Microbiologie alimentaire et industrielle La microbiologie dans un aliment Critère QUALITE TECHNOLOGIE DE TRANSFORMATION Matière première Utilisation de levains Qualitatif quantitatif Produit fini CONNAITRE Les PRINCIPES et la PRATIQUE Les Germes utilisés Les techniques mises en oeuvres

OBJECTIFS ENSEIGNEMENT A l’issue de l’enseignement PRATIQUE de M.A.I. L’élève ingénieur CAPABLE Élaborer Pratiquer Le protocole de recherche des différentes flores d’un aliment Cette recherche de façon rigoureuse Interpréter Les résultats Citer les caractéristiques Connaître le principe -Des germes témoins d’une contamination fécale -Des germes pathogènes -Des principales flores technologiques -Des autres flores de contamination -Des méthodes rapides de dénombrement -Des techniques récentes de caractérisation et d’identification Réaliser une fermentation Interpréter les Résultats

UV551 Microbiologie générale et alimentaire Laboratoire de microbiologie Classe1 Classe 2 Enseignement Recherche UMR 1014 SECALIM INRA ENVN ENITIAA Equipe technique : Maguy Guilbot Sylvie Cabon - Isabelle Hue Martine Lebois Equipe enseignante : Hervé Prévost Bernard Onno - Djamel Drider Bénédicte Sorin -Marie-France Pilet - Xavier Dousset

LES MOYENS spécifique à la MICROBIOLOGIE Laboratoires de TRAVAUX PRATIQUES BLOUSE spécifique Autoclavage en fin d’UV SEANCES DE TP : préparation en salle TD TP : séance 2 à 4h TP lecture 2h manipulation par binôme 1 même TP pour tous

POLYCOPIE bleu Cours, TD, TP Sans document Module STAa DOCUMENTS INDISPENSABLE DOC de base POLYCOPIE bleu Fiche TP Cahier de Labo Fiches Résultats EVALUATION 1h45 Devoir écrit sur l’ensemble de L’UV 551 Cours, TD, TP Sans document (2ème partie avec calculette si besoin) Module STAa Microbiologie Générale Alimentaire Coeff. : 1 UV554 : Génie Alimentaire Coeff. : 1.5

Hygiène dans l’entreprise cours TD TP La cellule microbienne Métabolisme microbien Les facteurs de contamination TD1 Hygiène dans l’entreprise TP1 Hygiène dans l’entreprise – Observations macroscopiques et microscopiques de micro-organismes Le développement microbien TD2 – TD3 Croissance bactérienne TP2- TP3 Techniques de dénombrement et d’isolement Les levures Les moisissures Les virus TP1 Bactéries – Levures- Moisissures : Observations macroscopiques et microscopiques TP4 Identification Levures - moisissures UV 522 :EPI Panification

UV 651 Qualité Microbiologique des Denrées Alimentaires Pré requis : UV 551 Cours TD et TP Flores d’altération Flore pathogène TIAC Analyse microbiologique Alimentaire Identification bactérienne, immunologie

et hygiène des aliments Caractérisation de souches par TP 2ème Année TP tournants par groupes de 8 à 10 étudiants UV Stabilisation et hygiène des aliments *TP Salle blanche *TP Cuisson Stérilisation EPI jus de pomme et lait fermenté suivi production Yaourt UV Ecologie et hygiène des aliments Caractérisation de souches par techniques de BIOLOGIE MOLECULAIRE

matériel à usage unique milieux TP 1 LE LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE SPECIFICITE ORGANISATION Choix de FONCTIONNEMENT équipement personnel matériel rapidité locaux coûts matériel à usage unique milieux matériel réutilisable PROTOCOLE d’entrée et de sortie

LES MANIPULATIONS ORGANISATION tout prévoir poste de travail matériel milieux PROPRETE blouse ongles cheveux paillasse RIGUEUR gestes ASEPTIE mains,environnement COMPORTEMENT calme ,ne parler qu’au strict minimum DECONTAMINATION Paillasse : Asphène® Mains : Phagodoux® Pipettes : Techline® Öse : flamme

