Y-a-t-il plus d’un agent causal de l’anthracnose du fraisier au Québec? Richard Hogue, Ph.D. biologiste Laboratoire d’analyse biologique Bonjour, je remercie le comité organisateur de me donner l’opportunité de vous présenter les principales retombées tangibles de mes recherches des trois dernières années. Journée provinciale sur la recherche APFFQ Trois-Rivières 24 Février 2017

Objectifs de la présentation Présenter les résultats du dépistage des agents causals de l’anthracnose du fraisier au Québec Colletotrichum sp. ( C. acutatum, C. gloeosporioides et C. fragariae) Présenter les retombées applicables aux producteurs et agronomes-conseils de trois projets terminés en 2016 Détection classique et moléculaire des champignons pathogènes du collet du fraisier , différenciation des symptômes et fiches: Phytophthora cactorum (coeur rouge) Protocole de dépistage des virus qui causent le dépérissement: SMoV + SMYEV et 20 zones par champ implanté puis suivi Dépistage des virus sur plantes réservoirs et vecteurs. Les deux principaux objectifs de ma présentation sont: de vous présenter les résultats du dépistage des agents causals de l’anthracnose du fraiser au Québec; puis de vous présenter les retombées applicables aux producteurs et agronomes-conseils de trois projets terminés en 2016.

Collaborateurs et collaboratrices Laboratoire d’écologie microbiennee - Thomas Jeanne et Vanessa Villeneuve. Laboratoire d’analyse biologique - Nathalie Daigle, Édith Plante et Véronique Gagné, MAPAQ- Liette Lambert et Stéphanie Tellier Agronomes , conseillers et producteurs Si j’ai plusieurs résultats et retombées tangibles à vous présenter, c’est parce que je peux compter sur deux équipes de collaborateurs compétents et motivés à l’IRDA. Les agronomes Liette Lambert et Stéphanie Tellier au MAPAQ sont les instigatrices des projets de R&D que je présente, et j’ai eu la chance de pouvoir compter sur près de 25 collaborateurs régionaux (agronomes et conseillers) et sur près de 60 producteurs, productrices dans 13 régions du Québec.

Collaborateurs et collaboratrices 25 collaborations 13 régions

Projet et Partenaire financier 2016-2017 - Projet R&D MAPAQ - IRDA Stéphanie Tellier – Capitale-Nationale et quatre régions Identification des espèces de Colletotrichum causant l'anthracnose du fraisier suite au dépistage moléculaire par PCR de différents organes porteurs de la maladie ou asymptomatiques. Vise à soumettre divers organes du fraisier (collet, stolon, feuille, pétiole, fleur, fruit) à la détection PCR des espèces de Colletotrichum, champignons pathogènes causant l’anthracnose. Des protocoles de détection PCR spécifique à chacune de trois espèces du Colletotrichum pathogène, C. acutatum, C. gloeosporioides et C. fragariae, sont utilisés sur divers organes du fraisier et diverses sources de plants asymptomatiques (pépinières) ou atteints d’anthracnose la saison précédente. Au printemps 2016, Stéphanie Tellier de la direction régionale Capitale-nationale et Chaudière-Appalaches m’a approché pour élaborer un projet visant à soumettre divers organes du fraisier (collet, stolon, feuille, pétiole, fleur, fruit) à la détection PCR des espèces de Colletotrichum, champignons pathogènes causant l’anthracnose. Nous avons adapté des protocoles de détection PCR spécifique aux espèces du Colletotrichum pathogène, soit le C. acutatum, le C. gloeosporioides et le C. fragariae. Les tests PCR ont été utilisés sur divers organes du fraisier et diverses sources de plants asymptomatiques (pépinières) ou de plants atteints d’anthracnose la saison précédente.

