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Détection des Anticorps Anti-ADNnatif pour le Diagnostic du Lupus Erythémateux Systémique Étude Comparative de 7 Trousses de Dosage Immuno-enzymatique.

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2 Détection des Anticorps Anti-ADNnatif pour le Diagnostic du Lupus Erythémateux Systémique Étude Comparative de 7 Trousses de Dosage Immuno-enzymatique et d'un Test de Farr.

3 15/06/2001 Historique et épidémiologie de la maladie lupique Lupus signifie « loup » en latin formes cutanées Prévalence de 15 à 200 pour habitants ; Fréquence plus élevée chez les sujets non caucasiens ; Prédominance féminine : 8 à 9 femmes pour un homme ; Pic de fréquence entre 20 et 30 ans ; Étiologies : facteurs génétiques, endocriniens, immunitaires environnementaux… Éruption en ailes de papillon (Hebra 1845) Mais présence aussi de complications viscérales…

4 15/06/2001 Diagnostic clinique de la maladie lupique Définition de Dubois : « Syndrome clinique - de cause inconnue, - avec atteinte systémique - touchant un ou plusieurs appareils Critères de gravité de la maladie : atteinte rénale, cardiaque, neurologique, hématologique (AHAI, purpura thrombopénique); - évoluant par poussées, - entrecoupé de rémissions multiples ».

5 15/06/2001 Diagnostic biologique de la maladie lupique Anomalies biologiques diverses: 1) Signes hématologiques : anémie, leucopénie, thrombopénie 2) Signes inflammatoires : - Hyper globulinémie polyclonale - Dissociation VS, CRP ; 3) Cryoglobulinémie (III) ; 4) Activation du complément : CH50, C3, C4 (C1q). Grande diversité dauto-Ac: - Ac antinucléaires les plus spécifiques : - anti-ADNnatif (40 à 90%) - anti-Sm (5 à 30%) - anti-PCNA (3 à 5%), - Ac anti-phospholipides (20 à 40% des lupus), - Ac anti-cellules sanguines - Facteur rhumatoïde (30%)

6 15/06/2001 Critères de classification de lACR 1 Éruption malaire en ailes de papillon 2 Lupus discoïde 3 Photosensibilité 4 Ulcérations buccales et nasopharyngées 5 Polyarthrite non érosive 6 Pleurésie ou péricardite 7 Atteinte rénale : protéinurie 0.5 g/24 h, cylindres urinaires 8 Atteinte neurologique : convulsions, psychose (sans médicaments inducteurs) 9 Atteinte hématologique : Anémie hémolytique avec hyper-réticulocytose ou leucopénie 4 000/mm3 constatée au moins à 2 reprises ou lymphopénie 1 500/mm3 constatée au moins à 2 reprises ou thrombopénie /mm3 en l'absence de cause médicamenteuse 10 Désordre immunologique : anticorps anti-ADN natif, anticorps anti-Sm, anticorps anti- phospholipides (soit anti-cardiolipine de type IgG ou IgM à taux élevés, ou anticoagulant circulant lupique, ou sérologie syphilitique dissociée) 11 Présence d'un titre anormal d'anticorps anti-nucléaires.

7 15/06/2001 Rôle dans la pathogénie : IgG et de haute avidité Atteintes rénales IgM et de faible avidité Faible activité de la maladie Intérêt dans le diagnostic : - Taux élevés = Forte valeur prédictive (94%) mais attention!! - Diagnostic différentiel de lupus induit (Ac anti-ADNn <5%) Intérêt dans le suivi : - Évolutivité : Taux élevés = Indice pronostic péjoratif 8 à 35% de lupus quiescents avec Ac anti-ADNn à taux élevés; - Prise en charge thérapeutique. Les Anticorps anti-ADN natif Ac anti-ADN natif = Anticorps anti-nucléaires dirigés contre lADN du nucléosome. Il existe 3 types dAc anti-ADN : - Ac anti-ADN natif dirigés contre lADNdb seul ou lADNdb et lADNsb ; - Ac anti-ADN dénaturé dirigés uniquement contre lADNsb. Discordances : Pas de règle 100% établie!! Seuls les Ac anti-ADN natif sont spécifiques du LES :

