressifs et filtres 40 µm automate moins saturé, maintenance adaptée  Automatisation Gain de temps

CONCLUSION Séparation magnétique : routine dans les bilans de myélome multiple si nécessaire préférée à la mise en culture support pour les études pangénomiques

Remerciements L’équipe d’onco-hématologie en cytogénétique, CERBA L’équipe de FISH, CERBA Hossain MOSSAFA, cytogénéticien à CERBA MILTENYI

Annexe 1 : Classification de Durie et Salmon http://med2.pagesperso-orange.fr/import/CANCERO/CLASSIFICATION/MYELOME.htm

Annexe 2 : quelques anomalies cytogénétiques 4p13 : fluorochrome rouge 14q32 : fluorochrome vert t(4;14)(p13;q32) del(17)(p11) Bandes R del(13)(q14q21) Bandes G

Annexe 3 : mise en place d’un nouveau protocole Patient Bone Marrow (ml) Total WBC % Plasma cells slide Theoric Total plasma cells MicroBeads Control Purity by flow cytometry Obtened Total Labeled P cell Performance 07D0570753 4.8 mL 3.3*10^6 c/mL 36%   50 µL 94,60% 5.3*10^5 60% 6.5*10^6 8,15% 07D0572733 6.2 mL 5.8*10^6 c/mL 8% 93,4 5.6*10^5 72.7% 2.6*10^7 2,15% 07D0566314 4.3 mL 4.1*10^6 c/mL 5% 68,40% 10.9*10^4 59.3% 1*10^7 1,10% 07D0577164 5.8 mL 5.6*10^6 c/mL 4% 72,80% 1.7*10^5 1% 3.2*10^5 53,13% 07D0583892 3 mL 4*10^6 c/mL 22% 88,40% 2.5*10^5 15% 1.8*10^6 13,90% 07D0583530 5.3 mL 8.4*10^6 c/mL 0% 65,50% 5.2*10^4 2.2*10^6 2,36% 07D0587071 2.7 mL 3*10^6 c/mL 88,70% 1.8*10^5 12% 9.7*10^5 19% 07D0606916 6.1 mL 7.7*10^6 c/mL 3% 31% 7.4*10^4 4.7*10^5 15,70% 07D0609147 6.8 mL 1.1*10^6 c/mL 54,10% 1.5*10^5 3.7*10^5 40,50% 07D0609191 6.3 mL 1.6*10^7 c/mL 10^6 18,00% % of plasma cells reported by cytologist % and total plasma cells number determined by flow cytometry labelled by CD138/CD38 1er test 2007 : Programme Possel-D avec utilisation uniforme de 50µL d’Ac anti-CD138 Mauvais rendement : adaptation de la quantité d’Ac : 50µL Ac pour 107 cellules

Annexe 4 : Comparaison des programmes de séparation Possel-D+Rinse # Possel WB+Clean PosselWB+Clean = Meilleur rendement Pas assez de noyaux pour réaliser une FISH