P.A.L.M.E.S. LES SOURCES DE CONTAMINATION Personnel Locaux Air Surfaces Matériel Eau Échantillon

AUTOCLAVAGE PREPARATION DES MILIEUX DE CULTURE fiche fournisseur fermer boite Pesée poudre + eau distillée mélange ébullition éclaircissement Sous hotte chimique « poudre » Parfois produits toxiques pH répartition AUTOCLAVAGE ~15-20 min 110-120°C PARFOIS milieu de base autoclavé PUIS + composants thermolabiles [glucides++],Vitamine, jaune d’œuf,sulfaméthazine Baird Parker

I-SOURCES DE CONTAMINATION (1) 1- Ecouvillonnage de 1 cm2de votre main Mise en suspension dans 1 ml d’eau physiologique (eau ) ensemencement sur Pétrifilm Flore Totale . Numération après incubation30°C 24-48H .   2-Action du nettoyage avec diverses substances par passage des doigts sur milieu gélosé PCA (Plate Count Agar ) (annexe 3-9) brossage soigné pour certains binômes, simple lavage pour d’autres . A : doigt non lavé B : doigt lavé à l’eau C : doigt lavé au savon antiseptique D : doigt lavé à l’alcool E : doigt lavé à l’Asphène® 3-Rôle d’un masque protecteur : Postillonner sur un milieu PCA >avec un masque >sans masque 4-Déposer un cheveu sur une boîte de PCA .

I-SOURCES DE CONTAMINATION (2) *5-Porteurs sains de Staphylococcus aureus  *Écouvillonnage du nez : ensemencement d’un milieu de BAIRD-PARKER (annexe 3-1)   6-Air : Contrôle d’ambiance : *Boîte de PCA ouverte 10 min (lieu au choix) *7-Les surfaces : *Application d’une boîte contact sur une surface au choix . *Application de lames contact sur une surface : démonstration *Contrôle qualitatif de la propreté d’une surface : Test Hygi-Pro : démonstration

Révélation de caractères biochimi- ques Milieu de Baird Parker : Milieu sélectif Spécifique des Staphylocoques Caractère électif du milieu Caractère sélectif du milieu Révélation de caractères biochimi- ques Tryptone Extrait de viande Extrait de levure Base de nutriments Pyruvate Glycine Stimulateur croissance Staphyloco-ques Chlorure de lithium Inhibition flore II aire [ glycine] +++ Sulfamétha-zine Inhibition Proteus Tellurite de K Réduction : tellure Colonies noires Jaune d’oeuf Protéolyse Halo d’éclaicis-sement Lécithinase « Zone opaque »

II-OBSERVATIONS DE SOUCHES PURES, 1-macroscopique de colonies bactéries (Pseudomonas fluorescens, Micrococcus luteus) levures (Saccharomyces cerevisiae) moisissures (Penicillium)   2-microscopique : état frais des souches de bactéries et de levures  

TP2 I LE DENOMBREMENT 1.1-DIRECT (par binôme) -a- Cellule de Malassez : levures Compter dans 2 rectangles . Exprimer le résultat en nombre de cellules par ml de jus de pommes après avoir fait la moyenne entre différents binômes sur 10 rectangles . -b- Méthode de BREED bactéries A partir d’une dilution au 1/10 de yaourt La lame de REICH : Compter sur 2 champs Exprimer le résultat en nombre de cellules par ml de yaourt, après avoir fait la moyenne entre différents binômes sur 10 champs .

Dénombrement des microorganismes Stomacher Broyage pesée Dans le cas d'un PRODUIT LIQUIDE, l'échantillon constitue la solution mère 100 p.108 270 ml de diluant

ASEPTIE DILUTIONS PRÉCISION Précautions : ► agiter l'erlen pour homogénéiser la suspension à diluer. ►n'introduire que la pointe de la pipette dans le liquide ►.aspirer-refouler le liquide une fois ►à chaque étape il sera nécessaire de changer de pipette et de bien agiter le tube avant de prélever ► puis transférer dans le tube de dilution suivant avant de prélever.

