Sang/Moelle tumeur Cellule tumorale Marqueur Temps ADN ARN PROTEINE Diagnostic Pronostic Réponse traitement Rechute Suivi Temps

APL: Différenciation in vitro Culture des blastes leucémiques au diagnostic pendant 3-6 jours avec ATRA 0.1µM Mauvais Répondeur Bon Répondeur Cytologie Test NBT

APL 93: Différenciation in vitro facteur de pronostic indépendant Relapse-free survival Event-free survival days P(event free) 500 1000 1500 2000 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Diff<50% Diff > 50% P= 0.01 days P(relapse free) 500 1000 1500 2000 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Diff<50% Diff > 50% P= 0.04 Overall Survival days P(survival) 500 1000 1500 2000 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Diff > 50% Diff<50% P= 0.10

Applications de la PCR +++ + Diagnostic Rechute Maladie Résiduelle _

Translocations des APL PML-RARa PLZF-RARa NuMA-RARa NPM-RARa STAT5b-RARa t(15;17) insertions t(11;17) (q23;q21) t(11;17) (q13;q21) t(5;17) der(17) > 95% 1% 1 cas < 1% RT-PCR ?

Translocations t(15;17) Bcr3 Bcr2 Bcr1 Exons 3 4 5 6 7a 3 4 PML chromosome 15 RARa chromosome 17 Bcr1 : 60% Bcr2 : 10% Bcr3 : 30% RARa-PML exprimé chez seulement 75% des patients

Protocole de RT-PCR Nichée exon 3 bcr 3 bcr 2 bcr 1 exon 3 Points de Cassure t(15,17) PML RAR Diagnostic et MRD Typage O1 M7 RAR PML PCR N°1 O7 O8 RAR PML R5 M7 RAR PML PCR N°2 bcr3 bcr2 bcr1 MW bp 2072 Bcr3 bcr2 bcr1 MW bp 600 2072 600 100 100 Sensibilité: 10-5 à 10-6

Pronostic selon le typage Bcr Event-free survival Time to relapse after remission ,1 ,2 ,3 ,4 ,5 ,6 ,7 ,8 ,9 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 ,1 ,2 ,3 ,4 ,5 ,6 ,7 ,8 ,9 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 bcr2, bcr3 bcr1 p= 0.05 bcr2, bcr3 bcr1 p= 0.06 months months Overall survival ,1 ,2 ,3 ,4 ,5 ,6 ,7 ,8 ,9 1 N= 110 bcr2, bcr3 bcr1 p= 0.05 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 months

RT-PCR standard après le diagnostic (APL93) 4 - 6 mois après diagnostic N = 84 Nombre de prélèvements % de prélèvements 50 10 20 30 40 50 60 70 Positif (%) Négatif (%) Bcr1 Bcr2+3 total 40 Bcr1 30 P= 0.61 Bcr2+3 20 10 Positif Négatif 12 mois après diagnostic N = 65 Nombre de prélèvements % de prélèvements 10 20 30 40 50 Positif Négatif 10 20 30 40 50 Positif (%) Négatif (%) Bcr1 Bcr2+3 total Bcr1 Bcr2+3

PCR standard après 4 - 6 mois (APL93) et Différenciation in vitro au diagnostic N= 37 Nombre de Patients % de Patients 5 10 15 20 <50% >50% PCR positive PCR négative 0% 20% 40% 60% 80% <50% >50% PCR positive PCR négative P= 0.038 % de cellules différenciées à J3 de culture % de cellules différenciées à J3 de culture

PCR standard après 4 - 6 mois (APL93) et Risque de Rechute N= 84 Nombre de Patients % de Patients 5 10 15 20 25 30 35 PCR Positive Négative rechute + rechute - 20 40 60 80 100 Positif Négatif rechute + (%) rechute - (%) P= 0.010 Valeur Prédictive Négative= 82.5 %

Approches par RT-PCR standard Sensibilité importante (10-6) - 50% des patients positifs après consolidation - 80% des patients négatifs post-conso ne vont pas rechuter - incapacité à prédire le pronostic des patients encore positifs - positivité de patients en rémission à long terme Sensibilité médiocre (10-4) - < 10% des patients sont positifs après consolidation : mauvais pronostic - incapacité à prédire le pronostic des patients négatifs: 30% des rechutes sont précédées d ’une PCR négative - forte probabilité (70%) de rechute des patients se repositivant - essai de traitement de la rechute moléculaire : allo BMT

