Module 1 – Biologie cellulaire

Module 1 – Biologie cellulaire
Partie IV: Méthodes d’étude de la cellule cours E. Grelier

Plan Techniques de séparation et de purification cellulaire Méthodes d’étude de la morphologie des cellules : techniques d’examens microscopiques Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules Méthode d’étude du métabolisme cellulaire La culture cellulaire cours E. Grelier

I. Techniques de séparation et de purification cellulaire
1. Séparation des cellules d’un tissu cours E. Grelier

I. Techniques de séparation et de purification cellulaire 1
I. Techniques de séparation et de purification cellulaire 1. Séparation des cellules d’un tissu Tissu = ensemble cohérent de cellules d’où -> nécessité d’un traitement pour dissocier les liaisons intercellulaires et pouvoir étudier les cellules isolées (sauf cas du sang). Photographie au microscope optique (grossissement de 400 x) d'un tissu épithélial simple pavimenteux péritonéal humain cours E. Grelier

I. Techniques de séparation et de purification cellulaire 1. Séparation des cellules d’un tissu 1ière étape : Destruction de la matrice extracellulaire et des jonctions intercellulaires Traitement des tissus par des enzymes protéolytiques (trypsine, collagènase) Traitement des tissus par des agents chélateurs des cations divalents impliqués dans les ponts intercellulaires (EDTA : Ethylène Diamine Tétra Acétate) 2ième étape : Isolement des cellules Dissociation par une agitation mécanique douce grâce à une presse à tissus, des aspirations et refoulements d’une pipette ou d’un piston (tube de Potter, homogénéisateur de Dounce), un vortex… Filtration (sur gaze par exemple) pour obtenir une suspension cellulaire homogène cours E. Grelier

I. Techniques de séparation et de purification cellulaire
cours E. Grelier

I. Techniques de séparation et de purification cellulaire 2. Purification: adhérence et gradient Adhérence des cellules GR et monocytes au plastique ou aux fibres de nylon : élimination après incubation sur un support plastique pendant 1 heure à 37°C kératinocytes (suspension de cellules de peau) au collagène I après 15 min à 37°C. Centrifugation sur gradient de densité Séparation selon leur densité, liée au contenu cellulaire et à la taille. Dépôt de la suspension cellulaire sur un liquide de densité choisie en fonction des cellules à séparer. Centrifugation Migration des cellules dans le liquide et localisation selon leur densité formant un anneau à récupérer par simple pipetage. cours E. Grelier

I. Techniques de séparation et de purification cellulaire 2. Purification: exemple Séparation des lymphocytes à partir d’une suspension de cellules spléniques en gradient de Ficoll Les solutions utilisées : solutions de polymères de sucres de composition variable de densités différentes permettant la séparation de cellules de différentes densités. Technique très simple, peu onéreuse mais peu sélective ne permettant pas de séparer des cellules de densité proches. Dépôt d’un volume de sang (d = 1,006) sur un volume de Ficoll (d=1,077) Centrifugation 30 minutes à 500 g à °C Plasma Anneau de lymphocytes (+M et plaquettes) Ficoll Culot contenant polynucléaires et hématies cours E. Grelier

I. Techniques de séparation et de purification cellulaire 2. Purification: cytomètre de flux Cytométrie de flux vidéo cytométrie Cellules alignées en flux Examen individuel de chaque cellule par un rayon LASER lui affectant des paramètres spécifiques (Taille, Granularité,…) une charge électrique Tri des fractions par déviation des cellules chargées au niveau de plaques Variante : FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting) utilisant Même principe avec marquage préalable des cellules par un conjugué fluorescent (Ac couplé à un fluorochrome) détection de cette fluorescence tri selon le même principe que précédemment. Technique extrêmement spécifique, rapide automatisable nécessitant un appareillage sophistiqué et coûteux de cytomètre/ordinateur/logiciel cours E. Grelier

Arrivée de la suspension à analyser grâce à une légère surpression dans une tubulure qui assure le centrage hydrodynamique du jet Passage des cellules par un microorifice (50 à 70 µm de diamètre) polarisé permettant la mesure du volume cellulaire Interception de plusieurs faisceaux lumineux, mesure de la fluorescence émise, de la diffusion ou de la diffraction à différents angles* à l’aide de photomultiplicateurs Sortie du jet fractionné grâce à un dispositif d’ultrasons en gouttelettes par un deuxième microrifice (70 à 100 µm) et charge Déviation grâce à un champ de haute tension selon les instructions données après traitement des données Acquisition et traitement des signaux provenant des différents détecteurs : affichage à l’écran et stockage des résultats Tri et recueil des cellules en tubes ou plaques de microtitration *La diffusion aux grands angles (90°) de la lumière traversant la cellule donne des informations sur la forme, la structure et le volume de la cellule et de son noyau tandis que la diffusion aux petits angles de la lumière diffractée par des petites particules donne des renseignements sur la granularité cytoplasmique. cours E. Grelier

