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Prolonger votre offre de soins, jour après jour Séparation magnétique des plasmocytes dans le cadre des myélomes multiples Elodie DAVID Equipe Onco-hématologie.

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1 Prolonger votre offre de soins, jour après jour Séparation magnétique des plasmocytes dans le cadre des myélomes multiples Elodie DAVID Equipe Onco-hématologie en cytogénétique

2 Prolonger votre offre de soins, jour après jour Sommaire 1.Le Myélome Multiple : Définition 4. Les outils de séparation :Différents appareils 3. La séparation magnétique :Principe 2. La purification des plasmocytes :Pourquoi ?

3 Prolonger votre offre de soins, jour après jour 1. Le Myélome Multiple Définition : prolifération maligne dun clone plasmocytaire produisant de manière inadaptée et exagérée une immunoglobuline ou lun de ses fragments 3 stades (classification de Durie et Salmon) : Plasmocytes matures Stade I Plasmocytes immatures Cytoplasme important Stade II Plasmoblastes Formation dagrégats Stade III

4 Prolonger votre offre de soins, jour après jour Incidence: -Augmente avec lâge -Légèrement plus fréquent chez lhomme que chez la femme -Moyenne dâge de 64 ans Diagnostic : -Mise en évidence dune gammapathie monoclonale sérique et/ou urinaire -Mise en évidence dune prolifération plasmocytaire médullaire Signes cliniques: -Lésions osseuses -Hypercalcémie -Anémie -Insuffisance rénale… 1. Le Myélome Multiple

5 Prolonger votre offre de soins, jour après jour Anomalies cytogénétiques : - Hyperdiploïdie : chromosomes : +3, +9, +15, +19… - Hypodiploïdie - t(4;14) - Délétion totale ou partielle des chromosomes 13 et Le Myélome Multiple Valeur pronostique permettant un traitement adapté sans anomalies de structure associées Cytogénétique conventionnelle : vue densemble du caryotype hyperdiploïdie Diagnostic et suivi : Cytogénétique moléculaire : plus précis et sensible anomalies fines comme t(4;14), del(13), del(17) ET

6 Prolonger votre offre de soins, jour après jour 2. Pourquoi une purification des plasmocytes? Tri magnétique des plasmocytes avec étude des chromosomes 4, 14, 13 et 17 Etude du Myélome Multiple = étude des plasmocytes Plasmocytes dilués dans la masse cellulaire

7 Prolonger votre offre de soins, jour après jour 3. Séparation magnétique des plasmocytes Plasmocytes = CD Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD138 couplé à une bille magnétique 2. Tri sur colonne magnétique 3. Création dun champ magnétique 4. Récupération des plasmocytes en cassant le champ magnétique Principe : 3 appareils (Miltenyi) : - VarioMACS - AutoMACS - AutoMACS Pro

8 Prolonger votre offre de soins, jour après jour 3. Séparation magnétique des plasmocytes VarioMACS et AutoMACS Réalisation dun ficoll Récupération des globules blancs au niveau de lanneau Filtration de la moelle totale Lavage Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD138 couplé à une bille magnétique Passage de léchantillon dans une colonne de billes magnétiques Création dun champ magnétique Récupération de la fraction négative Cassure du champ magnétique Récupération fraction positive Plasma Cellules mononuclées Ficoll Polynucléaires et globules rouges 2 Lavage

9 Prolonger votre offre de soins, jour après jour 3. Séparation magnétique des plasmocytes VarioMACS et AutoMACS Perte cellulaire dans le ficoll : Utilisation de lAutoMACS Pro Colonnes et valves souvent saturées Technique lourde (temps) - agrégations protéique et plasmocytaire - cellules de tailles différentes I II III

10 Prolonger votre offre de soins, jour après jour AutoMACS Pro 3. Séparation magnétique des plasmocytes Sélection du programme Tri magnétique sur AutoMacs Pro 3 tubes : échantillon, fraction négative et positive Après cassure du champ magnétique, récupération fraction positive Après technique, 3 lames étalées : t(4;14),13 et 17 Filtration de la moelle totale Lavage Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD138 couplé à une bille magnétique Lavage

11 Prolonger votre offre de soins, jour après jour AutoMACS Pro 3. Séparation magnétique des plasmocytes Adaptation du programme de séparation Travail sur moelle totale : Ac anti-CD138 plus concentrés rendement augmenté (>86% : panel FISH complet) automate moins saturé, maintenance adaptée Tampons plus agressifs et filtres 40 µm pureté augmentée (<5% déchec de purification) Automatisation Gain de temps

12 Prolonger votre offre de soins, jour après jour CONCLUSION routine dans les bilans de myélome multiple si nécessaire préférée à la mise en culture support pour les études pangénomiques Séparation magnétique :

13 Prolonger votre offre de soins, jour après jour Remerciements Léquipe donco-hématologie en cytogénétique, CERBA Léquipe de FISH, CERBA Hossain MOSSAFA, cytogénéticien à CERBA MILTENYI

14 Prolonger votre offre de soins, jour après jour Annexe 1 : Classification de Durie et Salmon orange.fr/import/CANCERO/ CLASSIFICATION/MYELOM E.htm

15 Prolonger votre offre de soins, jour après jour 4p13 : fluorochrome rouge 14q32 : fluorochrome vert t(4;14)(p13;q32) del(17)(p11) Bandes R del(13)(q14q21) Bandes G Annexe 2 : quelques anomalies cytogénétiques

16 Prolonger votre offre de soins, jour après jour 1 er test 2007 : Programme Possel-D avec utilisation uniforme de 50µL dAc anti-CD138 Patient Bone Marrow (ml) Total WBC % Plasma cells slide Theoric Total plasma cells MicroBea ds Control Purity by flow cytometry Obtened Total Labeled P cell Perform ance 07D mL 3.3*10^ 6 c/mL 36% 50 µL94,60%5.3*10^5 60%6.5*10^68,15% 07D mL 5.8*10^ 6 c/mL 8% 50 µL93,45.6*10^5 72.7%2.6*10^72,15% 07D mL 4.1*10^ 6 c/mL 5% 50 µL68,40% 10.9*10^ %1*10^71,10% 07D mL 5.6*10^ 6 c/mL 4% 50 µL72,80%1.7*10^5 1%3.2*10^553,13% 07D mL 4*10^6 c/mL 22% 50 µL88,40%2.5*10^5 15%1.8*10^613,90% 07D mL 8.4*10^ 6 c/mL 0% 50 µL65,50%5.2*10^4 5%2.2*10^62,36% 07D mL 3*10^6 c/mL 15% 50 µL88,70%1.8*10^5 12%9.7*10^519% 07D mL 7.7*10^ 6 c/mL 3% 50 µL31%7.4*10^4 1%4.7*10^515,70% 07D mL 1.1*10^ 6 c/mL 60% 50 µL54,10%1.5*10^5 5%3.7*10^540,50% 07D mL 1.6*10^ 7 c/mL 8% 50 µL65,50%1.8*10^5 1%10^618,00% % of plasma cells reported by cytologist % and total plasma cells number determined by flow cytometry labelled by CD138/CD38 Annexe 3 : mise en place dun nouveau protocole Mauvais rendement : adaptation de la quantité dAc : 50µL Ac pour 10 7 cellules

17 Prolonger votre offre de soins, jour après jour Annexe 4 : Comparaison des programmes de séparation Pas assez de noyaux pour réaliser une FISH PosselWB+Clean = Meilleur rendement Possel-D+Rinse # Possel WB+Clean


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