Cycle de vie du Colletotrichum acutatum Plantation

Anthracnose sur fruits rouges Les prochaines diapos illustrent des symprômes typiques causés par les Colletotrichum pathogènes du fraisier, soit le C. acutatum, le C. gloeosporioides et le C. fragariae lorsque divers organes du fraisier sont infectés. Dr. Barbara J. Smith USDA, ARS, Poplarville MS, NASGA Savannah 2016

Anthracnose sur fruits verts Dr. Barbara J. Smith USDA, ARS, Poplarville MS, NASGA Savannah 2016

Anthracnose sur feuilles Dr. Barbara J. Smith USDA, ARS, Poplarville MS, NASGA Savannah 2016

Anthracnose sur feuilles Dr. Barbara J. Smith USDA, ARS, Poplarville MS, NASGA Savannah 2016

Anthracnose sur collets Dr. Barbara J. Smith USDA, ARS, Poplarville MS, NASGA Savannah 2016

Anthracnose sur collets L’examen des collets tranchés en deux montre des zones nécrotiques dans la partie supérieure du collet dans lesquelles nous avons dépistés par des tests PCR le champignon pathogène Colletotrichum. C. gloeosporioides Dr. Barbara J. Smith USDA, ARS, Poplarville MS, NASGA Savannah 2016

Anthracnose sur différents tissus Les photos illustrent les divers organes de fraisier qui ont été prélevés pour décrire les symptômes et pour extraire les ADN des champignons pathogènes qui se retrouvent dans les tissus infectés. Nous avons testés les fruits, les feuilles, les pétioles et les stolons de même que les collets.

Anthracnose sur collet en 2016 L’examen des collets tranchés en deux montre des zones nécrotiques dans la partie supérieure du collet dans lesquelles nous avons dépisté par des tests PCR le champignon pathogène Colletotrichum.

Anthracnose sur collet en 2016 Les collets photographiés ont d’abord été testés positifs au dépistage PCR des Colletotrichum sp. Puis l’analyse des tissus broyés a été positif au test moléculaire PCR de l’espèce C. acutatum.

Méthode – Échantillons - PCR Tiges, pétioles Broyage des échantillons Fraises Feuilles La photo illustre les différentes étapes suivies pour broyer plusieurs des tissus mous de la fraise dans des sacs de plastique, soit le fruit, les tiges et pétioles et les feuilles à l’aide d’un broyeur sur roulement à bille monté sur une perceuse à colonne. Pour les tissus de fraise, feuille, pétiole et tige, l’échantillon prélevé est déposé dans un sac de broyage Agdia, puis broyé au Roller Press en présence de tampon d’extraction. On procède ensuite à l’extraction de l’ADN.

Méthode – Échantillons - PCR Préparation des collets puis une fois coupés sur le long, on recoupe une tranche mince que l’on coupe en petits morceaux pour l’extraction de l’ADN. Deux billes de plomb stériles sont ajoutées au tube pour le broyage au FastPrep Puisque les collets sont des tissus plus durs, on doit d’abord couper des languettes du collet, puis les mettre en dés, puis les insérer dans un petit tube contenant deux billes de plomb qui vont pulvériser les morceaux de collet placés dans le tube.

Méthode – Échantillons - PCR Méthodes de détection utilisées Pathogène Amorces PCR Cible Longeur Colletotrichum spp Col-1 / Col-2 Conventionel 5.8S-ITS 462 pb C. acutatum Acut-F1 / Acut-R1 Sonde : Acut-PB Taqman 90 pb C. Gloeosporioides / Gloe-F1 / Gloe-R1 Sonde : Gloe-PB 101 pb Les gènes des ribosomes jouent des rôles essentiels à la survie de la cellule et l’évolution a fait en sorte que des séquences de ces gènes sont spécifiques à chaque espèce vivante. L’évolution des espèces a fait en sorte que des séquences sont communes à tous les champignons, d’autres séquences sont communes à des familles de champignons, d’autres sont spécifiques à des genres ou des espèces de champignons. Le test de dépistage moléculaire consiste à utiliser de courtes séquences qu’on appelle amorces pour amplifier, par un processus enzymatiques appellé PCR, des millions de fois une séquence spécifique. Selon le choix des amorces, le test PCR permettra donc de détecter dans un échantillon tous les champignons, ou toutes les espèces de Colletotrichum ou les espèces C. gloeosporioides /fragariae ou encore la seule espèce C. acutatum. Référence : Garrido, C et al. 2009. Development of protocols for detection of Colletotrichum acutatum and monitoring of strawberry anthracnose using real-time PCR. Plant Pathology. 58 : 43-51

