Chapitre 7 Génie biologique Partie 1 Croissances microbiennes.

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1 Chapitre 7 Génie biologique Partie 1 Croissances microbiennes

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3 - dégradation paroi. PLAN 3 - étranglement membrane. - séparation des cellules filles (et réparation de la paroi). - réplication du chromosome. - répartition de l’ADN entre les cellules filles (clones). On verra que cette étape aura son importance dans l’action de certains antibiotiques. Il s’agit d’une mitose classique

4 L’inoculum est incubé dans un milieu de culture qui n’est ni changé, ni complété au cours de la croissance. PLAN 4 Batch peut se traduire par : lot, fournée. Les nutriments s’épuisent au fur et à mesure du développement microbien. Les déchets métaboliques s’accumulent. Ces deux phénomènes se complètent et se renforcent. Cependant, nous verrons avant tout l’influence de la concentration en substrat sur la vitesse de croissance.

5 On a vu en première que la croissance par scissiparité est une exponentielle. Celle-ci étant difficile (c’est une litote !) à interpréter, on utilise systématiquement une représentation semi-log. PLAN 5 Ln ( N ) = f ( t ) maximale exponentielle

6 N = No x e µt -----> LnN = µ.t + LnNo µ = v spf de croissance (en h -1 ) maximale exponentielle N = No x 2 n = No x 2 rt n = nbre de division r = taux horaire de croissance (en div / h) -----> = 1 / G G = temps de génération (temps entre 2 division) = T 1/2 * Aspect népérien * * Aspect binaire * N = No x e µt = No x 2 rt -----> e µt = 2 rt -----> µt = r.t.Ln2 -----> µ = r.Ln2 * Relation entre les 2 * PLAN 6

7 La vitesse de croissance varie avec l’évolution du milieu. Phase de latence: Temps d’adapation au milieu. Phase d’accélération Phase exponentielle de croissance: Croissance maximale. Phase de ralentissement Plateau Phase de déclin: Les bactéries se mettent à mourir. On a vu en première les causes de ces variations de rythme. PLAN 7

8 Il existe une autre représentation de la croissance microbienne. PLAN 8 Ln ( N ) = f ( v ) On repère la partie exponentielle par la présence d’un plateau. Phase exponentielle de croissance: Croissance maximale.

9 PLAN 9 µ T Son influence est double: Elle augmente les vitesses de réaction du métabolisme. Vitesse maximale Température optimale Elle favorise la dégradation des constituants cellulaires La température joue un rôle important dans les croissances microbiennes. La croissance est plus rapide. La croissance ralentie. On classe les microorganismes en trois catégories en fonction de leur comportement face à la température.

10 PLAN 10 µ T 25 On classe les microorganismes en trois catégories en fonction de leur comportement face à la température. 4050 mésophile psychrophilethermophile

11 PLAN 11 * Cas des hyper-thermophiles Les premiers hyper-thermophiles ont été découvert en 1964 dans des sources chaudes dans le parc national de Yellowstone, Wyoming, par Thomas D. Brock. Parmi les bactéries découvertes, l’une d’elles fut baptisée Thermus aquaticus et une enzyme qu'elle contient, la taq polymérase (taq est l'abréviation de thermus aquaticus) est aujourd'hui un des produits chimiques les plus vendus au monde, car il intervient dans le processus de PCR. La PCR est une technique de synthèse d’ADN très performant qui nécessite une DNA polymérase fonctionnelle à 50°C. Vous l’étudierez en détails après le Bac.

12 PLAN 12 Archipel des Galápagos C’est en 1977, au cours de l’exploration de la dorsale des Galápagos, que deux géologues embarqués à bord de leur sous-marin Alvin firent une découverte majeure. Par 2500 m de profondeur, sur la crête de la dorsale, une communauté entière d’organismes, de tailles et de formes étonnantes, proliférait autour de sources hydrothermales. Ce milieu est plongé à une température supérieure à 96°C. et à une pression dépassant 240 bars (~240 atmosphères). * Cas des hyper-thermophiles On peut parler de bactéries barophiles.

13 PLAN 13 Un extraordinaire hyper-thermophile résistante à la chaleur est la souche récemment découvert 121, un archaeon vivre à 121 ° C dans l'océan Pacifique. La souche 121 (strain 121 en anglais) a été en mesure de doubler sa population pendant 24 heures dans un autoclave à 121 ° C. La souche 121 a survécu étant chauffé à 130 ° C pendant deux heures, mais a été incapable de reproduire avant d’avoir été transférée à une température relativement plus froide de 103 ° C. La température de croissance record actuelle est de 122 ° C avec Methanopyrus kandleri, une archée trouvé dans une dorsale centrale indienne. Autres archées hyper-thermophiles: Pyrolobus fumarii, qui vit à 113°C dans les sources hydrothermales de l'Atlantique, et Pyrococcus furiosus, découverte en Italie près d'une cheminée volcanique. Methanopyrus kandleri * Cas des hyper-thermophiles