Un exemple d’analyse avec un cytomètre de flux : l’analyse des cellules sanguines
Voir vidéo sur l’intérêt dans l’étude de l’évolution de l’infection par le VIH : (à partir de 13 min 47) cours E. Grelier

I. Techniques de séparation et de purification cellulaire 2. Purification: chromatographie d’affinité Connaissance d’une molécule de surface spécifique du type cellulaire à trier Lectines : protéines d’origine végétale se fixant avec une grande affinité à des groupements glucidiques spécifiques rencontrés au niveau des glycoprotéines présentes à la surface des cellules Anticorps spécifiques des cellules d’intérêt Couplage de cette molécule à diverses matrices (billes de plastique ou de latex) placées dans une colonne Dépôt de la suspension cellulaire à trier sur la colonne ainsi formée Fixation des cellules d’intérêt Récupération par agitation modérée changement de pH changement de force ionique pour casser les liaisons faibles formées entre ligands. Technique spécifique, relativement peu onéreuse (régénération de la colonne) nécessitant un compromis efficace pour éluer toutes les cellules retenues pour avoir un bon rendement sans pour autant les altérer. cours E. Grelier

I. Techniques de séparation et de purification cellulaire 2. Purification: chromatographie d’affinité cours E. Grelier

I. Techniques de séparation et de purification cellulaire 2. Purification: Tri immunomagnétique Tri immunomagnétique Principe de cette technique très semblable à celui de la chromatographie d’affinité Connaissance d’une molécule de surface spécifique du type cellulaire à trier Utilisation contre cette molécule d’un anticorps couplé à une bille métallique à base de fer. Incubation de la suspension cellulaire avec cet anticorps Dépôt de cette suspension sur une colonne placée dans un champ magnétique crée par un aimant. Retenue des cellules marquées Récupération de ces cellules après retrait de l’aimant Technique très spécifique, rapide d’un bon rendement. assez onéreuse (colonnes à usage unique). Incubation Retenue Élution cours E. Grelier

1. Grossissement et résolution
II. Méthodes d’étude de la morphologie des cellules : techniques d’examens microscopiques 1. Grossissement et résolution cours E. Grelier

Nécessité du grossissement
Cellule végétale Cellule animale Bactérie Virus/ribosome Macromolécule Molécule Atome 1 cm 1 mm 100µm 10 µm 1 µm 100 nm 10 nm 1nm 0,1 nm Œil nu Microscope photonique Microscope électronique cours E. Grelier

II - Techniques d’examen microscopique 1. Grossissement et résolution
Grossissement du microscope = Grossissement de l’objectif x Grossissement de l’oculaire Limite du grossissement : le pouvoir de résolution de l’œil sur celui du microscope : En microscopie photonique, avec les pouvoirs de résolution de l’instrument et de l’œil, le grossissement limite est de 1000 En microscopie électronique à transmission, le grossissement maximal que de cours E. Grelier

II - Techniques d’examen microscopique 1. Grossissement et résolution
Le pouvoir de résolution est une propriété instrumentale, une valeur absolue et théorique la meilleure résolution atteignable pour un instrument particulier et dans des conditions d’observation optimum La résolution est une valeur dépendant des conditions expérimentales d’observation égale ou inférieure au pouvoir de résolution la possibilité de distinguer des points rapprochés d’objets distincts La limite de résolution est la plus petite distance séparant deux points reconnus comme objets distincts 75 µm pour l’œil nu 0,25 µm pour les meilleurs microscopes photoniques 0,002 µm pour les microscopes électroniques à transmission cours E. Grelier

II - Techniques d’examen microscopique 1
II - Techniques d’examen microscopique 1. Grossissement et résolution: exercices Calcul de d : limite de résolution d = 1/PR = c λ / n sin α λ = longueur d’onde du faisceau lumineux n = indice de réfraction du milieu α = angle de demi ouverture de l’objectif c = constante = 0,61 Déductions théoriques Applications pratiques Diminution de d et augmentation de PR si λ diminue, Microscope à épifluorescence avec UV n augmente, Utilisation de l’huile à immersion a augmente Ouverture augmentée à la construction cours E. Grelier

