« Réponses Moléculaires et Cellulaires aux Xénobiotiques » Journée Interdisciplinaire de la Qualité de l’Air Association pour la Prévention des Pollutions Atmosphériques Rôle des composés organiques et métalliques dans la résistance à la mort cellulaire conférée par des particules fines (PM2,5) urbaines Mélanie Leroux Laboratoire RMCX « Réponses Moléculaires et Cellulaires aux Xénobiotiques » Thèse encadrée par le Dr. Karine Andréau

Les particules atmosphériques et leurs effets sur la santé Effets à court terme: Composition PM2.5 : Composés organiques Composés biologiques Métaux Cœur carboné ↗ Morbidité et mortalité cardio-respiratoire Stress oxydant Génotoxicité Réponse inflammatoire Modulation de l’apoptose Particules Grossières (PM10) 10 à 2,5µm Particules Fines (PM2.5) 2,5 à 0,1µm Effets à long terme: ↗ Maladies respiratoires chroniques: asthme, BPCO… Cancers broncho- pulmonaires Accumulation des PM au niveau des parois bronchiques et remodelage bronchique Particules Ultrafines (PM0.1) ≤ 0,1µm

Source(s) principale(s) identifiée(s) Particules étudiées Particules PM2.5 Lieu de prélèvement Source(s) principale(s) identifiée(s) Trafic Périphérique parisien Trafic automobile Fond urbain Vitry-sur-Seine Pollution urbaine de fond Chauffage au bois Banlieue parisienne (hiver) Mixtes Centre ville de Ouagadougou (Burkina-Faso) Cuisson au bois, Trafic mobylettes

Questions posées Ces particules sont-elles toxiques (à 10µg/cm²) pour des cellules épithéliales bronchiques humaines (16HBE)? Ces particules ont-elles un effet de résistance à la mort cellulaire par apoptose? Quels sont les composés responsables des effets observés?

Questions posées Ces particules sont-elles toxiques (à 10µg/cm²) pour des cellules épithéliales bronchiques humaines (16HBE)? 10µg/cm²: exposition de 5 jours à la pollution atmosphérique (assez forte (79µg/m3)) Ces particules ont-elles un effet de résistance à la mort cellulaire par apoptose? Quels sont les composés responsables des effets observés?

Ces particules sont-elles toxiques pour des cellules épithéliales bronchiques humaines? Mort cellulaire ? APOPTOSE Particules 24 H Cytométrie en flux 16HBE

L’apoptose Apoptose Diminution de la taille Bourgeonnement de la membrane plasmique Modification de la granulosité ↘ ΔΨm Stress ox Condensation de la chromatine Fragmentation de l’ADN et du noyau Modifications membranaires Perméabilisation de la membrane plasmique Apoptose

L’apoptose Quantification de la mort par apoptose en cytométrie en flux Diminution de la taille Bourgeonnement de la membrane plasmique Modification de la granulosité ↘ ΔΨm Fluorescence du DiOC6(3) en vert dans la mitochondrie Stress ox Condensation de la chromatine Fragmentation de l’ADN et du noyau Modifications membranaires Fluorescence de l’ Hydro Ethidine HE en rouge dans le noyau Perméabilisation de la membrane plasmique Fluorescence du Iodure de Propidium (IP) en rouge dans le noyau Apoptose

Ces particules sont-elles toxiques pour des cellules épithéliales bronchiques humaines? * p< 0.001 vs Témoin n=3 * Trafic 10µg/cm² Fond urbain 10µg/cm² Chauffage au bois 10µg/cm² Mixtes 10µg/cm²

Questions posées Ces particules sont-elles toxiques (à 10µg/cm²) pour des cellules épithéliales bronchiques humaines (16HBE)? NON Ces particules ont-elles un effet de résistance à la mort cellulaire par apoptose? Quels sont les composés responsables des effets observés?

Questions posées Ces particules sont-elles toxiques (à 10µg/cm²) pour des cellules épithéliales bronchiques humaines (16HBE)? NON Ces particules ont-elles un effet de résistance à la mort cellulaire par apoptose? Quels sont les composés responsables des effets observés?

