Applications de marqueurs immunotoxicologiques en écotoxicologie

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1 Applications de marqueurs immunotoxicologiques en écotoxicologie
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2 PLAN Survol historique Considérations toxicologiques
Approches en immunotoxicologie Conckusions 2

3 SURVOL HISTORIQUE 1884 La phagocytose 1890 Les anticorps
1901 Les groupes sanguins Les bases cellulaires de l’immunité Les bases moléculaires de l’immunité 1975 L’immunopharmacologie 1980 L’immunotoxicologie · cibles (1983) · résistance (1985) 3

4 Y Réponse immunitaire non-spécifique Réponse immunitaire spécifique
Prolifération lymphoblastique Présentation de l’Ag Réactions inflammatoires Phagocytose Activité cytotoxique Y Sécrétion d’anticorps Réponse immunitaire cellulaire Réponse immunitaire humorale Tc B Th NK Je revenir sur l’organisation générale de la réponse immunitaire afin de situer en quelque sorte les fonctions les plus utilisées en tant que biomarqueurs d’immunotoxicité. La réponse immunitaire non-spécifique comprend comme je vous l’ai mentionné: l’activité cytotoxique des cellules NK qui vont reconnaître et détruire les cellules infectées ou les cellules néplastiques, ce en dehors de toute reconnaisance préalable par les acteurs de l’immunité spécifique

5 Y Réponse immunitaire non-spécifique Réponse immunitaire spécifique
Phagocytose Réactions inflammatoires Présentation de l’Ag B Réponse immunitaire humorale B Activité cytotoxique Tc NK Th Réponse immunitaire cellulaire Th Tc B Prolifération lymphoblastique Importance de regarder au travers de plusieurs fenêtres du SI car phénomène de compensation Y Sécrétion d’anticorps Phénotypage

6 ASPECTS RÉGLEMENTAIRES
Santé humaine ? Santé des écosystèmes ? CONSIDÉRATIONS TOXICOLOGIQUES 4

7 CONSIDÉRATIONS TOXICOLOGIQUES
1. Fiabilité et reproductibilité des méthodes 2. Sensibilité des paramètres sélectionnés 3. Allure de la courbe dose-réponse 5

8 1. FIABILITÉ ET REPRODUCTIBILITÉ DES MÉTHODES
6

9 PROGRAMME INTERNATIONAL D ’HARMONISATION
PROTOCOLE 10 laboratoires d ’Europe et des États-Unis Rat Réponse humorale par la technique des plages de lyse (PFC) Azathioprine composé modèle Résultats exprimés en pourcentage de la réponse du laboratoire de référence 7

10 Y Réponse immunitaire non-spécifique Réponse immunitaire spécifique
Prolifération lymphoblastique Présentation de l’Ag Réactions inflammatoires Phagocytose Activité cytotoxique Y Sécrétion d’anticorps Réponse immunitaire cellulaire Réponse immunitaire humorale Tc B Th NK Je revenir sur l’organisation générale de la réponse immunitaire afin de situer en quelque sorte les fonctions les plus utilisées en tant que biomarqueurs d’immunotoxicité. La réponse immunitaire non-spécifique comprend comme je vous l’ai mentionné: l’activité cytotoxique des cellules NK qui vont reconnaître et détruire les cellules infectées ou les cellules néplastiques, ce en dehors de toute reconnaisance préalable par les acteurs de l’immunité spécifique

11 PRINCIPE DES PFC Complément GRM Splénocytes Chambre de Cunningham 8

12 PROGRAMME INTERNATIONAL D’HARMONISATION (Réponse humorale)
500 450 400 350 300 % LAB. RÉFÉRENCE 250 Dose 1 200 Dose 2 150 Dose 3 100 50 Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 9

13 2. SENSIBILITÉ DES PARAMÈTRES SÉLECTIONNÉS
18

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16 EFFET DES MÉTAUX LOURDS SUR LA PHAGOCYTOSE DES COELOMOCYTES CHEZ LE VER DE TERRE
35000 CdCl2 CdCl2 ZnCl2 30000 CH3HgCl HgCl2 25000 20000 Index de phagocytose 15000 10000 5000 1x10-9 1x10-8 1x10-7 1x10-6 1x10-5 1x10-4 Concentrations (M) 21

17 ANALYSE DES RÉSULTATS CI 50 DOSE % réponse normale 50 100 150 10 20 30
50 100 150 10 20 30 40 60 70 80 90 % réponse normale 22