Méthode – Échantillons - PCR Alpha Imager: prise de la photo PCR Électrophorèse L’ADN de chaque échantillon est utilisé pour faire une réaction PCR dans un tube. Une microplaque qui contient 96 tubes est placée dans un thermocycleur qui gère le processus enzymatique de la PCR. Le résultat de l’amplification PCR peut être analysé par une électrophorèse en gel d’agarose qui permet de visualiser le fragment amplifié d’ADN lorsque le test PCR est positif. Ici la flèche indique une réaction positive de détection du fragment de 462 paires de bases d’une séquence d’ADN commune à tous les champignons du genre Colletotrichum. Il est aussi possible d’utiliser une variante technique de la réaction d’amplification PCR qui permet de détecter par fluorescence en temps réel le fragement amplifié directement dans l’appareil. Cette détection en temps réel à chacun des cycles d’amplification permet de faire de la détection PCR quantitative spécifique à la cible que l’on choisi. 500 400 PCR Colletotrichum spp. Cible : 5.8S-ITS Amorces : Col-1/ Col-2 Longueur : 462 pb 300 200 100 462 pb

Anthracnose en 2016 Cinq échantillons de pétioles et de tiges = trace de Colletotrichum sp. au test PCR. Ces échantillons n’ont pas été confirmés positifs au test qPCR C. acutatum. 63 % des tissus testés en 2016 sont infectés par Colletotrichum 95 % des tissus positifs Colletotrichum sont positifs au qPCR C. acutatum Confirmation C. acutatum dans les tissus atteints 100% (collet, fruit, feuille) Confirmation C. acutatum dans les tissus atteints 81,5% (pétiole+tige)

Anthracnose en 2016 Jusqu’à maintenant, les tissus testés en 2016 ne sont pas infectés par Colletotrichum gloeosporioides. Les tissus de fraises, de feuilles et de pétioles+tiges testés positifs au test PCR Colletotrichum sp. seront testés en 2017 avec le test qPCR spécifique au C. gloeosporioides.

Anthracnose en 2016 19% des collets prélevés de plants de 2 ans plantés dans des champs infectés par Colletotrichum sp. en 2015 ont été positifs aux tests PCR Colletotrichum sp. et aux tests de confirmation qPCR pour le C. acutatum. Aucun des collets prélevés de plants reçus de pépinières en 2016 sont infectés par Colletotrichum sp.

Conclusions - Anthracnose Les protocoles de détection des trois espèces de Colletotrichum pouvant infecter le fraisier sont disponibles pour réaliser le dépistage des fruits ou autres organes du fraisier. À ce jour, seul le C. acutatum a été détecté dans les échantillons soumis. La présence de plusieurs champignons pathogènes ou autres stress peuvent induire des symptômes qui rendent difficile le verdict de l’anthracnose dans les collets. La localisation des points d’infection dans le collet suggère des modifications à faire au protocole de prélèvement des tissus du collet lors des étapes de préparation des collets pour extraire les ADN fongiques et détecter les champignons pathogènes par PCR.

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Projet et Partenaire financier 2015-2016 - Programme d’appui au développement de l’agriculture et de l’alimentation en région (PADAAR) Liette Lambert – Montérégie ouest - projet impliquant neuf régions Dépistage d'un champignon pathogène responsable de dépérissement dans le fraisier – cœur rouge (Phytophthora cactorum). Des échantillons de collets de fraisier montrent des symptômes de coeur rouge lorsque tranchés au champ, mais la détection classique sur géloses spécifiques de champignons pathogènes parvient rarement à détecter le P. cactorum dans des collets symptômatiques . Un protocole de détection PCR spécifique au P. cactorum est utilisé avec succès. 

Projet et Partenaire financier 2016-2017 - Projet R&D MAPAQ - IRDA Liette Lambert – Montérégie ouest- projet impliquant six régions Identification PCR des champignons pathogènes du collet des fraisiers et développement de fiches techniques d'aide au dépistage des maladies du collet. Des collets de fraisiers dépéris localement en champs montrent des symptômes atypiques au cœur rouge (P. cactorum). Des protocoles de détection PCR spécifique à plusieurs champignons pathogènes seront évalués pour réaliser les investigations. Colletotrichum acutatum, C. gloeosporioides, C. fragariae Macrophomina phaseolina Verticillium sp.

