Étude du transporteur MRP1 : caractérisation des NBD,

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1 Étude du transporteur MRP1 : caractérisation des NBD,
et étude de modulateurs conduisant à la mort des cellules surexprimant le transporteur Soutenance de thèse de M. Thomas PERROTTON Directeur de thèse : Dr. Hélène CORTAY 14 Décembre 2007 – 14h30 Laboratoire des Protéines de Résistance aux Agents Chimiothérapeutiques Dr. Attilio DI PIETRO Institut de Biologie et Chimie des Protéines

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SOMMAIRE RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Le cancer : un enjeux sociétal et économique Le phénotype de résistance des cancers Les transporteurs ABC Le transporteur de multiples drogues MRP1 Les modulateurs de MRP1 RESULTATS Caractérisation fonctionnelle des NBD Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

3 Thomas PERROTTON - IBCP
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Le cancer : un enjeux sociétal et économique Le phénotype de résistance des cancers Les transporteurs ABC Le transporteur de multiples drogues MRP1 Les modulateurs de MRP1 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

4 Le cancer : un enjeu sociétal et économique
Le cancer est une maladie qui nous concerne tous. Chaque année, nouveaux cas sont diagnostiqués ; le cancer tue personnes par an. Il est la première cause de mort prématurée. 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

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Le cancer : un enjeu sociétal et économique TYPE DE COUTS EVALUATION (k€) Impacts immédiats et indirects de la maladie Impact de la maladie sur la vie des personnes Années potentielles de vie perdues (en années) ~ 2  Perte de production Perte de productivité du fait d’arrêts maladie Perte de productivité du fait de mortalité 527 811 16  Coûts de la lutte contre le cancer pour l’État et l’Assurance Maladie Le coût des soins 10  Politique de prévention primaire à la lutte contre les cancers Tabac Alcool Nutrition/exercice physique Dépistages organisés Cancer du sein Cancer colorectal Recherche publique « Analyse économique des coûts du cancer en France », Institut national du cancer, 10 avril 2007 (dossier de presse) 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

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Le phénotype de résistance des cancers Un échec majeur des chimiothérapies, dû au traitement par des médicaments Résistance croisée à de nombreux agents chimiothérapeutiques 1 22 3 4 2 Inactivation moléculaire Anomalies de réponses (apoptose, augmentation de la réparation de l’ADN) Altération de la cible moléculaire (ADN topoisomérases) Efflux actif en dehors de la cellule (transporteurs ABC) 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

7 Thomas PERROTTON - IBCP
Les transporteurs ABC Généralités Une très large famille de protéines Présents des microorganismes à l’Homme Une séquence hautement conservée : ATP Binding Cassette Une classification unique (HUGO) : → homologie structurale Trois transporteurs ABC impliqués dans le phénotype MDR: P-gp/ABCB1 (Glycoprotéine-P) MRP1/ABCC1 (Multidrug Resistance Protein 1) BCRP/ABCG2 (Breast Cancer Resistance Protein) 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

8 Les pathologies associées aux transporteurs ABC
Les transporteurs ABC Les pathologies associées aux transporteurs ABC Des transporteurs impliqués dans de nombreuses fonctions physiologiques Des mutations associant souvent ces transporteurs à des maladies Transporteur Nomenclature Maladie MDR1, MRP1, BCRP ABCB1, ABCC1, ABCG2 Cancer CFTR ABCC7 Mucoviscidose ABC1 ABCA1 Maladie de Tangier et déficience familiale en HDL MRP2 ABCC2 Syndrome de Dubin-Johnson SUR1, SUR2 ABCC8, ABCC9 Hyperinsulinisme familial 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

9 Topologie générale des transporteurs ABC
Les transporteurs ABC Topologie générale des transporteurs ABC Une topologie générale 2 domaines transmembranaires (TMD) : reconnaissent les substrats 2 domaines de fixation des nucléotides (NBD) : fournissent l’énergie 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

10 Les domaines de fixation des nucléotides ou NBD
Les transporteurs ABC Les domaines de fixation des nucléotides ou NBD Des motifs inclus dans les NBD très conservés Motif A de Walker Motif B de Walker Motif C, signature des ABC 1 2 3 2 3 1 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