18 IMMUNOTOXICITÉ COMPARATIVE DES MÉTAUX CHEZ LE VER DE TERRE (CI 50)
ZnCl2 CdCl2 HgCl2 CH3HgCl > 10 x 10-5 M 3.0 x 10-5 M 1.8 x 10-5 M 0.03 x 10-5 M 23

19 3. ALLURE DE LA COURBE DOSE-RÉPONSE
26

20 ALLURE DE LA COURBE DOSE-RÉPONSE
1: NOEL; 2: dose de référence; 3:dose 50 % ALLURE DE LA COURBE DOSE-RÉPONSE Effet Adulte 2 1 3

21 ALLURE DE LA COURBE DOSE-RÉPONSE
Effet Adulte Embryon 1 2 3 4 1: NOEL embryon; 2: dose de référence; 3: NOEL adulte; 4: dose 50% ALLURE DE LA COURBE DOSE-RÉPONSE

22 APPROCHES MODÈLES CLASSIQUES IN VITRO
3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE 4. TERRAIN 5. COMBINAISON 40

23 APPROCHES MODÈLES CLASSIQUES IN VITRO
3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE 4. TERRAIN 5. COMBINAISON 40

24 PROTOCOLE NON TRAITÉ VEHICULE DIELDRIN 1, 4, 7, 10, 14, 28, 42 DAYS
TESTS IMMUNOLOGIQUES MACROPHAGES B LYMPHOCYTES T LYMPHOCYTES

25 EFFETS DE LA DIELDRINE SUR LES CELLULES PRODUCTRICES D ’ANTICORPS
% Réponse normale 1/32 1/ / / /2 Dose (LD50)

26 IMMUNOTOXICITÉ DE LA DIELDRINE
MACROPHAGES B LYMPHOCYTES T LYMPHOCYTES PHAGOCYTOSE FLAMBÉE OXIDATIVE PROCESSING DE L ’ANTIGÈNE PFC LPS Ab CON A PHA MLR GVH

27 PROTOCOLE MODÈLE DE RESISTANCE NON TRAITÉ VEHICULE DIELDRINE
MURINE HEPATITIS VIRUS 3 Salmonella typhimurium

28 RESISTANCE AUX INFECTIONS
ANTI BACTERIENNE ANTI VIRALE S. typhymurium MHV 3 MORTALITÉ BACTÉRICIDIE PHAGOCYTOSE ANTICORPS MORTALITÉ ANTICORPS EFFETS CYTOPATIQUES RÉPLICATION

29 TOXIQUES BPC congenères 138, 153, 168, 180 Chlorure de mercure Chlorure de méthyl mercure Benzo-a-pyrene Chloride de cadmium Chlorure de zinc TCDD DDT, DDE Mélanges (synthétiues, effluents, sédiments) insecticides herbicides

30 RELATIONS TOXIQUE ET SYSTÈME IMMUNITAIRE
AUTOIMMUNITÉ SOI MODIFIÉ SOI SUSCEPTIBILITÉ AUGMENTÉE * INFECTIONS * CANCERS IMMUNOSUPPRESSION SYSTÈME IMMUNITAIRE ALLERGIES ELIMINATION RÉPONSE IMMUNITAIRE ANTI-X NON-SOI

31 IMMUNO COMPÉTENCE? CANCERS INFECTIONS CONTAMINANTS

32 APPROCHES MODÈLES CLASSIQUES IN VITRO
3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE 4. TERRAIN 40

33 LISTE DES ESPÈCES Mye Moule Mactre Choquemort Plie Truite Chien Chat
Poulet Aigle Caille Écureuil Rat Souris Ver de terre Phoque Béluga Ours polaire Cochon Bœuf Bœuf musqué Lama Élan Cheval Chèvre Mouton Alligator Grenouille 27

34 SENSIBILITÉ DES ESPÈCES HgCl2 CI50 (x 10-5)
Choquemort 0.08 Truite 0.13 Mye 0.48 Bœuf musqué 1.09 Bœuf 1.24 Lama 1.29 Aigle 1.40 Élan 1.43 Mouton 1.70 Ver de terre 1.80 Poulet 1.90 Cochon Rat Humain 28

35 Mercury concentrations (M) % Normal response (SI x 100)
20 40 60 80 100 120 140 10 - 9 8 7 6 5 4 CH 3 HgCl 2 Mercury concentrations (M) % Normal response (SI x 100) 20 40 60 80 100 120 140 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4 CH3HgCl HgCl2 Mercury concentrations (M) % Normal response (SI x 100) 20 40 60 80 100 120 140 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4 CH3HgCl HgCl2

36 PCB 138 PCB 180 PCB 156 PCB 153 * % proliferation concentration (ppm)
IC =89ppm 50 IC =44ppm IC =67ppm IC =73ppm * 25 75 100 10