(« effet anti-apoptotique ») Ces particules ont-elles un effet de résistance à la mort cellulaire par apoptose? (« effet anti-apoptotique ») Cancérisation PROMOTION RESISTANCE à l’APOPTOSE INITIATION Adduits ADN Cellule initiée Cellule cancéreuse Particules atmosphériques Cancers broncho-pulmonaires Etudes épidémiologiques

Ces particules ont-elles un effet de résistance à la mort cellulaire par apoptose? Inducteur A23 Mort cellulaire ↗CALCIUM ? APOPTOSE Inducteur d’apoptose A23 Particules 4 H 20 H Cytométrie en flux v v v v v v v v 16HBE

Ces particules ont-elles un effet de résistance à la mort cellulaire par apoptose? * p< 0.001 vs A23 seul n=2 * Trafic 10µg/cm² Fond urbain 10µg/cm² Chauffage au bois 10µg/cm² Mixtes 10µg/cm² + A23

Fluorescence Fluo4 dans la cellule Lecture de fluorescence Ces particules ont-elles un effet de résistance à la mort cellulaire par apoptose? Rôle du calcium? Inducteur A23 Mort cellulaire ↗CALCIUM Fluorescence Fluo4 dans la cellule ? APOPTOSE Particules Inducteur d’apoptose A23 Fluo 4 4 H 30min Lecture de fluorescence v v v v v v v v v v v v

Ces particules ont-elles un effet de résistance à la mort cellulaire par apoptose? Rôle du calcium? * p<0.05 vs A23 seul n=6 Fluorescence ((F/F0)-1) Milieu Trafic 10µg/cm² Fond urbain 10µg/cm² + A23

Questions posées Ces particules sont-elles toxiques (à 10µg/cm²) pour des cellules épithéliales bronchiques humaines (16HBE)? NON Ces particules ont-elles un effet de résistance à la mort cellulaire par apoptose? OUI : PM Trafic Lien avec le calcium Quels sont les composés responsables des effets observés?

Questions posées Ces particules sont-elles toxiques (à 10µg/cm²) pour des cellules épithéliales bronchiques humaines (16HBE)? NON Ces particules ont-elles un effet de résistance à la mort cellulaire par apoptose? OUI : PM Trafic Lien avec le calcium Quels sont les composés responsables des effets observés?

? Quels sont les composés responsables des effets observés? Composition PM2.5 : Composés organiques Composés biologiques Métaux Cœur carboné Inducteur A23 Composés hydrosolubles (métaux) ? désorption Composés organiques HAP

Quels sont les composés responsables des effets observés? Métaux (mg/g) : Fer Aluminium Cuivre Trafic 13,2 3,4 0,86 Fond urbain 21,6 20,4 0,40 Fer : - Fe2+ : Sel Mohr ((NH4)2Fe(SO4)2, 6H2O) - Fe3+ : Chlorure de Fer (FeCl3) Aluminium : - Al3+ : Chlorure d’aluminium (AlCl3) Cuivre : - Cu2+ : Chlorure de cuivre (CuCl2) ou Sulfate de cuivre (CuSO4) Inducteur d’apoptose A23 Métaux 4 H 20 H Cytométrie en flux

Quels sont les composés responsables des effets observés? ** p<0.001 vs A23 seul p< 0.05 vs A23 seul n=6 * * ** Milieu Trafic 10µg/cm² Fe2+ 132ng/cm² Fe3+ 132ng/cm² Al3+ 34ng/cm² Cu2+ 8,6ng/cm² + A23 Milieu Fond urbain 10µg/cm² Fe2+ 216ng/cm² Fe3+ 216ng/cm² Al3+ 204ng/cm² Cu2+ 4,0ng/cm² + A23

Questions posées Ces particules sont-elles toxiques (à 10µg/cm²) pour des cellules épithéliales bronchiques humaines (16HBE)? NON Ces particules ont-elles un effet de résistance à la mort cellulaire par apoptose? OUI : PM Trafic Lien avec le calcium Quels sont les composés responsables des effets observés? Métaux : Fer, Aluminium, Cuivre

CONCLUSIONS Ces particules sont-elles toxiques (à 10µg/cm²) pour des cellules épithéliales bronchiques humaines (16HBE)? NON Ces particules ont-elles un effet de résistance à la mort cellulaire par apoptose? OUI : PM Trafic Lien avec le calcium Quels sont les composés responsables des effets observés? HAP (Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques) Métaux : Fer, Aluminium, Cuivre

Perspectives Etude de l’effet d‘autres particules et métaux: Zinc, Plomb, Magnésium, Manganèse, Calcium … Etude des mécanismes impliqués dans l’effet anti-apoptotique: - effet des métaux sur le calcium intracellulaire - rôle des caspases et calpaïnes - rôle du stress oxydant - rôle de la mitochondrie

Merci de votre attention !