11 Thomas PERROTTON - IBCP
Les transporteurs ABC Les différentes étapes du transport d’un substrat par un transporteur ABC Higgins CF, et al. (2004)Nat Struct Mol Biol 11(10):918-26 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

12 Une topologie originale de MRP1
Le transporteur de multiples drogues MRP1 Une topologie originale de MRP1 Un domaine transmembranaire supplémentaire en position N-terminale TMD1 TMD2 TMD3 NBD1 NBD2 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

13 Des NBD originaux au fonctionnement asymétrique
Le transporteur de multiples drogues MRP1 Des NBD originaux au fonctionnement asymétrique Des différences structurales Une asymétrie fonctionnelle des NBD de MRP1 La structure de NBD1 a été résolue Conformation non productive du site catalytique Peut expliquer la régulation entre NBD1 et NBD2 Ramaen O, et al. (2006) J Mol Biol 359: 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

14 Une grande diversité de substrats transportés Composés Exemples
Le transporteur de multiples drogues MRP1 Une grande diversité de substrats transportés Transports d’anions organiques transports de substrats conjugués: GSH, glucuronates, sulfonates Co-transport de substrats avec du GSH Composés Exemples Antinéoplasiques methotrexate, doxorubicine, étoposide, vincristine, vinblastine, paclitaxel Antiviraux Saquinavir, ritonavir Antibiotiques Difloxacine, grepafloxacine Metalloïdes Arsénite, arséniate, antimoine Sondes fluorescentes Calcéine, Fluo-3, BCECF, SNARF Toxines Aflatoxine B1 Conjugués à des glucuronides Etoposide-Gluc Conjugués au GSH Leucotriène C4, prostaglandine A2-SG 17β-Estradiol-17-β-D-Gluc, glucuronosylbilirubine Conjugués à des sulfates Estrone-3-sulfate Peptides GSH, GSSG Médicaments xénobiotiques Médicaments xénobiotiques conjugués Composés naturels 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

15 Différents mécanisme de transport
Le transporteur de multiples drogues MRP1 Différents mécanisme de transport Extracellulaire Transport du GSH et du GSSG Transport du LTC4 Intracellulaire ADP+Pi NBD1 NBD1 NBD2 NBD2 Transport de l’estrone sulfate ATP Transport de la vincristine Vérapamil Estrone sulfate GSSG Effet du vérapamil Vincristine LTC4 GSH GSH GSH 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP GSH

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Les modulateurs de MRP1 Pourquoi rechercher des modulateurs pour MRP1? Un objectif : contrecarrer la chimiorésistance Une stratégie : inhiber le transporteur Des solutions : flavonoïdes et vérapamil Classe des composés Composés Analogues des leucotriènes MK571 Stéroïdes ZK112993, LY329146 Bloqueurs de canaux calciques Vérapamil, PAK-104P, nicardipine, NIK 250 Nucléotides antisens ISIS-7597 Cyclosporines Cyclosporine A, PSC833 Flavonoïdes Génistéine, quercitine Divers Probénécide, VX-710, MS-209, difloxacine, GF109203X, indométhacine, dipyridamole, LY415975 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

17 LES OBJECTIFS DE CES TRAVAUX
Mieux comprendre le fonctionnement moléculaire de MRP1 Caractériser la fonctionnalité et l’implication des NBD vis-à-vis des nucléotides, substrats et modulateurs Étudier les énantiomères du vérapamil, comprendre leur activité Déterminer de nouvelles structures efficaces, et comprendre pourquoi Analyser une nouvelle stratégie de lutte contre la chimiorésistance induite par MRP1 Améliorer les modulateurs actifs 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

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RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Le cancer : un enjeux sociétal et économique Le phénotype de résistance des cancers Les transporteurs ABC Le transporteur de multiples drogues MRP1 Les modulateurs de MRP1 RESULTATS Caractérisation fonctionnelle des NBD Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

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RESULTATS Caractérisation fonctionnelle des NBD 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

20 ? Caractérisation fonctionnelle des NBD Généralités
Asymétrie fonctionnelle des NBD de MRP1 Rôle de cette asymétrie encore inconnue Changements conformationnels induits par l’ATP sur les NBD : transfert d’information vers les TMD Interaction de flavonoïdes avec les NBD de MRP1 Interaction des substrats et modulateurs sur les NBD ? ? Propriété de fixation des nucléotides sur les NBD ? Conseil G, et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 18;95(17):9831-6 Trompier D, et al. (2003) Cell Mol Life Sci. 60(10): 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

