Lactobacillus et autres bactéries lactiques Bacilles Gram+ réguliers, souvent allongés asporulés, groupés (paires ou en chaînes) Immobiles fermentation de type lactique Catalase-, certains pseudo-catalase, et d’autres sont catalase+, microaérophiles ou anérobies Homo et hétérolactiques

Lactobacillus et autres bactéries lactiques Clé dichotomique des genres 1 – Catalase - : Lactobacillus, Carnobacterium, Bifidobacterium, Erysipelothrix 2. Catalase + : 2.1 Culture à 37°C + : Listeria 2.2 Culture à 37°C - : Brochothrix

Lactobacillus et autres bactéries lactiques Techniques isolement des Lactobacillus Croissance faible milieu ordinaire (semi-anaérobiose) Bouillon de Briggs, à la tomate, Elliker… Le plus connu = MRS (contient du Tween 80), pH ajusté à 6,2 ou 6,5 Pas assez spécifique Rogosa : plus sélectif (acétate et acide acétique) Inhibiteur spécifique : acide sorbique (bactéries acétiques), mélange acide sorbique / actidione pour les levures Milieu MRS acidifié (pH 5) Lactobacilles = microaérophiles  isolement et numération par la technique de la double couche ou incubation en milieu anaérobie ou semi-anaérobie  2 à 3 jours à 30°C

Lactobacillus et autres bactéries lactiques Techniques d’identification des Lactobacillus Lactobacillus divisé en 3 groupes (Orla-Jensen) : Thermobacterium : homofermentaires thermophiles qui se développent à 45°C mais pas à 15°C, ne fermentent ni les pentoses ni le gluconate : Les plus fréquentes (fromages, yaourts, lait) = helveticus, bulgaricus, lactis, acidophilus… Streptobacterium : homofermentaires mésophiles qui se développent à 15°C et occasionnellement hétérofermentaires en fonction du substrat : L casei (lactobacille prédominant du lait), plantarum (choucroute), curvatus, sake… Betabacterium : lactobacilles hétérofermentaires qui fermentent des pentoses et généralement le gluconate : L. fermentum, buchneri, brevis, sanfrancisco… Répartition et identification des espèces basées sur les tests suivants

Lactobacillus et autres bactéries lactiques Techniques d’identification des Lactobacillus Type fermentaire Milieu de Gibson et Abd El Malek – 2 à 7 jours à 30°C  hétéro ou homofermentaires Température de développement Milieu MRS à 45°C (240 à 48 heures) et 15°C (1 à 2 semaines) Parfois tests à 48 et 51°C Hydrolyse de l’arginine Milieu MRS + arginine 0,3% - 2 à 3 jours à 30°C – réactif de Nessler – précipité orange  + Thermorésistance Comme pour les streptocoques avec de MRS Deux tests : 60°C pendant 90 min et 65°C pendant 30 min

Lactobacillus et autres bactéries lactiques Techniques d’identification des Lactobacillus Croissance en présence de NaCl Milieu MRs + 6,5% de NaCl 30°C pendant 2 à 3 jours Croissance à pH 3,9 Milieu MRS à 30°C (HCl) Croissance en présence de Teepol Milieu MRS + 0,4% de Teepol - 2 à 3 jours à 30°C Milieu LTV 48 heures à 30°C – centrifugation – surnageant additionné d’un volume éthanol – anneau opaque à l’interface  présence de dextranes Production de dextranes Réduction du TTC Milieu MRS + TTC  coloration rose-rouge des colonies

Lactobacillus et autres bactéries lactiques Techniques d’identification des Lactobacillus Réduction du tellurite Gélose : noircissement des colonies Production du peroxyde hydrogène Gélose glucose-oxyde de manganèse (48 heures à 30°C)  apparition de zones claires autour des colonies Action sur le lait tournesolé Fermentation des sucres Mise en évidence sur un milieu spécial de fermentation des lactobacilles additionné de différents sucres Production H2S Milieu classique

Lactobacillus et autres bactéries lactiques Techniques d’identification des Lactobacillus Hydrolyse de l’esculine Milieu gélosé à l’esculine – noircissement du milieu Besoin en vitamines Tests technologiques Identiques à ceux des Streptocoques Recherche de l’activité lipolytique sur gélose à la tributyrine, caractère homo ou hétérofermentaires, essais de fermentations des pentoses ou du gluconate avec dosage des produits formés Galeries d’identification rapide pour Lactobacilles : API 50CH, CHL

Lactobacillus et autres bactéries lactiques Pas de clé simple et fiable

Lactobacillus et autres bactéries lactiques Carnobacterium Genre proche des Lactobacillus : bacilles isolés ou en courtes chaînes, mobile ou non, catalase-, nitrate réductase-, métabolisme hétérofermentaire, se développent à 10°C et non à 45°C (proche de Betabacterium) Dans les produits carnés et les poissons Différences par rapport au Lactobacillus des viandes : Croissance sur gélose à l’acétate : Carnobacterium ne se développe pas au contraire des Lactobacillus Présence d’acide diaminopimélique (mDAP) dans la paroi : CCM ou HPLC  Lactobacilus mDAP-(sauf L. plantarum), Carnobacterium mDAP+ Test ADH : Carnobacterium ADH+, Lactobacillus ADH+ ou – (L. plantarum -)

Lactobacillus et autres bactéries lactiques Bifidobacterium Milieu de référence pour isolement : TPY (tryptone-phytone-yeast extract) additionné antibiotique ou inhibiteur : TPY-dicloxacilline, gélose NPNL modifié (TGY+néomycine, paromycine, acide nalidixique et chlorure de lithium) Incubation 72 heures en atmosphère enrichie en CO2 (Anaerocult, Gaspak…) Identification par des caractères biochimiques en particulier enzymatiques :a-arabinosidase, b-glucosidase, N acétylglucosaminidase, leucineglycyl arylamidase, cystine aminopeptidase… Mise en évidence de la F6PPK : apparition d’une couleur violacée du à la production acétyl P Système identification rapide : galerie Rapid Ana II (IDS), galeri API ZYM, API50CH, API50CHL….