37 APPROCHES MODÈLES CLASSIQUES IN VITRO
3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE 4. TERRAIN 5. COMBINAISON 40

38 PROCÉDURE EXPÉRIMENTALE
ZnCl 2 10 ug/l 50 ug/l CdCl 1 ug/l 5 ug/l Hg/Zn 0,3/30 ug/l 0,5/50 ug/l Cd/Zn 3/30 ug/l 5/50 ug/l CH 3 HgCl 0,1 ug/l 0,5 ug/l UN METAL Cd/Hg 3/0,3 ug/l 5/0,5 ug/l DEUX METAUX Cd/Hg/Zn 3/0,3/30 ug/l 5/0,5/50 ug/l TROIS METAUX Truite arc-en-ciel 30 jours d ’exposition

39 PARAMÈTRES Rein oxidative burst phagocytose macrophage PHA LPS ConA
cytométrie phagocytose macrophage PHA LPS ConA prolifération H 3 -thymidine lymphocyte lysozyme activité colorimétrie IgM ELISA serum Rein

40 CHLORURE DE CADMIUM % réponse du témoin -80 80 -100 -60 -40 -20 20 40
80 -100 -60 -40 -20 20 40 60 100 120 * * * 1ug/l * * * * * * * * * * * 5 ug/l % réponse du témoin Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM

41 CHLORURE DE MERCURE % réponse du témoin -100 -80 -60 -40 -20 20 40 60
20 40 60 80 100 120 140 Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM % réponse du témoin 0.1 ug/l 0.5 ug/l * * *

42 CHLORURE DE ZINC % réponse du témoin -100 -80 -60 -40 -20 20 40 60 80
20 40 60 80 100 120 140 Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM % réponse du témoin 10 ug/l 50 ug/l * * *

43 CADMIUM / MERCURE % réponse du témoin -100 -80 -60 -40 -20 20 40 60 80
20 40 60 80 100 Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM 3/ 0.3 ug/l 5/ 0.5 ug/l * *

44 CADMIUM / ZINC % réponse du témoinl 100 -100 -80 -60 -40 -20 20 40 60
20 40 60 80 Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM % réponse du témoinl 3/30 ug/l 5/50 ug/l * *

45 MERCURE / ZINC % réponse du témoin -100 -80 -60 -40 -20 20 40 60 80
20 40 60 80 Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM 0.3/30 ug/l 0.5/50 ug/l * * *

46 CADMIUM / MERCURE / ZINC
-100 -80 -60 -40 -20 20 40 60 80 100 120 140 % réponse du témoin Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM 3/0.3/ 30 ug/l 5/0.5 /50 ug/l * * * nd

47 APPROCHES MODÈLES CLASSIQUES IN VITRO
3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE 4. TERRAIN 5. COMBINAISON 40

48 Facteurs confondants Nombre d’individus Âges Sexe Sites

49 Nombre % Variation 25 50 75 3 9 12 6 18 Nombre d’individus

50 SITE % phagocytes/rein 5 10 15 Ma Me Hu Lac

51 Variations mensuelles
% Phagocytes/rein 5 10 15 Juil Sept Oct Mois

52 Variations liées au sexe
% Phagocytes/rein 15 10 M M F 5 F F M Ma Me Hu Lac

53 SENSIBILITÉ AU MERCURE
40 60 80 100 20 -9,0 -8,0 -7,0 -6,0 -5,0 -4,0 -3,0 Concentration (M) % Réponse Normale

54 Transformation blastique
5 10 20 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 Apopka Woodruff Con A ug cpm x 1000 Transformation blastique 2

55 Site d'échantillonnage Nombre de phagocytes actifs ( x 10 )
1 2 3 4 5 6 Venise en Qc St-Amable Boucherville Chibouet Fairbanks Site d'échantillonnage Nombre de phagocytes actifs ( x 10 ) A B BC C Phagocytose de splénocytes de Rana pipiens juvéniles capturées en juillet

56 Site d'échantillonnage Nombre de phagocytes actifs ( x 10 )
Phagocytose de splénocytes de Rana pipiens juvéniles capturées en septembre 1 2 3 4 5 6 Venise en Qc St-Amable Boucherville Chibouet Fairbanks Site d'échantillonnage Nombre de phagocytes actifs ( x 10 ) A B BC C

57 APPROCHES MODÈLES CLASSIQUES IN VITRO
3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE 4. TERRAIN 5. COMBINAISON 40

