Outils biologiques hématologiques 1) Morphologie 2) Cytométrie en flux immunophénotype cycle cellulaire 3) Cytogénétique conventionnelle et moléculaire 4) Biologie moléculaire

1) Morphologie Frottis sanguin myélogramme cytochimie

2) Cytométrie en flux Technologie permettant de faire défiler des cellules à grande vitesse dans le faisceau d ’un laser la lumière ré émise (diffusion ou fluorescence) permet de classer la population suivant différents critères et de les trier la lumière diffusée renseigne sur le contenu de la cellule (granularité) la lumière absorbée proportionnellement au diamètre de la cellule (taille) la fluorescence est apportée par un fluorochrome qui absorbe l ’énergie du laser et émet une fluorescence dans une longueur d ’onde différente fluorochrome avec affinité pour l ’ADN (contenu en ADN) fluorochrome fixé sur un anticorps

Cytomètre en flux De 1 à 8 Ac incubés avec les cellules

Applications de la cytométrie en flux: 1) immunophénotypage Couplage d ’un fluorochrome sur un Ac si l ’ Ac se fixe sur une cellule: mise en évidence de l ’expression de l ’antigène il existe une batterie de fluorochromes émettant à des longueurs d ’onde différentes (couleurs) les analyseurs peuvent étudier jusqu ’à 8 couleurs simultanément, donc 8 marqueurs potentiellement permet de déterminer la densité antigénique à la surface (ou intracytoplasmique) des cellules

Spécificité des marqueurs Marqueur pan-leucocytaire: CD45 cellules immatures: CD34, CD117, HLA-DR, TdT cellules myélo/monocytaires: CD13, CD33, CD11b, CD15, CD65 lignée plaquettaire: CD4, CD61, CD42b lymphocytes B: CD19, CD20, CD22, CD10 plasmocytes: CD38, CD138 lymphocytes T: CD3, CD4, CD8, CD5, CD2, CD7 cellules NK: CD16, CD56, CD57

appartenance à une lignée Permet le diagnostic des formes pour lesquelles la morphologie seule est insuffisante: cellules indifférenciées (blastes) cellules lymphoïdes (score de Matutes) appartenance à une lignée Évalue le degré de différenciation cellulaire diagnostic des HPN (expression CD55 et CD59 sur GR et PN) étude des sous-populations lymphocytaires (CD4 / CD8) sensibilité 1/1000: maladie résiduelle recherche des cibles thérapeutiques: rituximab – Mabthera® (anti-CD20) Alembtuzumab –Campath® (anti-CD52) gemtuzumab (anti-CD33)

Exemple d ’une leucémie lymphoïde chronique: CD5+ CD19+ kappa

Applications de la cytométrie en flux: 2) Contenu en ADN Utilisation de précurseurs fluorescents des bases nucléaires s'incorporant dans le DNA 5-bromo-deoxyuridine ou BrdU 5-iodo-deoxyuridine ou IdUrd

Cytogénétique Conventionnelle: caryotype moléculaire: FISH multi-FISH peinture chromosomique

Cytogénétique: 1) Caryotype réalisé sur sang, moelle ou ganglion mise en culture de l’échantillon en milieu nutritif (avec ou sans agents mitotiques) durée variable 24H ou 48H, parfois 72H blocage des métaphases choc hypotonique des cellules: éclatement de la membrane nucléaire fixation étalement sur lame, coloration et analyse au microscope: bandes chromosomiques au moins 20 métaphases analysées

ORIGINE GENETIQUE ACQUISE DES LEUCEMIES :REMANIEMENTS CHROMOSOMIQUES (DE L'ADN)

CONSEQUENCES MOLECULAIRES DES REMANIEMENTS CHROMOSOMIQUES :MODIFICATION DE GENES CIBLES =>ACTIVATION D'ONCOGENES =>INACTIVATION DE GENES SUPPRESSEURS DE TUMEUR -(ANTIONCOGENES)

2) Cytogénétique moléculaire:FISH Hybridation in situ fluorescente (FISH) Visualisation de la région chromosomique couverte par la sonde: à l ’échelle d ’un gène (qq dizaines de kilobases) à l'échelle d ’un chromosome: peinture chromosomique plusieurs couleurs possibles: permet de mettre en évidence des anomalies précises au niveau génomique: ex bcr-abl

Caryotype (cytogénétique conventionnelle)

IGH/MALT1 t(14;18)(q32;q21) IGH/CCND1

Peinture chromosomique

Multi-FISH

Outils moléculaires: PCR +++ PCR standard PCR quantitative sonde fluorescente

Place des analyses moléculaires A la différence du caryotype, chaque PCR ne détecte qu ’une et une seule anomalie intérêt: pas tant sur le diagnostic (cytogénétique) que sur le suivi: maladie résiduelle problème: plusieurs centaines d’anomalies caractérisées PCR développées sur les anomalies les plus fréquentes examens guidés par les données de la cytogénétique (partenaires de MLL par ex)