14 PLAN 14 Cette bactérie a été découverte aux abords de cheminées hydrothermales profondes au niveau des dorsales océaniques (à 3 500 m de profondeur pour P. abyssi) dans le sud-ouest du Pacifique On a aussi découvert plusieurs virus thermophiles capables d'infecter ces bactéries. Pyrococcus abyssi en division: cette bactérie, hyperthermophile anaérobie (vivant sans oxygène), a une température optimale de croissance de 96°C. Pyrococcus abyssi * Cas des hyper-thermophiles

15 PLAN 15 Notre biosphère est dans l'ensemble assez froide. Les eaux océaniques qui en constituent la plus grande partie ont des températures qui avoisinent 2-3 °C dès que l'on descend au-dessous de 100 mètres. Les calottes polaires, les glaciers et tous les biotopes froids où la température estivale ne dépasse pas les 15 à 20 °C comme le sol de la toundra sibérienne dont la température tombe à 5 °C dès 5 à 10 cm de profondeur sont les habitats naturels des psychrophiles. Les microbiologistes ont étudié les micro-organismes présents dans les micro-cavités rocheuses des vallées sèches du continent Antarctique et, plus récemment, dans les glaces épaisses qui recouvrent en permanence les lacs de ces vallées. Au sein de la glace, de microscopiques poches d'eau à l'état liquide se forment pendant l'été austral. On y trouve des communautés microbiennes constituées principalement de procaryotes psychrophiles.

16 La première adaptation au froid extrême concerne la composition du cytoplasme qui diffère entre organismes psychrophiles et thermophiles. Les études ont montré que la cellule psychrophile produit des molécules « antigel". Ces produits peuvent être des sucres et des alcools qui abaissent le point de congélation de l'eau, ou encore des protéines qui empêchent la formation de cristaux de glace comme celles détectées chez des poissons polaires ou dans l'hémoglobine de certains insectes Les enzymes psychrophiles possèdent un réseau d'interactions moléculaires plus lâche que leurs homologues thermophiles, ce qui les rend plus flexibles. Elles peuvent ainsi fonctionner à basse température à un coût énergétique moindre. Mais, le revers de la médaille, c'est que ces enzymes sont moins stables dès lors que la température augmente : elles perdent rapidement leur structure tridimensionnelle. Les membranes biologiques jouent un rôle physiologique capital puisque c'est à leur niveau que se produisent et se contrôlent les échanges moléculaires entre la bactérie et le milieu ambiant. Là encore, ce sont des protéines qui permettent à la cellule de capter, de transporter et d'accumuler dans le cytoplasme sels et molécules organiques diverses. Ces processus nécessitent de leur part une grande mobilité au sein même de la membrane. Or celle-ci, constituée d'une double couche de lipides, est plus ou moins fluide suivant les lipides qui la composent. En étudiant la composition des membranes de bactéries pychrophiles, les chercheurs ont constaté que celles-ci contiennent une grande proportion de lipides insaturés, ce qui leur permet de rester fluides à basse température. PLAN 16

17 PLAN 17 µ pH 3 4 5 6 7 8 9 10 Les enzymes bactériennes sont sensibles au pH et influencent la croissance bactérienne. On classe les microorganismes en trois catégories. neutrophile acidophilebasophile Les acidophiles vivent à des pH voisins de 3 (Thiobacillus) NB: leur pH interne reste à des valeurs normales (6 à 7) Les basophile supportent des pH > 8,5 (Bacillus) jusqu'à 10.

18 FamilleGenreSubstratExemples Lactobacillaceae Lactobacillus lait laits fermentés, yaourts, kéfirs, la plupart des fromages viandesaucissons secs, jambons secs poissonsnuoc mam végétaux choucroute, olives, "yaourts" au lait de soja céréalespain au levain, bières, huangjiu Pediococcus végétauxchoucroute, ensilage viande saucisses semi-séchées, saucissons secs poissonsnuoc mam céréalespain au levain, riz fermenté Streptoccaceae Lactococcuslait fromages blancs, à pâte molle ou pressée non cuite, kéfirs Streptococcuslait yaourts, laits fermentés, fromages à pâte pressée cuite EnterococcaceaeTetragenococcus végétauxsauce de soja, miso poissons saumure d'anchois, sauce de poisson, nuoc mam Leuconostocaceae Leuconostoc végétauxchoucroute, olives, vin, cidre laitfromages, kéfirs Oenococcusvégétauxvin BifidobacteriaceaeBifidobacteriumlaitlaits fermentés PLAN 18 Certaines bactéries sécrètent les produits acides de leur métabolisme. Elles favorisent leur propre développement. Elles inhibent le développement d’espèces concurrentes non acidophiles. Cette propriété est utilisée dans l’industrie agro-alimentaire On en reparlera dans la toute dernière partie.