Coeur rouge vs Dépérissement

Méthode – Échantillons - Diagnostic Stériliser le collet en trempant dans l’alcool, flamber et placer sur une planche netoyée à l’acool. Prélever le collet en coupant les racines et les feuilles et rinçer abondamment en retirant tous les débris pour libérer le collet Verticilium : Prélever dans le sys. vasculaire de petites pièces avec un scalpel stérile et déposer sur la gélose SNA Phytophthora: Prélever dans la moelle de petites pièces avec un scalpel stérile et déposer sur la gélose PHY Avec des instruments stériles, couper le collet sur le long.

Méthode – Échantillons - PCR Alpha Imager: prise de la photo PCR Électrophorèse 223 pb 100 200 300 PCR P.cactorum Cible : gène Ypt1 Amorces : Cac-F3/ Cac-R3-2 Longueur : 223 pb Référence : Li, M., Asano, T., Suga, H., and Kageyama, K. 2011. A multiplex PCR for the detection of Phytophthora nicotianae and P. cactorum, and a survey of their occurrence in strawberry production areas of Japan. Plant Dis. 95:1270-1278

Symptômes types – P. cactorum -Apparition de crevasse(s) et nécrose(s) dans le collet à un stade plus avancé -Ligne plus foncée qui délimite toute la périphérie de la tache du collet

Symptômes types - P. cactorum -Ligne plus foncée qui délimite toute la prériphérie de la tache -Coloration interne inégale de la tache - Stade plus avancé : les crevasses et la nécrose peuvent être plus importantes et nombreuses

Symptômes types - P. cactorum - Début P. cactorum - Point d’entrée (racine) - Contour très délimité - Coloration inégale - Crevasse et nécrose - Contour très délimité - Coloration inégale - Présence d’une zone différente - Pas de contour délimité

Symptômes – Aucun P. cactorum Collet négatif P. cactorum Collet positif P. cactorum Collet négatif P. cactorum -Pas de délimitation périphérique plus foncée de la tache -Coloration interne égale ou plus foncée que le contour

Symptômes – Aucun P. cactorum Collet négatif P. cactorum Collet positif P. cactorum Collet négatif P. cactorum -Pas de délimitation périphérique plus foncée de la tache -Coloration interne égale ou plus foncée que le contour

Symptômes – Aucun P. cactorum Collet négatif P. cactorum Collet positif P. cactorum Collet négatif P. cactorum -Coloration interne égale et uniforme

Conclusion – Coeur rouge Les symptômes typiques de coeur rouge causé par le Phytophthora cactorum sont: Délimitation périphérique de la tache Couleur inégale de la tache et contour plus foncé Des crevasses et nécroses peuvent se faire en stade avancée de la maladie Habituellement, la tache est dans les parties basses/médianes du collet alors que les taches de C. acutatum sont dans la partie supérieur du collet. Les plants atteints de coeur rouge sont plus localisés, les feuilles et les pétioles desséchés sont souvent affaissés et de couleur brunâtre relativement égale. Les plants atteints de dépérissement sont moins localisés, les feuilles sont partiellement colorées avec un contour chlorosé qui devient rougeâtre avec la maturité de la feuille et la combinaison de deux virus ou plus qui infectent les feuilles. Les pétioles ne se déssèchent pas rapidement et sont inégalement affaissées et les stolons sont peu abondants.

Coeur rouge vs Dépérissement

Anthracnose 2016 P.cactorum C.acutatum Début du feuillage noirci

Dépistage de virus et champignons pathogènes Services de dépistage des virus: Dépistage des virus associés au dépérissement du fraisier; Protocole de dépistage sur plants (plantation ou en production) Traçabilité des sources d’infection (fraisiers sauvages, vecteurs) Services de dépistage des champignons pathogènes: Dépistage des champignons pathogènes du fraisier; Protocole de dépistage sur plants (plantation ou en production) Développement de fiches techniques Services d’analyse des microbiomes des plantes et du sol: Caractérisation des microbiomes bénéfiques et pathogènes; Consulter http://www.irda.qc.ca/lem

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