II - Techniques d’examen microscopique 1. Grossissement et résolution: exercices Indiquer si des objets distants de 3 µm, 300 nm, 3000 Å peuvent être discernés pour le matériel utilisé suivant : un bon microscope photonique équipé d’un oculaire x10 et d’un objectif à immersion x 100 et d’une limite de résolution de 2,5 µm . Calculer d dans le cas où un filtre violet est disposé sur la source lumineuse (λ = 400 nm) sachant que d = 1 µm en lumière jaune (λ = 570 nm) où la mise au point est faite à sec sans huile à immersion. Données nhuile = 1,6 d1 = c λ1/nh . sin α et d2 = c λ2/n . sin α d’où d2 = d1 λ2/ λ1 = 400/570 = 0,7 d1 = c λ1/nh . sin α et d2’ = c λ1/ne . sin α d’où d2’ = nh x d1 / ne = 1,6 cours E. Grelier

2. Préparations pour l’observation microscopique
II. Méthodes d’étude de la morphologie des cellules : techniques d’examens microscopiques 2. Préparations pour l’observation microscopique cours E. Grelier

Schémas de principe des microscopes
II - Techniques d’examen microscopique 2. Préparation pour l’observation microscopique Schémas de principe des microscopes Photonique Électroniques à transmission (MET) à balayage (MEB) Source d’électrons : filament chauffé soumis à une forte ddp Source de photons : lampe >100 kVolts 1 à 40 kvolts Condenseur Condenseur Grille de cuivre support objet transparent Lame support objet transparent Bobines déflectrices donnant un faisceau mobile d’électrons balayant l’objet Objectif(s) réglables Objectif Image vidéo Vide Oculaire Projectif Détecteur Écran fluorescent Plaque photographique Objet non transparent Oeil cours E. Grelier

Ainsi l’objet doit être de faible épaisseur
II - Techniques d’examen microscopique 2. Préparation pour l’observation microscopique 1. en cas de microscopie à lumière L’observation par transmission exige que les rayons lumineux traversent l’objet. Ainsi l’objet doit être de faible épaisseur cours E. Grelier

L’objet doit être de faible épaisseur
II - Techniques d’examen microscopique 2. Préparation pour l’observation microscopique 1. en cas de microscopie à lumière L’objet doit être de faible épaisseur Il faut donc réaliser une coupe : microtomie Pour cela, il faut durcir l’échantillon : inclusion Pour cela, il faut fixer les structures car le durcissement peut les altérer cours E. Grelier

II - Techniques d’examen microscopique 2. Préparation pour l’observation microscopique 1. en cas de microscopie à lumière On récapitule : Fixation pour consolider Inclusion pour durcir l’échantillon Microtomie pour couper Coloration pour le contraste cours E. Grelier

II - Techniques d’examen microscopique 2. Préparation pour l’observation microscopique 1. en cas de microscopie à lumière Etape 1: la fixation Elle peut être chimique: avec des fixateurs coagulants (pour les tissus) ou non coagulants (cytologie). Elle peut être physique: la congélation (qui doit être rapide): c’est la meilleure technique. cours E. Grelier

On peut aussi durcir avec la congélation.
II - Techniques d’examen microscopique 2. Préparation pour l’observation microscopique 1. en cas de microscopie à lumière Etape 2: l’inclusion l'eau des cellules est remplacée par de la paraffine chaude qui durcit en refroidissant. NB: Le remplacement de l'eau par la paraffine n'est pas directement possible: ces deux liquides n'étant pas miscibles. On doit en premier lieu substituer à l'eau des cellules fixées de l'éthanol, puis du toluène qui peut se mélanger à la paraffine liquide chaude. On peut aussi durcir avec la congélation. cours E. Grelier

II - Techniques d’examen microscopique 2. Préparation pour l’observation microscopique 1. en cas de microscopie à lumière Etape 3: la coupe On utilise un microtome : rasoir d’acier Après inclusion à la paraffine : coupes de 2 à 5 μm, Après congélation : coupes de 5-10 μm. NB : Lorsqu'on travaille avec des échantillons congelés, le microtome est équipé d'une enceinte maintenue à -20°C. cours E. Grelier

II - Techniques d’examen microscopique 2. Préparation pour l’observation microscopique 1. en cas de microscopie à lumière La coloration Colorants vitaux Ils ne tuent pas les cellules mais sont peu nombreux Ex: rouge neutre Colorants non vitaux Ils tuent la cellule et nécessitent une fixation de la cellule au préalable. Observation de cellules d’oignons au microscope photonique cours E. Grelier

II - Techniques d’examen microscopique 2. Préparation pour l’observation microscopique 2. En cas de microscopie électronique a/ Préparation 1/ L’observation se fait sous-vide, il faut donc déshydrater l’échantillon pour éviter le bouillonnement. . Vidéo cours E. Grelier