19 PLAN 19 Certaines bactéries vivent à des pressions considérables. Barotolérant (0 à 1 000 m) On les rencontre: dans les grands fonds marins ou sous terre. barophiles modérés (1 000 à 6 000 m) barophiles extrêmes (6 000 à 11 000 m). dans les grands fonds marins sous terre. Certaines bactéries vivent dans des milieux à très forte concentration ionique. Halophile [Na+] > 1,5 mol.L -1 C optimale = 3 à 4 mol.L -1 L'archée Haloferax volcanii vit dans la mer morte, presque huit fois plus salée que les océans (275 g/l de chlorure de sodium). ou 4,7 mol.L -1

20 PLAN 20 Quelques exemples de bactéries extrêmes.

21 PLAN 21 Toutes les bactéries ne présentent pas les mêmes besoins. Certaines possèdent un métabolisme « primitif »et utilisent des substrats simples (CO 2, NH 4,…) D’autres utilisent des substrats plus complexes qu’elles sont incapables de synthétiser. On nomme ces molécules des facteurs de croissance. Facteurs de croissance: Molécules complexes indispensables à la croissance microbienne que les cellules sont incapables de synthétiser. Une bactérie qui dépend d’un facteur de croissance spécifique est dite: auxotrophe pour cette molécule. Une bactérie qui n’en dépend pas, est prototrophe pour cette molécule. Ces propriétés sont essentielles à l’étude génétique des procaryotes.

22 PLAN 22 µ t Les bactéries réagissent différemment en présence de deux sources de carbone. On utilise un milieu de culture contenant: - 1 g.L -1 de glucose - 10 g.L -1 de lactose Bactérie consommant uniquement le glucose. Bactérie consommant simultanément le glucose et le lactose. Bactérie consommant successivement le glucose puis le lactose. Bactérie lac - Bactérie lac + constitutive Bactérie lac + inductible

23 PLAN 23 La dégradation du lactose dépend de la présence d’une enzyme, la  galactosidase. lactose galactoseglucose En fait, elle dépend de trois enzymes qui sont synthétisées en même temps par la bactérie grâce à une organisation génétique particulière, l’opéron lactose. Voir le cours de génétique.

24 PLAN 24 La présence d’une enzyme inductible présente un intérêt sélectif. Sinon le principe n’aurait pas été conservé pendant des centaines de millions d’années ! Elle permet à la bactérie de consommer en premier le substrat pour lequel la concurrence est la plus vive. Démonstration !

25 PLAN 25 Le grand match Jamy n’aime que le chocolat au lait Choc- Fred aime les deux Choc+ constitutif Jamy versus Fred 6 chocolats (6 laits) 12 chocolats (3 laits et 9 noirs) On mange plus quand on aime tout !

26 PLAN 26 Le grand match Jamy n’aime que le chocolat au lait Choc- Sabine aime les deux Choc+ inductible Jamy versus Sabine 5 chocolats (5 laits) 13 chocolats (4 laits et 9 noirs) On mange encore plus quand sélectionne !

27 PLAN 27 Que donnerait un match Sabine aime les deux Choc+ inductible Fred versus Sabine Fred aime les deux Choc+ constitutif Dans ce cas, c’est un petit peu plus compliqué.

28 PLAN 28 Il existe un autre facteur favorisant les inductibles: Le glucose permet une croissance plus rapide que le galactose. Consommer le glucose en premier permet une colonisation du milieu plus importante et une probabilité de survie plus grande. LnN t Uniquement glucose galactose+ inductible Uniquement galactose Glucose + galactose galactose+ constitutif L’inductible prend l’avantage sur la constitutive.

29 PLAN 29 Du milieu neuf est ajouté en permanence pour maintenir la culture en croissance exponentielle La productivité de l’ensemble est à son maximum. Ajouter du milieu neuf implique que l’on retire du milieu utilisé. Arrivée de milieu neuf.Sortie de milieu utilisé. Les débits entrant et sortants sont égaux. D entrant = D sortant = D D entrant D sortant Les débits de milieux sont réglés par des pompes. DD

30 PLAN 30 Comment évolue la population de microorganismes ? La population a tendance à croitre grâce à ses divisions dues à la croissance. La population a tendance à diminuer à cause de l’élimination du milieu usagé. Arrivée de milieu neuf.Sortie de milieu utilisé. Les débits entrant et sortants sont égaux. D entrant = D sortant = D Les débits de milieux sont réglés par des pompes. DD Dépend de µ Dépend de D µ

31 PLAN 31 LnN T Mise en route des pompes. D < µ D = µ D > µ La croissance diminue progressivement: Le milieu s’épuise. La croissance est en équilibre avec le renouvellement du milieu. La culture est diluée par le milieu neuf: elle disparaît progressivement.

32 PLAN 32 3 types de milieux synthétiques Enrichis empiriques Composition connue Base de la composition connue avec addition de composés complexes. Composition précise inconnue - Source de N - Source C - Ions métalliques - Facteurs de croissance = vitamines - K 2 HPO 4 Un milieu est composé de plusieurs types d’éléments. peptones -----> alcalinisation sucres -----> acidification extraits de viande ou de levure système tampon -----> pH stable Température d’incubation. 37°C -----> pathogène de l'homme 30°C -----> levures 25°C -----> moisissures