Fin du diaporama, des exemples suivent

Hémopathies lymphoides chroniques

1) Hémopathies chroniques lymphoïdes B LLC Manteau Burkitt L. Folliculaire L. Grandes cell Tous ont réarrangé leur Ig + anomalies spécifiques

Identification du réarrangement clonal IgH: Différentes familles de segments V Différentes familles de segments J: Plusieurs types de PCR nécéssaires (séquences consensus) •variabilité clonale (mutations): absence de détection (10%) Perte du clone pendant l’évolution

LNH du manteau et expression de la cycline D1 CCND1 CCND2 CCND3 02-020 02-021 02-022 NEG CTRL POS CTRL Non exprimée dans les lymphocytes normaux Conséquence moléculaire de la t(11;14)(q12; q32) (70% des cas au caryotype) Non spécifique du lymphome du manteau: Leucémie Prolymphocytaire B Myélome SLVL Sa positivité (taux significatifs) élimine le diagnostic de LLC

Hémopathies lymphoïdes chroniques T: Détection des RR du TCR Chronologie des réarrangement TCR TCRg , d puis TCRb, TCRa en dernier Stratégies diagnostiques biologique: Détection RR g et d Détection d’un clone T (minoritaire) faux positif? Clone Réactionnel? Faible variabilité (V gamma du sujet agé) Pas de translocations analysables par PCR

Intérêt de la bio. mol. au diagnostic 1) mise en évidence d ’une anomalie génétique en cas de classification difficile: Mise en évidence d’une translocation spécifique IgH-Bcl2, NPM-ALK, … Détection de l’expression anormale d’un gène CCND1 Point de départ pour l’étude de la maladie résiduelle 2) étude de la clonalité lymphoïde: Étude du profil des réarrangements IgH/TCR doute sur une hyperplasie réactionnelle pathologies inflammatoires

Syndromes myéloprolifératifs LMC Splénomégalie myéloïde Maladie de Vaquez Thrombocytémie essentielle LMMC

Leucémie myéloïde chronique t(9;22)(q34;q11): fusion entre extrémité 5’ de BCR et 3’ d’ABL Points de cassure: dans ABL: intron 1 ou 2 dans bcr: M-bcr: p210 (b2a2 b3a2) m-bcr p190 (e1a2) µ-bcr: p230 (e19a2) Récemment: p200 (e8-int-a2)

Utilité de la biologie moléculaire dans la LMC Diagnostique (+/-) dans les formes complexes SMP atypique cytologiquement Phi masqué (CG conventionnelle) Pronostique: quantification cinétique de disparition du transcrit: pronostique? Maladie résiduelle nouvelles thérapeutiques (STI) greffes

Bio. Mol des autres syndromes méloprolifératifs Pas de marqueur clonal (cellules non lymphoïdes) <=> nouveau marqueur JAK2 >90% des polyglobulies primitives 50% de TE et des MF Analyse de l ’inactivation de l ’X peu (pas) employée: techniques lourdes réalisables uniquement chez la femme démontré dans 70% des cas de SMP faux positifs 25-50% des femmes agées

Lymphoblastiques Myéloblastiques Leucémies aigues Lymphoblastiques Myéloblastiques

LA myéloblastiques Classification WHO: anomalies récurrentes: translocations +++ t(15;17) (PML RARA) 5 - 8% / (LAM3) t(8;21) (AML1- ETO) 5 - 12% / (LAM2) inversion du 16 (CBFb-MYH11) 10-12% (LAM4) anomalies du 11q23: MLL 5-6% (LAM0-5) Autres: classification FAB + dysplasie LA de lignée ambiguë RT-PCRs spécifiques développées

LA lymphoblastiques anomalies chromsomiques (oncogéniques) LAL-B t(9;22) BCR-ABL t(4;11) AF4- MLL t(5,14) IL3-IgH LAL-T HOX11 / HOX11L2 TAL deletion, SIL-TAL CALM-AF10 t(1;19) E2A-PBX1 t(8;14) cMyc-IgH t(12;21) ETV6-AML1 t(11;14) LMO1/2 t(1;7) LCK Inv14: TCL1 …

LA lymphoblastiques : réarrangement clonal du récepteur à l ’Ag Lignée lymphoïde: B: réarrangement IgH T: réarrangement TCR Réarrangements illégitimes Lignée B: réarrangements TCR+++ = Marqueurs de clonalité, en dehors (ou en plus) d’anomalies détectables

Clonalité lymphoïde et LAL Clonalité TCR Pas d’intérêt diagnostique mais identification au diagnostic+++ Suivi = maladie résiduelle = quantification Genescan RQ-PCR Protocole GOELAL pilote: Décisionnel à 10-3