II - Techniques d’examen microscopique 2. Préparation pour l’observation microscopique 2. En cas de microscopie électronique On récapitule : Fixation pour consolider Déshydratation Vidéo Inclusion pour durcir l’échantillon Ultra microtomie pour couper Obtention de contraste cours E. Grelier

b/ Contraintes spécifiques au MET
II - Techniques d’examen microscopique 2. Préparation pour l’observation microscopique 2. En cas de microscopie électronique b/ Contraintes spécifiques au MET Le support de l’échantillon doit être perméable aux électrons : membrane de carbone ou d'un polyvinyle comme le formvar). Ce support est lui-même soutenu par une grille de cuivre de 3 mm de diamètre à maille fine (maille de 100 à 300 μm de côté) cours E. Grelier

b/ Contraintes spécifiques au MET
II - Techniques d’examen microscopique 2. Préparation pour l’observation microscopique 2. En cas de microscopie électronique b/ Contraintes spécifiques au MET L’observation des spécimens par transmission ne donne des renseignements que si certaines régions diffusent plus les électrons que d'autres et présentent donc des contrastes. Les éléments avec un numéro atomique faible laissent passer les électrons contrairement aux éléments avec un numéro atomique fort (or/ tungstène…) cours E. Grelier

II - Techniques d’examen microscopique 2. Préparation pour l’observation microscopique 2. En cas de microscopie électronique b/ Contraintes spécifiques au MET: Obtention de contrastes. - Technique de l'ombrage = vaporisation sous vide des métaux avec une direction faisant un angle faible avec le plan de la préparation (= sous incidence rasante). Les vapeurs métalliques viennent se déposer sur la membrane-support et à la surface des objets, mais chaque objet forme un obstacle au dépôt métallique. On obtient ainsi un effet d'ombre sur la membrane support. . Fibriline en forme d’étoiles regroupées en chaîne. C’est un constituant du cartilage cours E. Grelier Filament d’adn déroulé

II - Techniques d’examen microscopique 2. Préparation pour l’observation microscopique 2. En cas de microscopie électronique b/ Contraintes spécifiques au MET: Obtention de contrastes. Pillis autour d’une bactérie dont on distingue une partie en bas. cours E. Grelier

b/ Contraintes spécifiques au MET: Obtention de contrastes.
II - Techniques d’examen microscopique 2. Préparation pour l’observation microscopique 2. En cas de microscopie électronique b/ Contraintes spécifiques au MET: Obtention de contrastes. - Technique de coloration négative : on place les objets dans une solution aqueuse d'acide phosphotungstique et on dépose une gouttelette de cette suspension sur une grille recouverte d'une membrane-support. En séchant l’acide phosphotungstique forme entre les structures un écran que les électrons ne peuvent traverser. Les électrons traversent les structures que l’on veut observer: image en négatif. Particules de rotavirus en microscope électronique en coloration négative (x ) (Cliché : collection du Pr. M. Castets, service de microscopie électronique (Pr. Ph. Rabin) CHU de Poitiers, France) cours E. Grelier

b/ Contraintes spécifiques au MET: Obtention de contrastes.
II - Techniques d’examen microscopique 2. Préparation pour l’observation microscopique 2. En cas de microscopie électronique b/ Contraintes spécifiques au MET: Obtention de contrastes. - Les bains dans les sels de métaux lourds. - Ac marqués cours E. Grelier

c/ Contraintes spécifiques au MEB.
II - Techniques d’examen microscopique 2. Préparation pour l’observation microscopique 2. En cas de microscopie électronique c/ Contraintes spécifiques au MEB. Les échantillons biologiques déshydratés sont isolants donc il faut rendre leur surface conductrice: vaporisation sous vide d’une mince couche d’or ou de platine dans le cas du MEB cours E. Grelier

d/ Observation de coupes épaisses.
II - Techniques d’examen microscopique 2. Préparation pour l’observation microscopique 2. En cas de microscopie électronique d/ Observation de coupes épaisses. Pour mieux comprendre la disposition des structures dans l'espace : Coupes épaisses. L'utilisation de microscopes électroniques à haute tension (1 à 3 millions de volts) cours E. Grelier

II - Techniques d’examen microscopique 2. Préparation pour l’observation microscopique 2. En cas de microscopie électronique e. La cryofracture « sandwich » d'échantillon d'une épaisseur de l'ordre de 20 micromètres. Vitrification de l’échantillon à – 200°C Séparation des deux plaquettes de cuivre cours E. Grelier

II - Techniques d’examen microscopique 2. Préparation pour l’observation microscopique La cryofracture L'échantillon est alors fracturé. La ligne de fracture passe par les zones de moindre résistance, séparant l'échantillon en deux parties. Projection du mélange platine-carbone à 45° sur la surface fracturée de l'échantillon. Ce procédé permet d'obtenir une réplique de la surface. cours E. Grelier