58

59 BPC dans les sédiments de la Baie-des-Anglais
* : μg/g sédiment sec BPC* 1 2 3 3,3’,4,4’- T4CB 5700 740 86 2,3,4,3’4’- P5CB 29000 3030 280 2,4,5,3’,4’- P5CB 53000 4460 411 3,3’,4,4’,5- P5CB 230 20 2,3 3,3’,4,4’,5- H6CB 3,2 0,5 0,1 BPC dans les sédiments de la Baie-des-Anglais

60 Métaux dans les sédiments de la Baie-des-Anglais
Métaux* 1 2 3 Pb 23,65 18,63 16,75 Cd 0,20 0,09 0,06 Ag 0,07 0,04 - Cu 18,90 18,03 9,12 Hg 0,08 0,03 0,01 * : μg/g sédiment sec Métaux dans les sédiments de la Baie-des-Anglais Sites

61 HAP dans les sédiments de la Baie-des-Anglais
Produits de combustion (μg/g sédiment sec) 50 25 1 2 3 Sites

62 Protocole expérimental
Site 1, 2, 3 Site 1 1 3 semaines Protocole expérimental

63 Protocole expérimental

64 Effets de l ’exposition in situ
5 10 15 20 25 30 35 40 Cells MO 1+ MO 3+ Nombre de cellules (107) Site 3 Site 2 Site 1

65 Protocole expérimental
Site 1 sédiment Sable 1, 2, 3 mois et recouvrement immunologie, analyse chimique

66 Nombre de macrophages actifs
1 2 3 4 5 6 7 1 mois 2 mois 3 mois Récupération Nombre de cellules (107) Témoin Exposé

67 Pathologies Neoplasies 15 17.6% Pneumonies (vers) 15 17.6%
Infections bactériennes % Malformations % Parasitisme % Infections (virus, autres) % Non déterminées % Autres causes % 85 nécropsies de 235 carcasses ( )

68 Tumeurs décrites Adenocarcinomes: intestin, estomac, utérus, glandes salivaires, glandes mammaires Carcinome de la vessie Lymphosarcome thymique Tumeurs de l’ovaire (granulosa, dysgerminoma) Hépatocarcinome

69 Programme de recherche
Développement des outils et étude des paramètres immunitaires à partir d’échantillons de sang de bélugas en captivité Validation des méthodes et établissement d’une banque de données à partir des animaux de l’arctique Étude de la sensibilité aux xénobiotiques par des expositions in vitro Étude chez les rongeurs (gras de béluga dans la diète) Caractérisation des animaux du Saint-Laurent

70 Lymphocytes de bélugas et DDE

71 Lymphocytes de bélugas et DDT

72 Expositions in vitro Métaux : Pb, Cd, Hg, Ag, Zn, Cu TCDD, DDT, DDE
Congénères de BPC Insecticides, herbicides Mélanges

73 Programme de recherche
Développement des outils et étude des paramètres immunitaires à partir d’échantillons de sang de bélugas en captivité Validation des méthodes et établissement d’une banque de données à partir des animaux de l’arctique Étude de la sensibilité aux xénobiotiques par des expositions in vitro Étude chez les rongeurs (gras de béluga dans la diète) Caractérisation des animaux du Saint-Laurent

74 Protocole expérimental
Diète pour 90 jours - Gras de bœuf - Huile de maïs - 100 % béluga Saint-Laurent ou Arviat - mélange 75:25, 50:50, 25:75 Compétence immunitaire Phagocytose, transformation blastique, phénotypage, NK, PFC Protocole expérimental

75 20 40 60 80 100 120 140 160 Boeuf 75/25 25/75 100 St % N.R. * PFC Maïs 50/50

76 Sexe et maturation Hémolymphe Estradiol Testostérone Progestérone Sérotonine PgE2, PgF2 Phagocytose

77 Time (h) Fluorescence FL1 (% cells) 5 10 15 20 25 30 40 50 60 70
5 10 15 20 25 Fluorescence FL1 (% cells) 30 40 50 60 70 Mya truncata Siliqua costata Mesodesma arctatum Serripes groenlandicus Cyrtodaria siliqua Elliptio Complanata (Azide)

78 EFFETS SUR LA PHAGOCYTOSE SUITE À DES EXPOSITIONS IN-VITRO
50 100 150 200 250 300 1x10-9 1x10-8 1x10-7 1x10-6 1x10-5 1x10-4 1x10-3 CONCENTRATIONS ( M ) EFFETS SUR LA PHAGOCYTOSE SUITE À DES EXPOSITIONS IN-VITRO CH3HgCl HgCl2 CdCl2 ZnCl2 AgNO3 Brousseau et et al., Toxicology 142 :