21 Nucléotides et NBD : interaction et modifications conformationnelles
Caractérisation fonctionnelle des NBD Nucléotides et NBD : interaction et modifications conformationnelles 8N 3 AXP (µM) 100 200 300 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 mol probe / mol protéine ○ NBD2 8-azido-[α-32P]ATP  NBD2 8-azido-[α-32P]ADP ● NBD1 8-azido-[α-32P]ATP ▲ NBD1 8-azido-[α-32P]ADP Fort marquage par l’ATP sur NBD1, faible pour l’ADP Faible marquage sur NBD2 NBD2 NBD1 L’ATP et l‘ADP modifie l’accessibilité des Trp de NBD1 Seul l’ADP modifie l’accessibilité de NBD2 ● NBD seul ■ + ATP-Mg ▲+ ADP-Mg 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

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Caractérisation fonctionnelle des NBD Fixation du LTC4 et du MK571 ● NBD1 ■ NBD2 Fixation du LTC4 sur les deux NBD NBD1 Kd = 5.8 ± 0.4 µM NBD2 Kd = 8.2 ± 0.7 µM ● NBD1 ■ NBD2 Fixation du MK571 sur les deux NBD NBD1 Kd = 6.0 ± 1.3 µM NBD2 Kd = 3.9 ± 1.6 µM 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

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Caractérisation fonctionnelle des NBD Les NBD et le NMeOHI2 NBD1 NBD2 A B ● NBD seul ■ 10 µM NMeOHI2 ▲30 µM NMeOHI2 Modification de l’accessibilité des Trp de NBD1 par le NMeOHI2 Modification différente de l’ATP Interaction au même site que le MK571 ● NBD1 seul ■ 30 µM NMeOHI2 ▲30 µM NMeOHI2 + 2 mM ATP-Mg 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

24 Changements conformationnels induits par les substrats et modulateurs
Caractérisation fonctionnelle des NBD Changements conformationnels induits par les substrats et modulateurs NBD1 NBD2 ○ NBD seul ■ 30 μM docetaxel ▲ 30 μM vincristine ▼ 30 μM vinblastine ◊ 5 mM GSH □ 5 μM LTC4 Tous les composés modifient l’accessibilité des Trp de NBD1 Seuls le GSH et le LTC4 modifient l’accessibilité des Trp de NBD2 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

25 Conclusions résultats 1
Interaction Interaction LTC4 MK571 NMeOHI2 LTC4 MK571 NMeOHI2 NBD1 NBD2 ATP ATP Modifications Conformationnelles Modifications Conformationnelles Vincristine Vinblastine GSH LTC4 GSH LTC4 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

26 Conclusions résultats 1
Les nucléotides et les NBD: → Comportement intrinsèque asymétrique vis-à-vis des nucléotides → Changements conformationnels pouvant expliquer le rôle de chaque NBD dans le mécanisme catalytique → Les domaines recombinants sont fonctionnels Les substrats/modulateurs et les NBD: → Participation des NBD à la fixation des substrats et modulateurs? → Validation par d’autres techniques (photomarquage, mutagenèse, …) 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

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RESULTATS Caractérisation fonctionnelle des NBD Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

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Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Le vérapamil Un dérivé diphénylalkylamine Inhibiteur des canaux calciques de type L (cœur) Utilisation en thérapeutique: hypertension, arythmie * L’énantiomère S est pharmacologiquement efficace L’énantiomère S est beaucoup plus vite métabolisé 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

29 Effet du vérapamil sur MRP1
Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Effet du vérapamil sur MRP1 Vérapamil Cellules BHK-21 Vérapamil Cellules BHK-MRP1 Fuite massive du GSH intracellulaire Mort des cellules surexprimant MRP1 par apoptose Trompier D, et al. (2004) Cancer Res 64: Low DW, et al. (2000) J Pharmacol Exp Ther 293(2):530-8 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