Technique de BREED Numération directe Bactéries 10 μl sur 1 cm² p.35 Technique de BREED Lame de REICH Dénombrement du nombre de cellules sur une surface de 0,028 mm² = champ microscopique (microscope Olympus CH2) 10 μl sur 1 cm²

Numération directe Levures *p.34 

1.2-DENOMBREMENT INDIRECT Échantillon : suspension A. de E.coli Diluer A jusqu’au 1/1.000.000 (10-6) dans des tubes de T.S de 9 ml : dilutions successives. -a-En profondeur sur PCA (1 ml)  2 boîtes par dilution -2, -3, -4 -b-En surface  sur PCA (0,1 ml): 2 boîtes par dilution -1, -2, -3 . -c-En tubes de BLBVB (Bouillon Lactosé Bilié au Vert Brillant) + cloche. 1 ml de ces dilutions par tubes 2 tubes par dilutions pour les dilutions : -3,-4, -5, -6 . N.B : Les échantillons faiblement contaminés (par ex. l’eau) peuvent être filtrés sur une membrane stérile, celle-ci sera déposée sur milieu solide puis mise en incubation 

Numération indirecte En profondeur 2 boîtes par dilution 1 ml déposé 1 pipette par série : moins concentré vers le plus concentré 2 boîtes par dilution *p.27-28 Milieu de culture en surfusion 1 ml Solution mère ou dilution

Numération indirecte En profondeur -1 -2 -3 -4 Dilution du produit pour obtenir la solution mère Moyenne colonies comptées R = x . 1/DSm . 1/Dd. 1/V Résultat UFC/ml Unités Formant Colonie Dilution de la solution mère sur les boîtes comptées Volume déposé sur les boîtes V= 1 ml

Numération indirecte En surface R = x . 1/DSm . 1/Dd. 1/V 0,1 ml déposé R = x . 1/DSm . 1/Dd. 1/V V = 0,1 ml étalement en surface

Ensemencement 1 ml de chaque dilution *p.31-32 Numération indirecte En milieu liquide un germe présent provoque un trouble du milieu + gaz Ensemencement 1 ml de chaque dilution 2, 3 ou 5 tubes par dilution 1ml 1ml 1ml + + + + + - - + - - - - 3 dilution -1 2 dilution -2 1 dilution -3 dilution -4 dilution -3 dilution -4 1dilution -1 dilution -2 321 table de Mac Grady qui donne 15 germes/ml de dilution 10-1 soit 1,5.102 germes/gr ou ml d'échantillon

MILIEU BLBVB ( Bouillon Lactose Bilié au Vert Brillant + cloche ) (Annexe 3-14) *BILE inhibiteur de Gram +   *VERT BRILLANT inhibiteur de Bacillus *LACTOSE/CLOCHE fermentation avec production de gaz

SABOURAUD + chloramphénicol 26°C 72H 44°C 48H VRBL 30°C 24-48H II ISOLEMENT Obtenir une culture pure en vue de son utilisation ultérieure par technique 4/4 et sélection éventuelle par la température d’incubation, le milieu, la thermorésistance. mélange M : E.coli + levure pigmentée ; Rhodotorula + Bacillus sporulé isolements méthode des quadrants (4/4) Milieu Incubation PCA 30°C 48H SABOURAUD + chloramphénicol 26°C 72H 44°C 48H VRBL 30°C 24-48H PCA, après traitement de l’échantillon 10 min à 80°C 30°C 48H Remarque : La nature du germe peut être vérifiée par observation microscopique

*Désoxycholate °inhibiteur de Gram + MILIEU VRBL Gélose Lactosée au Violet Cristal au Rouge Neutre et à la Bile (Annexe 3-14) *Désoxycholate °inhibiteur de Gram +   °inhibiteur de nombreux Gram Θ sauf E.coli *Violet cristal °Inhibiteur de Gram + *Citrate de sodium °inhibiteur de flore secondaire *Lactose °fermentation lactose /Rouge neutre 6.8 < pH < 8 rouge bleuâtre jaune orangé