8 15/06/2001 Les méthodes de détection des Ac anti-ADN natif Recherche des anticorps anti- nucléaires par : Immunofluorescence indirecte sur cellules HEp-2. Aspect nucléaire homogène sur cellules HEp-2 Confirmation de la spécificité « anti-ADNn » et dosage par 3 méthodes distinctes : Test de Farr Immunofluorescence sur Crithidia luciliae Technique ELISA

9 15/06/2001 Les méthodes de détection des Ac anti-ADN natif Test de Farr (RIA) IFCLELISA Sensibilité Spécificité /- Avantages-Technique quantitative -Méthode en phase liquide Test de référence - Test de référence -Spécifique de l'ADN natif, Simple à mettre en oeuvre - Simple à mettre en oeuvre -Technique quantitative, -Facilité d'emploi, -Faible coût Inconvénients-Présence possible d'ADN dénaturé en solution Utilisation de radioisotopes - Utilisation de radioisotopes -Technique semi- quantitative, Lecture subjective - Lecture subjective -Phénomène de zone Présence possible d'ADN dénaturé contaminant Interférences Héparines,Dextrans, Polyanions Ac anti-histones Viroses, Syndrome des anti-phospholipides

10 15/06/2001 Objectifs de ce travail Enquête rétrospective : Évaluation des performances de 7 coffrets de dosage immuno- enzymatique des Ac anti-ADN natif par rapport au test de Farr utilisé en routine dans le laboratoire dImmunologie du CHRU de Lille.

11 15/06/2001 Sérums et patients Critères biologiques de sélection des 80 sérums : 76 sérums avec un titre en anticorps anti-nucléaires 1/320 e en IFI : 43 sérumsFarr + 33 sérums Farr – 4 sérums avec taux dalpha foeto- protéine (AFP) 4000 g/L (seuil à 10 g/L) Répartition clinique : 70 pathologies auto-immunes : 53 lupiques : 53 lupiques : 17 non lupiques 17 non lupiques = autres maladies auto-immunes (SAPL, GS, myasthénie) 10 autres pathologies (Raynaud, pneumopathie, hépatopathie) N=44Sex ratio(F/H)=93% Age=15-78 ans (moyenne 42ans) Sévérité : Forme bénigne 18% (8/44) Forme modérée 48% (21/44) Forme grave 34% (15/44) Traitement : 43/44 (97%) Association à dautres MAI : 45.5% (20/44)

12 15/06/2001 Matériel et méthodes Les 7 coffrets ELISA : Bio Advance - Test 1 : société Bio Advance, Sanofi Pasteur Diagnostics - Test 2 : société Sanofi Pasteur Diagnostics (Biorad), BMD - Test 3 et 4 : société BMD, The binding site - Test 5 : société The binding site, Menarini Diagnostics - Test 6 : société Menarini Diagnostics, Pharmacia & Upjohn - Test 7 : société Pharmacia & Upjohn. Test de Farr : Société Ortho Clinical Diagnostic Méthodologie identique : 1) Incubation des sérums dans les puits coatés dADNbicaténaire, 2) Lavage, 3) Incubation en présence du conjugué, 4) Lavage, 5) Incubation en présence du substrat, 6) Révélation (lecture de DO). Mais différences entre les trousses : - Nature de lantigène, de lanticorps ; - Autres : temps dincubation, dilution des sérums, nombre de calibrants, DO de référence et la valeur seuil… Calcul dun seuil arbitraire

13 15/06/2001 Dosages des Ac anti-ADN natifs obtenus par le test de Farr et différents coffrets ELISA chez les patients lupiques UI/mL Seuil arbitraire Farr BioAdvance Sanofi BMD a BMD b The Binding site Menarini Pharmacia

14 15/06/2001 Dosage des Ac anti-ADN natifs obtenus par le test de Farr et différents coffrets ELISA chez les patients non-lupiques UI/mL Seuil arbitraire Farr BioAdvance Sanofi BMD a BMD b The Binding site Menarini Pharmacia

15 15/06/ Farr Indices informationnels Sensibilité (%) Spécificité (%) Sensibilité=71% Performances du test de Farr : Sensibilité=71%Spécificité=78% Ac de haute affinité =Maladie lupique évolutive 89% des lupus avec Farr positif = formes modérées ou graves Corrélation Titres/ Clinique : seulement entre formes bénignes et graves Discordances clinico-biologiques : - 28% lupus avec Farr négatif : -supérieur à la littérature (8 à 22%) -rarement formes bénignes -découverte récente -souvent atteinte articulaire -lupus traité - 18% non-lupiques avec Farr positif : -SAPL le plus souvent Contre performance? Phase pré-sérologique? Lupus éteints ou stabilisé sous traitement? Phase pré-clinique de lupus biologique?