II - Techniques d’examen microscopique 2. Préparation pour l’observation microscopique La cryofracture Le carbone est traversé par les électrons Le platine les arrête de façon plus ou moins totale selon l'épaisseur rencontrée par le faisceau. Zones riches en platine qui apparaissent en noir sur le film photographique zones sans relief: grises et zones sans platine: blanches. Dans bien des cas, elle permet d'obtenir de précieuses informations sur la structure de l'échantillon. cours E. Grelier

II - Techniques d’examen microscopique 2. Préparation pour l’observation microscopique La cryofracture cours E. Grelier

une image obtenue par cryodécapage montrant l'organisation membranaire de la cellule (à gauche, le noyau, à droite des nappes de réticulum endoplasmique). cours E. Grelier

3. Microscopie photonique
II. Méthodes d’étude de la morphologie des cellules : techniques d’examens microscopiques 3. Microscopie photonique cours E. Grelier

Rappel: Schémas de principe du microscope photonique
II - Techniques d’examen microscopique 3. Microscopie photonique Rappel: Schémas de principe du microscope photonique Source de photons : lampe Condenseur Lame support objet transparent Les échantillons biologiques observés sont traversés par la lumière. Objectif Oculaire Oeil cours E. Grelier

Types particuliers de microscopies photoniques: le microscope à contraste de phase Utilisation des différents indices de réfraction des milieux traversés par la lumière pour contraster les structures cellulaires sans coloration. Intérêt: possibilité d’observer des cellules vivantes et leur mouvement en microcinématographie accélérée cours E. Grelier

Types particuliers de microscopies photoniques: le microscope à épifluorescence Utilisation des marqueurs (fluorochromes : fluorescéine, rhodamine) capables d’absorber un rayonnement de faible longueur d’onde et de forte énergie émis par une source d’UV et d’émettre (par excitation) un rayonnement de grande longueur d’onde mais de faible énergie dans le visible NB: chlorophylle par exemple ne nécessite pas l’utilisation de fluorochrome. Observation de l’ADN avec un microscope à épifluorescence après utilisation de fluorochrome cours E. Grelier

Diminution de d et augmentation de PR si
3. Microscopie photonique Types particuliers de microscopies photoniques: le microscope à épifluorescence Rappelez-vous : quel est l’impact de l’utilisation d’UV plutôt que de la lumière blanche sur la limite de résolution ? Déductions théoriques Applications pratiques Diminution de d et augmentation de PR si λ diminue, Microscope à épifluorescence avec UV n augmente, Utilisation de l’huile à immersion a augmente Ouverture augmentée à la construction cours E. Grelier

Types particuliers de microscopies photoniques : le microscope à épifluorescence Un microscope à épifluorescence amélioré : le microscope confocal Exploitation du principe de la fluorescence émise par plusieurs composés excités par un rayonnement cohérent (LASER) qui balaye l’objet en largeur et en profondeur : la détection de l’image sélectionnée par un filtre précis (éliminant les émissions parasites) permet une reconstitution par ordinateur d’images éventuellement en trois dimensions cours E. Grelier

4. Microscopie électronique
II. Méthodes d’étude de la morphologie des cellules : Techniques d’examens microscopiques 4. Microscopie électronique cours E. Grelier

4. Microscopie électronique Principe
Ce n’est plus de la lumière qui est utilisée mais un flux d’électrons. Les électrons en mouvement créent une onde de longueur d'onde plus courte que celle de la lumière. La limite de résolution d'un microscope électronique sera donc plus petite et le pouvoir séparateur plus élevé que celui d'un microscope photonique. cours E. Grelier

4. Microscopie électronique
* Inconvénients : 1/ Les ë ne se propagent que dans le vide très poussé ce qui empêche toute observation sur le vivant ; 2/ La pénétration des ë dans la matière est très faible, donc les coupes doivent être très minces (de l'ordre de 0,06 à 0,09 μm ~ 0,1 μm pour 2 à 5μm en microscopie photonique) ; on utilisera un ultramicrotome. cours E. Grelier

Schémas de principe des microscopes
4. Microscopie électronique Schémas de principe des microscopes Électroniques à transmission (MET) à balayage (MEB) Source d’électrons : filament chauffé soumis à une forte ddp >100 kVolts 1 à 40 kvolts Condenseur Grille de cuivre support objet transparent Bobines déflectrices donnant un faisceau mobile d’électrons balayant l’objet Objectif(s) réglables Image vidéo Vide Projectif Détecteur Objet non transparent Écran fluorescent Plaque photographique cours E. Grelier