30 Le vérapamil et ses énantiomères
Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Le vérapamil et ses énantiomères Les énantiomères : 60 milliards de dollars dépensés chaque année aux USA Effet physiologique différentiel des énantiomères de molécules Thalidomide Ibuprofène Vérapamil: inhibiteur de référence de la glycoprotéine -P Même activité des énantiomères sur la glycoprotéine-P et sur MRP1 …? 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

31 Cytotoxicité des énantiomères du vérapamil
Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Cytotoxicité des énantiomères du vérapamil ○ vérapamil +/- □ vérapamil S  vérapamil R ● vérapamil +/- ■ vérapamil S ▲ vérapamil R BHK-21 BHK-21-MRP1 Seul le S-verapamil induit une cytotoxicité des cellules BHK-MRP1 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

32 Effet des énantiomères du vérapamil sur le transport de GSH par MRP1
Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Effet des énantiomères du vérapamil sur le transport de GSH par MRP1 ○ 10 µM vérapamil +/- □ 5 µM vérapamil S  5 µM vérapamil R ● 10 µM vérapamil +/- ■ 5 µM vérapamil S BHK-21 BHK-21-MRP1 L’effet du S-vérapamil est plus fort en absence de l’énantiomère R 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

33 Effet du R-vérapamil sur l’activité du S-vérapamil
Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Effet du R-vérapamil sur l’activité du S-vérapamil ● 0 µM vérapamil R ■ 2 µM vérapamil R ▲ 4 µM vérapamil R BHK-21-MRP1 Inhibition de type mixte de l’isomère R sur l’activité de l’isomère S 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

34 Effet des énantiomères du vérapamil sur le transport de calcéine
Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Effet des énantiomères du vérapamil sur le transport de calcéine Contrôle Verapamil R Verapamil S MK571 BHK21 BHK21-MRP1 Aucun effet sur les cellules contrôles Les 2 énantiomères inhibent l’efflux de calcéine 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

35 Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1
Réversion du phénotype MDR par le R-vérapamil 0 µM 5 µM 15 µM BHK21 BHK21-MRP1 IC50 (nM) de la vincristine R-vérapamil (µM) 5 15 BHK-21 1,51 ± 0,4 1,48 ± 0,27 1,06 ± 0,38 BHK-MRP1 9,42 ± 0,23 2,87 ± 0,42 1,02 ± 0,18 Le vérapamil R réverse le phénotype MDR induit par MRP1 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

36 Purification de MRP1 à l’aide des cellules BHK-MRP1
Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Purification de MRP1 à l’aide des cellules BHK-MRP1 MRP1 SDS-PAGE 6%, Coomassie MW (KDa) 220 - 170 - 116 - 76 - MR P1 205 - 115 - 97 - Western Blot, Lumilight® Dépôt de 1.5 µg de protéines purifiées Purification de MRP1 20 boites de 15 cm Ø ~ 200 µg Concentration ~ 0.07 µg/µl 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

37 Changements conformationnels induits par les énantiomères du vérapamil
Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Changements conformationnels induits par les énantiomères du vérapamil ● MRP1 seul ▲ 0.5 µM R-vérapamil ■ 0.5 µM S-vérapamil Pas d’asolectine 0.2 % asolectine MRP1 seul KSV = 1.23 ± 0.15 M-1 0.5 µM R-vérapamil KSV = 2.51 ± 0.17 M-1 0.5 µM S-vérapamil fa = 0.45 MRP1 seul KSV = 1.46 ± 0.23 M-1 0.5 µM R-vérapamil fa = 0.42 0.5 µM S-vérapamil fa = 0.48 L’asolectine modifie l’accessibilité des Trp Les deux énantiomères induisent des changements conformationnels différents 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

38 Fixation du S- et R-vérapamil sur MRP1 purifiée
Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Fixation du S- et R-vérapamil sur MRP1 purifiée R-vérapamil S-vérapamil R-vérapamil Kd = 47.7 ± 4 nM S-vérapamil Kd = 92.5 ± 5 nM Fixation du S et R-verapamil sur MRP1 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

39 Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1
Effet du R-vérapamil sur la fixation su S-vérapamil, topologie des sites de fixation 0.5 µM R-vérapamil MRP1 seul 0.05 µM R-vérapamil Modification de la fixation du S-vérapamil par le R-vérapamil 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