16 15/06/2001 Indices informationnels Farr BioAdvance Sanofi BMD a BMD b The Binding site Menarini Pharmacia Sensibilité (%) Spécificité (%)

17 15/06/2001 Comparaison Méthodes ELISA / Test de Farr Concordance des résultats : MODESTE - Dans la population lupiquede 43 à 73%, - Dans la population non lupique de 34 à 82%, - Meilleure concordance globale avec les tests 2 (68%) et 7 (67%). Corrélation des titres dAc anti-ADNn dans la population lupique : ACCEPTABLE - Coefficient de corrélation de 0.24 à 0.67, - Meilleure avec les tests 2 et 6, - Meilleure pour les titres élevés en Ac anti-ADN natif.

18 15/06/2001 Comparaison des méthodes ELISA Grande hétérogénéité des résultats obtenus : Variation des sensibilités de 15 à 100% Variation des spécificités de 15 à 94% Concordance des résultats : MAUVAISE - Dans la population lupiqueseulement pour 6 sérums (11%) Meilleure avec les 4 coffrets les plus sensibles : 82% - Dans la population non lupique seulement pour 1 sérum (3.7%)!! Médiocre avec les 5 coffrets les plus spécifiques : 22% Corrélation des titres avec la clinique : MAUVAISE Seule UNE trousse (test 2) titres formes graves/ bénignes

19 15/06/2001 Manque de standardisation global entre les 7 coffrets même si étalonnés par rapport au même standard international : W0 80 Diagnostic biologique incohérent entre la majorité des trousses Suivi évolutif des patients lupiques non adapté par méthode ELISA Origines des discordances : Facteurs extérieurs? Défaut intrinsèque? - Phase solide=manque de spécificité, - Imperfections des microplaques, - Ac anti-plastique. Différences entre les trousses? - Nombre détalons pour la calibration, - Nature du réactif conjugué (antiglobuline), - Origine de lAg. Comparaison des méthodes ELISA

20 15/06/2001 Interférences Ac anti-Histones/ Ac anti-ADN dénaturé : Résultats faux positifs avec 6 coffrets (Farr négatif et patients non lupiques). AFP : Interférences avec 4 coffrets (tests 3, 4, 5 et 7) Ac anti-phospholipides : Résultats positifs avec 5 coffrets (sauf tests 5 et 6 ) Phase solide favorise les réactions croisées entre Ac anti-phospholipides et ADN, Or test de Farr positif pour 4 de ces sérums : présence probable dAc anti-ADNn Phase pré-clinique de lupus? Facteur rhumatoïde et cryoglobuline: Non représentatif dans notre enquête.

21 15/06/2001 Intérêt dune démarche biologique hiérarchisée Détection par IF-CL + - Méthodes ELISA Confirmation par test de Farr Adapter selon dialogue clinico-biologique Suivi évolutif : Test de Farr détecte une augmentation des Ac anti-ADNn dans 85% des cas de rechutes contre 75% pour ELISA et 63% pour lIF-CL Associer dautres paramètres biologiques : CH50 et fractions… Recherche danticorps anti-nucléaires par IFI : Présents dans 99 à 100% des lupus mais non spécifiques de la maladie (connectivites, affections inflammatoires, sujet âgé) Recherche dAc anti-ADNn =Test de 1 ère intention Aspect homogène en IFI avec titre 1/320 e

22 15/06/2001 Conclusion Aucun coffret commercial ELISA natteint les performances du test de Farr car : - Problèmes techniques - Encore trop de discordances et d'interférences - Absence de corrélation entre titre et sévérité clinique Choisir un coffret fiable Confirmation par test plus spécifique Importance du dialogue clinico-biologique…


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