4. Microscopie électronique : Le MET
Ce sont les ë qui traversent l'échantillon qui contribuent directement à la formation de l'image. On ne peut qu'observer des objets très minces, généralement on s'adresse à des coupes. Observation d’un chloroplaste au MET Vidéo cours E. Grelier

4. Microscopie électronique: Le MEB
Les échantillons sont bombardés par un faisceau d'ë, mais seuls sont utilisés pour la formation de l'image, les ë qui sont réémis par la surface de l'échantillon. A la différence du microscope électronique par transmission, il est donc possible d'étudier des échantillons massifs dont seule la surface est observée. Observation d’un grain de pollen au MEB Vidéo MEB cours E. Grelier

III. Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules
1. Techniques de fractionnement cellulaire cours E. Grelier

III – Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules 1
III – Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire Etape 1 : éclatement de la cellule Pour récupérer des organites Pour étudier les organites Etape 2 : séparation des organites cours E. Grelier

III – Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire Éclatement de la cellule Techniques physiques : ultrasons ou hautes pressions chimiques : choc osmotique, action de détergents ou d’enzymes mécaniques : pistons et cylindres comme tube de Potter cours E. Grelier

L’homogénat est conservé à 0°C … Pourquoi?
III – Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire L’homogénat est conservé à 0°C … Pourquoi? . Préservation maximale des structures et fonctions des différents constituants cellulaires et des enzymes cours E. Grelier

Quel est le contenu de l’homogénat ?
III – Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire Quel est le contenu de l’homogénat ? noyaux, mitochondries, lysosomes et peroxysomes fragments provenant des ruptures membranaires (plasmique, réticulum, Golgi) se refermant immédiatement pour donner de petites vésicules fermées appelées microsomes cours E. Grelier

III – Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire Etape 1 : éclatement de la cellule Pour récupérer des organites Pour étudier les organites Etape 2 : séparation des organites cours E. Grelier

III – Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire Séparation des organites par ultracentrifugation différentielle série de centrifugations de plus en plus longues et donnant des champs de gravité de plus en plus élevés pour fractionner l’extrait initial en une série de culots et surnageants. technique préparative rapide, simple et permettant de manipuler des grandes quantités de matériel sans donner cependant de fractions parfaitement pures. cours E. Grelier

III – Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire Séparation des organites par ultracentrifugation différentielle Cellules vivantes Broyage Homogénat Surnageant Surnageant Centrifugation 1000 g 10 min Centrifugation g 20 min Culot : Noyaux et débris Centrifugation g 60 min Culot : mitochondries, lysosomes et peroxysomes Culot : microsomes (membranes fragmentées) cours E. Grelier

III – Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire Séparation des organites par ultracentrifugation sur gradient de densité gradient préformé gradient autoformé cours E. Grelier

Séparation des organites par centrifugation sur gradient de densité préformé
III – Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire Protocole Dépôt d’une fine couche de l’homogénat à la surface du gradient contenu dans le tube à centrifuger : solution de saccharose ou de glycérol dont la concentration varie de façon régulière et décroissante du bas vers le haut du tube, variation linéaire et continue ou bien discontinue et par paliers. Centrifugation à vitesse élevée pendant quelques heures. Migration des particules dans le gradient jusqu’à une position d’équilibre qui correspond à sa densité Obtention d’anneaux le long du tube (centrifugation zonale) qui peuvent être récupérés séparément par aspiration. Technique permettant d’obtenir une séparation des constituants cellulaires en une seule étape d’un grand degré de pureté. ne permettant de manipuler que de petits volumes de matériel biologique et constituant donc une technique uniquement analytique. Lysosomes (1,12 g/mL) Mitochondries (1,18 g/mL) Peroxysomes (1,23 g/mL) cours E. Grelier

III – Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire Séparation des organites par centrifugation sur gradient de densité autoformé Également appelée centrifugation sur gradient de densité à l’équilibre. Dilution de l’homogénat dans une solution concentrée de chlorure de césium (CsCl) Centrifugation de cette préparation à plus de g pendant plusieurs heures. Sédimentation des ions Cs+ très denses Établissement d’un gradient de concentration (gradient de densité) Répartition des constituants de l’homogénat dans ce gradient selon leur densité Obtention d’anneaux le long du tube Récupération des différentes fractions. Cette technique permet de séparer les molécules indépendamment de leur taille et avec des différences de densité très faibles (elle permet notamment de séparer des fragments d’ADN ayant du N14 de ceux ayant du N15). Technique mise au point par Svedberg (1923) pour déterminer des masse moléculaires et appliquée à la biologie par le physiologiste belge Albert Claude (Prix Nobel 1974) pour isoler les microsomes Détermination de Coefficient de Sédimentation exprimé en unités Svedberg S défini comme la vitesse de sédimentation (m/s) par unité d’accélération (m/s2) et équivalent à s cours E. Grelier

III – Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire Séparation des organites par centrifugation sur gradient de densité autoformé 3 - Densité croissante cours E. Grelier

III. Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules
2. Marquage cours E. Grelier

III – Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules 2. Marquage Elastine dans le derme (Coloration de WEIGERT - grossissement x 400) cours E. Grelier

III – Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules 2. Marquage Réticuline dans les tubules rénaux (coloration Gordon Sweets x 250) cours E. Grelier

III – Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules 2. Marquage Mucus : coupe de la muqueuse oesophagienne (coloration PAS x 100). cours E. Grelier

III – Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules 2. Marquage bronche tertiaire avec son épithélium cylindrique cilié et cellules caliciformes entouré de tissu conjonctif et de fibres musculaires lisses Coloration Hémalun Phloxine Safran - Grossissement x 200 cours E. Grelier

III – Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules 2. Marquage frottis de sang d'anémie sidéroblastique montrant un sidéroblaste II (érythroblaste acidophile possédant dans son cytoplasme des grains d'hémosidérine (molécule de stockage du fer) car il ne peut intégrer le fer dans l'hémoglobine la coloration est la coloration de Perls x 1000 cours E. Grelier

III – Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules 2. Marquage frottis de leucémie aigue où les blastes (cellules cancéreuses) possèdent dans leurs granulations de la myéloperoxydase mise en évidence par ajout d'un substrat qui précipite sous forme de grains bleus ce qui fait classer le leucémie en LAM (leucémie aiguë myéloblastique). cours E. Grelier

III – Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules 2. Marquage Marquage spécifique par des conjugués (marqueurs fixés sur des anticorps) Fluorochromes Isotopes radioactifs Enzymes (peroxydase ou phosphatase alcaline) Fuseau mitotique mis en évidence par un anticorps antitubuline reconnu par un anticorps maqué à l’Alexa 488 Chromosome révélé en bleu par du DAPI (colorant spécifique des bases nucléotidiques) Or (ou argent) colloïdal Ferritine (cœur de fer opaque aux électrons) Granules sécrétoires de cellules gastriques mis en évidence par un anticorps antigastrine reconnu par un conjugué (anti Ig couplé à la ferritine) MET Glucagon mis en évidence dans des cellules pancréatiques par un anticorps antiglucagon reconnu par un conjugué (anti Ig couplé à l’or colloïdal) MET cours E. Grelier

IV. Méthode d’étude du métabolisme cellulaire
1. Isotopes radioactifs cours E. Grelier

IV. Méthode d’étude du métabolisme cellulaire 1
IV. Méthode d’étude du métabolisme cellulaire 1. Isotopes les plus utilisés Notion d’isotopes éléments chimiques ayant le même nombre d’électrons que les éléments naturels mais différant par la masse de leur noyau. pouvant être instables : radioactifs car subissant des désintégrations libérant des électrons ou des radiations détectées : par un compteur Geiger (mesure de l’ionisation produite par les radiations dans un gaz) par un compteur à scintillation (mesure d’éclairs lumineux provoqués dans un liquide scintillant) par son action sur le bromure d’argent d’une émulsion photographique que les radiations réduisent en argent métallique et qui est ensuite développée sous forme de taches visibles. principaux radio-isotopes utilisés en biologie 3H (acides minés, oses, nucléotides) 14C (acides aminés, nucléotides) 32P (nucléotides) 35S (acides aminés soufrés) 22Na 42K 125I. cours E. Grelier

2. Principe cours E. Grelier

IV. Méthode d’étude du métabolisme cellulaire 2. Principe
Pulse chase permettant d’étudier le métabolisme cellulaire Pulse : mises en présence pendant une courte durée de cellules vivantes et d’un précurseur métabolique radioactif dit chaud qui est incorporé dans la cellule entrant dans certaines réactions métaboliques. Chase : maintien des cellules dans un milieu contenant un large excès de précurseur froid et donc élimination progressive du précurseur chaud jusqu’à ce que seule une petite quantité soit incorporé dans la cellule. Détection : prélèvements espacés régulièrement permettant de suivre les transformations du précurseur chaud en diverses molécules portant le marquage radioactif ou réalisation d’autoradiographies afin de localiser dans quel compartiment se situent les molécules radioactives. cours E. Grelier

3. Détection de la radioactivité des préparations biologiques : l’autoradiographie cours E. Grelier

IV. Méthode d’étude du métabolisme cellulaire 3. L’autoradiographie
Coupe de cellule Marquage radioactif Autoradiographie permettant la localisation de composés radioactifs dans des cellules entières ou des coupes de tissus. Exposition de cellules vivantes à un pulse rapide d’un composé radioactif. Lavage, fixation puis traitement pour l’observation en microscopie photonique ou électronique. Dépôt sur la préparation d’une mince couche d’émulsion photographique et incubation. Développement de l’émulsion Localisation de la radioactivité par la position des grains d’argent Noyau Émulsion photographique Atome radioactif Grain d’argent Trajet des électrons Grain d’argent cours E. Grelier

IV. Méthode d’étude du métabolisme cellulaire 3. L’autoradiographie
Autoradiographie en microscopie électronique d'une cellule épithéliale provenant d’un animal auquel de la thymidine tritiée a été administrée quatre jours auparavant. L’incorporation de thymidine tritiée dans le noyau, résulte d’une synthèse d’ADN utilisant cette base nucléotidique. Elle signe l’apparition d’une cellule nouvellement formée. cours E. Grelier

1. Conditions à respecter
V. Culture cellulaire 1. Conditions à respecter cours E. Grelier

V. Culture cellulaire 1. Conditions à respecter
Température régulée la plus proche possible de la température naturelle. pH neutre maintenu grâce à l’emploi de solutions salines tamponnées et une atmosphère enrichie en CO2. Présence de nombreux éléments nutritifs : glucose, sels minéraux, acides aminés…. Présence de facteurs de croissance : vitamines et utilisation de sérum de veau. Respect d’une asepsie stricte : ajout éventuel d’antibiotiques aux milieux de culture. Support adapté en verre ou en plastique parfois recouvert de composants de la matrice extracellulaire comme le collagène. cours E. Grelier

2. Intérêts des cultures cellulaires
V. Culture cellulaire 2. Intérêts des cultures cellulaires cours E. Grelier

V. Culture cellulaire 2. Intérêts des cultures cellulaires
Étude de l’influence de différents facteurs sur les cellules : substrats, température, substances chimiques, médicaments… Suivi de précurseurs du métabolisme marqués pour étudier leur devenir dans la cellule. cours E. Grelier

3. Différents types cellulaires utilisés
V. Culture cellulaire 3. Différents types cellulaires utilisés cours E. Grelier

V. Culture cellulaire 3. Différents types cellulaires utilisés
Cellules issues de tissus normaux Obtention des cellules à partir d’organes ou de tissus d’organismes adultes ou embryonnaires par action chimique et mécanique sur le tissu d’origine. Culture primaire : mise en cultures dans des boîtes contenant un milieu de culture adapté d’une suspension cellulaire ajustées multiplication pour former un tapis continu (confluence) arrêt des divisions par inhibition de contact. Passage donnant une culture secondaire : trypsination : détachement des cellules de la culture primaire du support par action de la trypsine ensemencement des cellules dans un milieu nutritif neuf. Nombre de passage : limité sauf pour les cellules embryonnaires 2 ou 3 pour les cellules épithéliales, Un peu plus pour les fibroblastes (cellules du tissus conjonctif). Cellules gardant les caractéristiques des cellules du tissu d’origine cours E. Grelier

V. Culture cellulaire Cellules de lignées continues
3. Différents types cellulaires utilisés Cellules de lignées continues propriétés : croissance rapide, perte de l’inhibition de contact, possibilité d’un nombre illimité de passage. obtention : sélection de cellules issues de tissus normaux ayant développé une mutation spontanée les rendant « immortelles » comme les cellules 3T3 de rongeur. traitement de cellules normales par des agents chimiques ou physiques mutagènes ou par des virus oncogènes pour les rendre « immortelles ». utilisation de cellules cancéreuses dites transformées (capables d’induire une tumeur après injection à un animal sain) comme les cellules HeLa (humaines, carcinome de l’utérus, utilisées depuis 1952) ou de cellules embryonnaires comme les cellules MRC5 (fibroblastes pulmonaires embryonnaires humains) cours E. Grelier

V. Culture cellulaire Cellules hybrides
3. Différents types cellulaires utilisés Cellules hybrides obtenues par fusion chimique ou physique et possédant, dans un premier temps, deux noyaux séparés appelées hétérocaryons . donnant après mitose des cellules hybrides dans laquelle tous les chromosomes se rassemblent pour former un unique noyau. Technique de culture des hybridomes utilisée dès 1976 pour développer la production industrielle d’anticorps monoclonaux après formation d’un hétérocaryon entre Un plasmocyte (LB différencié) sécréteur d’anticorps spécifiques une cellule de myélome (cancer du tissu conjonctif où les cellules cancéreuses sont de nature plasmocytaire) cours E. Grelier

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