RT-PCR Quantitative en temps réel

PCR quantitative en temps réel Idée: suivre l ’apparition des produits de PCR au fur et à mesure de leur formation et non plus en point final But: détecter le point de démarrage de la partie exponentielle de la réaction qui est proportionnelle à la quantité initiale de matériel Moyen: générer un signal fluorescent proportionnel à la quantité de matériel et suivre la fluorescence au cours de la réaction

Agents Intercalants

Sonde Taqman Polymérisation R = Reporter Q = Quencher Amorce sens R Q 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ Amorce antisens Déplacement du brin R Q 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ R Clivage Q 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ R Fin de la polymérisation Q 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’

REPRESENTATION DU SYSTEME DE DETECTION DE LA FLUORESCENCE (Abi Prism 7700) Source laser Spectrographe Lentille Miroir dichroïque Fibres optiques Plaque 96 puits Multiplexer

Accumulation des produits de PCR Seuil Cycle Seuil = Ct

Gamme de plasmides: dilutions de 10 en 10 Ct des différentes dilutions

Gamme de plasmides: dilutions de 10 en 10

Marqueur Temps +++ + + +++ Diagnostic Rechute Maladie Résiduelle PCR Standard _ _ +++ + + +++ Temps Marqueur Diagnostic Pronostic Réponse traitement Suivi Rechutes PCR Quantitative

Protocole de RT-PCR Quantitative en temps réel Sonde Bcr1 1 2 3 4 5 6 RARa PML Sonde Bcr2 1 2 3 4 5 6 RARa PML Sonde Bcr3 1 2 3 Normalisation par rapport à un gène de ménage: Housekeeping gene

RQ-PCR: intérêt potentiel : Gallagher et al. Blood 2003 Comparaison Moelle - Sang

RQ-PCR: intérêt potentiel : Gallagher et al. Blood 2003 Risque de rechute et DFS selon cutoff de positivité après consolidation

RQ-PCR: nombre de copies au diagnostic et après 1 mois 107 106 105 Nombre de copies au diagnostic 104 103 102 10 Indétectable Diagnostic 1 mois

RQ-PCR: Positivité et Différenciation au diagnostic 1 mois après le Diagnostic N= 15 2 4 6 8 10 12 <50% >50% Positif Négatif Nombre de patients % de cellules différenciées à J3 de culture p=0.022 Corrélation entre différenciation au diagnostic et positivité en RQ-PCR à 1 mois

Suivi par RQ-PCR: Exemple de résultat Rechute 106 105 104 Nombre de Copies Normalisé 103 102 10 Indétectable Mois

Conclusion Méthode de choix: RQ-PCR - quantifier la qualité des échantillons - suivi cinétique de la réponse au traitement - suivi cinétique d ’une re-positivation - évaluer des seuils Objectifs : - établir un schéma précis des temps de prélèvements - Sang ou moelle ? - établir des seuils prédictifs de l ’évolution des patients * seuil après traitement : Induction? Consolidation? * seuil de re-positivation * seuil de positivité d ’un échantillon pour autogreffe - standardisation Question : traitement de la rechute moléculaire? Arsenic?

Protocole de prélèvements dans la leucémie aiguë à promyélocytes Induction Consolidation Entretien Rémission Début Fin Fin 1/6 mois 1/6 mois MOELLE RQ-PCR Entretien Rémission 1/3 mois 1/6 mois SANG RQ-PCR

Références Bibliographiques - David Grimwade The significance of minimal residual disisease in patients with t(15;17) Best Practice and research Clinical Haematology Vol15, n°1, p137-158, 2002 - Grimwade D, Lo Coco F Acute promyelocytic leukemia: a model for the role of molecular diagnosis and residual disease monitoring in directing treatment approach in acute myeloid leukemia. Leukemia. 2002 Oct;16(10):1959-73. - Gallagher RE et al. Quantitative real-time RT-PCR analysis of PML-RARa mRNA in acute promyelocytic leukemia: assessment of prognostic significance in adult patients from intergroup protocol 0129 Blood Vol 101, n°7 p2521-2528, 2003