40 Effet du GSH sur la fixation du S-vérapamil et du R-vérapamil
Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Effet du GSH sur la fixation du S-vérapamil et du R-vérapamil S-vérapamil  MRP1 seul ■ 0.5 mM GSH R-vérapamil Modification de l’interaction des deux énantiomères avec MRP1 par le GSH Interdépendance entre les sites de fixation des énantiomères et du GSH 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

41 Effet des énantiomères du vérapamil sur l’activité ATPase
Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Effet des énantiomères du vérapamil sur l’activité ATPase De MRP1 purifiée 0.2 % asolectine Pas d’asolectine 5 mM GSH 1 µM S- ou R-vérapamil 0.8 mM vanadate Activité basale : 2.11 ± 0.1 nmol/min/mg Activité basale : 16.2 ± 0.4nmol/min/mg Modification de l’activité ATPase par l’asolectine Abolition des effets du GSH sur l’activité ATPase par le S-vérapamil, par d’effet du R-vérapamil 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

42 Conclusions résultats 2
Effets biologiques différents: → seul le S-vérapamil induit l’efflux du glutathion, entraînant la mort cellulaire → le R-vérapamil agit comme un inhibiteur de MRP1 - Les deux énantiomères ont des sites de fixation interdépendants Il faut choisir entre les deux énantiomères pour cibler MRP1 de manière plus efficace, et selon deux aspects: Le R-vérapamil a deux avantages: → il est peu cardiotoxique → il réverse le phénotype MDR Le S-vérapamil a l’avantage de tuer spécifiquement les cellules susceptibles de devenir résistantes, par induction de l’apoptose INTÉRÊT DE CES RÉSULTATS = NOUVELLES STRATEGIES Perrotton T, et al. (2007) J Biol Chem 26;282(43): 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

43 Activité du S-vérapamil sur MRP1
Transport du GSH, et de la vincristine en co-transport avec le GSH Extracellulaire Fixation du S-vérapamil R S Modification de la conformation de MRP1 Intracellulaire ADP+Pi NBD1 NBD2 ATP Transport massif du GSH S GSH GSH Inhibition du transport de la vincristine Vincristine GSH Vincristine GSH GSH GSH GSH 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

44 Activité du R-vérapamil sur MRP1
Extracellulaire Transport du GSH et de la vincristine en co-transport avec le GSH Fixation du R-vérapamil R S Intracellulaire Modification de la conformation de MRP1 NBD1 NBD2 ADP+Pi ATP Inhibition du transport de la vincristine et du GSH GSH GSH GSH R GSH GSH Vincristine Vincristine GSH GSH 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

45 des énantiomères du vérapamil
Sites de fixation des énantiomères du vérapamil Extracellulaire La fixation du R-vérapamil sur MRP1 modifie la fixation du S-vérapamil R S Interdépendance des sites de fixation des énantiomères du vérapamil Intracellulaire ADP+Pi NBD1 NBD2 ATP R S 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

46 Conclusions résultats 2
Synthèse des énantiomères diiodés du vérapamil, pour une meilleure efficacité à plus faible concentration Etudier l’influence des énantiomères du vérapamil sur la fixation du glutathion sur MRP1, intérêt mécanistique Etudier l’influence du phénotype cellulaire sur l’activité du S- vérapamil Passer à un modèle animal 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

47 Thomas PERROTTON - IBCP
RESULTATS Caractérisation fonctionnelle des NBD Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Relation structure/activité des dérivés iodés du vérapamil 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

48 Structure chimique des dérivés iodés du vérapamil
Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil Structure chimique des dérivés iodés du vérapamil Composés Type de modification chimique 1 2 3 4 n Verapamil CH3 OCH3 - NMeOMe NMeOMeI I NMeOMeI2 NMeOH OH NMeOHI NMeOHI2 Verapamil C Verapamil CI Verapamil CI2 Verapamil D Verapamil DI Verapamil DI2 NHOH H NHOHI NHOHI2 4 2 3 4 Partie « ouest » Partie « est » 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