79 PRINCIPE DE LA MESURE DES THIOLS
CMFDA CMF Conjugaison des thiols Non conjugué Esterase DA CMF-SH PRINCIPE DE LA MESURE DES THIOLS

80 Effet de la NEM sur la fluorescence induite par la CMFDA
1200 1000 800 Fluorescence moyenne 600 400 200 10 20 40 80 100 Dose de NEM (ug/ml)

81 EFFET DU MERCURE SUR LE NIVEAU INTRACELLULAIRE DE THIOLS CHEZ LA MYE
Concentrations (M) Intensité de fluorescence (FL1) 50 100 150 200 250 300 350 400 450 10-8 10-4

82 Estradiol Testostérone Progestérone Sérotonine PgE2, PgF2 Sexe et maturation Phagocytose 5

83 Protocole expérimental
Témoin N = 15 0.1 X [TBT] = 5 µg.L-1 [Atrazine] = 8 µg.L-1 [Diuron] = 0.07 µg.L-1 [E2] = M X [TBT] = 50 µg.L-1 [Atrazine] = 80 µg.L-1 [Diuron] = 0.7 µg.L-1 10 X [TBT] = 500 µg.L-1 [Atrazine] = 800 µg.L-1 [Diuron] = 7 µg.L-1 [E2] = 10-8 M

84 Expositions In vivo Eau de mer 200 ml/min. Contaminants 0.2 ml/min.
débimètre Contaminants 0.2 ml/min. Eau de mer 200 ml/min. Mytilus edulis Filtre Mya arenaria Expositions In vivo

85 PROTOCOLE - In Vivo HgCl2 CH3HgCl 10-9M 10-8M 10-7M 10-6M 10-5M FILTRE

86 Corrélation entre l’exposition et la charge tissulaire (14j.)
-9 -6 200 100 Charge tissulaire ug/g Corrélation entre l’exposition et la charge tissulaire (14j.) 300 -7 -8 Dose Molaire CH3HgCL HgCl2

87 100 200 50 Charge tissulaire ug/g Corrélation entre la charge tissulaire et l ’inhibition de la phagocytose Phagocytose %

88 Blanc Sablon - Havre - St - Pierre Gaspé Carleton Grande Rivière - Havre - aux - Maisons

89 % de phagocytose moules Grande-Rivière
transplantées en fonction du temps (2002) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Juin Juillet Août Sept. Octo. Nov. Mois % de phagocytose 1 bille 3 billes et +

90 CONCLUSIONS 1. Xénobiotiques SI Espèces labo. Expositions contrôlées
In vitro Espèces labo. Expositions contrôlées (résistance) In vivo In vitro Espèces fauniques Expositions contrôlées In vivo Espèces fauniques Terrain In vivo 46

91 Mécanismes d ’immunotoxicité
CONCLUSIONS 2. Mécanismes d ’immunotoxicité Laboratoire Terrain 47

92 Biomarqueurs immunologiques en écotoxicologie
CONCLUSIONS 3. Biomarqueurs immunologiques en écotoxicologie Utilisation Suivi environnemental d ’espèces fauniques Validation Espèces laboratoire Espèces fauniques 48

93 Biomarqueurs immunologiques en
CONCLUSIONS 4. Biomarqueurs immunologiques en santé humaine Validation Etude clinique Utilisation Suivi environnemental 49

94 Altérations physiologiques Fonctions cellulaires
Impact éclogique croissant Écosystème Échelle de temps Communauté Population Santé de l’individu Altérations physiologiques Dépasse le cadre de l’immunotoxicité Un suivi immunologique = suivi de l’état de santé et de la susceptibilité aux maladies (cancers et infectieuses) Mesurer une altération du système immunitaire et les conséquences que cela comporte, que la cause soit la pollution de l’environnement ou une combinaison de facteurs don’t la contamination fait partie. Fonctions cellulaires Réponses moléculaires et cellulaires Exposition

95 Malades mais vont survivre
Ne survivront pas Pathologie légère Présence d’Ab % de population Et ici, je voudrais justement attirer votre attention. On a dit et écrit beaucoup de chose sur le potentiel immunotoxique des contaminants de l’environnement. Il faut garder à l’esprit et c’est valable pour les Cumulatifs (valable en général pour tous les systèmes – Reproducteur) « latents » un organisme « biologiquement » (critères de base des organismes vivants) doit se reproduire. On se reproduit, ou on ne se reproduit pas (la seule intermédiaire = descendance dégénérée). Par contre, pour le système immunitaire, on peut luter plus ou moins efficacement contre des pathogènes plus ou moins dangereux. Résistance au pathogène