49 Cytotoxicité des dérivés iodés du vérapamil
Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil Cytotoxicité des dérivés iodés du vérapamil Composés IC50 (µM) BHK-21-MRP1 BHK-21 Verapamil 10.6 ± 0.5 ≥ 100 NMeOMe 17.2 ± 1.0 33.6 ± 7.7 NMeOMeI 4.7 ± 0.6 13.0 ± 0.5 NMeOMeI2 1.7 ± 0.9 8.9 ± 0.3 NMeOH 11.7 ± 0.3 55.9 ± 0.8 NMeOHI 8.6 ± 1.2 32.8 ± 0.9 NMeOHI2 1.1 ± 0.9 54.7 ± 7.1 Verapamil C 20.9 ± 1.4 Verapamil CI 9.3 ± 1.4 9.4 ± 0.2 Verapamil CI2 6.0 ± 0.8 33.1 ± 5.1 Verapamil D 6.6 ± 0.9 28.5 ± 1.6 Verapamil DI 13.0 ± 1.2 14.1 ± 0.3 Verapamil DI2 6.6 ± 1.2 27.4 ± 2.6 NHOH 38.1 ± 0.3 NHOHI 0.78 ± 0.7 14.2 ± 0.3 NHOHI2 1.96 ± 0.4 13.8 ± 0.5 L’iodation augmente l’efficacité des molécules en général 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

50 Toxicité cellulaire du vérapamil et de deux dérivés actifs
Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil Toxicité cellulaire du vérapamil et de deux dérivés actifs C Vérapamil NHOHI NMeOHI2 F > 10 F ~ 18 F ~ 49 Trois composés intéressants 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

51 Effet des dérivés iodés du vérapamil sur le contenu cellulaire en GSH
Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil Effet des dérivés iodés du vérapamil sur le contenu cellulaire en GSH Effet de la taille du linker Effet de l’iodation 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

52 Conclusions résultats 3
Etudier attentivement les résultats du dosage de GSH, ne pas se contenter de la toxicité cellulaire! Intérêts des modifications chimiques: → Pas de bénéfice lors de modification linker → Puissant effet de l’iodation → CH3 → OH: pas d’intérêt sauf dans cas d’iodation Intérêt: synthétiser et étudier les énantiomères du NMeOHI2 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

53 Thomas PERROTTON - IBCP
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Le cancer : un enjeux sociétal et économique Le phénotype de résistance des cancers Les transporteurs ABC Le transporteur de multiples drogues MRP1 Les modulateurs de MRP1 RESULTATS Caractérisation fonctionnelle des NBD Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

54 Intérêt mécanistique à confirmer par d’autres techniques
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES Mieux comprendre le fonctionnement moléculaire de MRP1 Explication de l’asymétrie des NBD dans leur séquences La différence de fixation des nucléotides peur expliquer les différentes étapes du cycle catalytique Les NBD ont la capacité de fixer le LTC4 et le MK571 Le GSH, le NMeOHI2, la vincristine et la vinblastine modifient l’accessibilité des NBD Participation des NBD à la fixation des substrats? Intérêt mécanistique à confirmer par d’autres techniques 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

55 Une nouvelle stratégie Synthétiser les énantiomères
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES Analyser une nouvelle stratégie de lutte contre la chimiorésistance induite par MRP1 S-vérapamil : responsable de l’efflux de GSH R-vérapamil : inhibiteur du transporteur Une nouvelle stratégie thérapeutique : aller plus loin, d’autres modèles Améliorer les modulateurs actifs Synthétiser les énantiomères du NMeOHI2 : un espoir prometteur! Un intérêt majeur de l’halogénation des composés Un dérivé prometteur : le NMeOHI2 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP

56 Thomas PERROTTON - IBCP
REMERCIEMENTS Le laboratoire du Dr. DI PIETRO, IBCP, Lyon Dr. Atillio DI PIETRO Dr. Hélène CORTAY Dr. Pierre FALSON Tous les membres du laboratoire et de l’Institut Plateau technique cytométrie en flux, IFR128, Lyon Chantal BELLA Odette DE BOUTEILLER Département de Chimie Moléculaire, UJF, Grenoble Dr. Amaury DU MOULINET DHARDEMARE Mayo Clinic, Scottsdale, USA Dr. Xiu-Bao CHANG Yue-Xian HU et Irène BEAUVAIS University of Cape Town Medical School, Cape Town, SOUTH AFRICA Dr. David MCINTOSH 14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP