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Structure cristallographique dune jonction de Holliday, intermédiaire principal de la recombinaison Jérémie Piton a, Odile Lecompte b, Olivier Mauffret.

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1 Structure cristallographique dune jonction de Holliday, intermédiaire principal de la recombinaison Jérémie Piton a, Odile Lecompte b, Olivier Mauffret c, Olivier Poch b, Claudine Mayer a a CRC Pôle 4 Equipe 12 - Site Pitié-Salpêtrière, UMRS 872 INSERM, 91 bd de l'Hôpital, Paris. b IGBMC, Département de Biologie et Génomique Structurales, IGBMC, 1 rue Laurent Fries, Illkirch. c LBPA, UMR 8113 CNRS, Institut Gustave Roussy, 39 rue Camille Desmoulins, Villejuif Cedex. Remerciements : Nous remercions léquipe de cristallographie du laboratoire UMRS 872 INSERM et en particulier Vanessa Delfosse et Stephanie Petrella, ainsi que Michel Pirrochi de la ligne FIP-BM30A pour son aide lors des collectes de données. Forme B, Forme HJ ? FormeModèle B HJ 1ZFC 1ZF3 OK Forme Jonction de Holliday Remplacement Moléculaire La recombinaison homologue est impliquée dans de nombreux processus cellulaires. Décrite à lorigine comme responsable de la diversité génétique en créant de nouvelles combinaisons de gènes, la recombinaison possède des rôles très importants dans la ségrégation des chromosomes, lintégration virale, la stabilité et le maintien du génome… Létape principale de la recombinaison homologue est la formation dun complexe formé de quatre brins dADN appelé jonction de Holliday qui conduit à deux doubles hélices dADN recombinées. Il est donc nécessaire de caractériser cette structure quaternaire dADN pour comprendre les causes de leurs formations ainsi que le mode de reconnaissance avec les protéines impliquées dans la recombinaison, telles que les recombinases ou les résolvases. Dans le cadre détudes de relations structure-fonction d'une famille d'ATPases atypiques d'archaea [1] (dénommées A 5 +) possédant un domaine résolvase et jouant ainsi un rôle potentiel dans la recombinaison, nous avons résolu la structure dun oligonucléotide amphimorphique, c'est-à-dire qui cristallise sous plusieurs formes (forme A, forme B ou jonction de Holliday). Des travaux antérieurs montrent que le passage dune forme à une autre est dépendant de la séquence et de la concentration en ions. Loligonucléotide CCGATATCGG cristallise en forme B dans le groupe despace P en présence de 5 mM CaCl 2, et en forme jonction de Holliday dans le groupe despace C2 avec 100 mM CaCl 2 [2]. Des cristaux de cet oligonucléotide ont ici été obtenus en présence de 30 mM MgCl 2, conditions jamais décrites dans la littérature. Loligonucléotide cristallise dans le groupe despace C2 avec les paramètres de maille a = 64,26 Å, b = 24,37 Å, c = 37,97 Å, β = 111,39°. Nous présentons ici la structure résolue à 2.3 Å en forme jonction de Holliday ainsi qu'un modèle d'interaction avec les protéines A 5 +. Résumé Domaine dhydrolyse de lATP Domaine de liaison à lADN Domaine résolvase de jonction de Holliday Jonction de Holliday ADN forme B Proposition dun modèle dinteraction AXE 2 En cours daffinement… Affinement : CNS Unité biologique R = 0,22 R free = 0,32 Unité asymétrique Symétrique généré par laxe 2 cristallographique Unité biologique = Influence des conditions de cristallisation Modifications structurales par rapport à 1ZF3 Effets des ions Mg 2 + ? Affinement et structure de HJ_Mg 1ZF3 HJ_Mg Oligonucléotide amphimorphique : cristallise sous plusieurs formes forme A, forme B, jonction de Holiday Influence de la séquence... … et de la nature des ions CCGATATCGG ? Forme HJ 1ZF3 1ZF4 Forme B 1ZFC 50 mM cacodylate de sodium, 1 mM spermine, 30 mM MgCl 2 et 30 % MPD Conditions de cristallisation + Mg 2+ + Ca 2+ (100mM) + Ca 2+ (5mM) Problématique + Na + La recombinaison homologue Intermédiaire de la recombinaison : Jonction de Holliday, structure quaternaire dADN Protéines moteurs : permet à la jonction de glisser Protéines résolvases : hydrolyse la jonction de Holliday libérant les 2 hélices recombinées Intermédiaire de la recombinaison, jonction de Holliday Forme « open X » 2 Formes en solution Jonction de Holliday Interactions protéines - ADN :- Protéines tetramériques reconnaissent la forme « open X » Ex : RuvAB, intégrase, etc… - Protéines dimériques reconnaissent la forme « stacked X » Ex : Résolvase, endonucléase, etc… Domaine dhydrolyse de lATP Domaine dhydrolyse de lATP (280 aa) Domaine AAA+ Domaine de liaison à lADN Winged Helix Domaine de liaison à lADN Winged Helix (100 aa) Domaine WH C Domaine Résolvase de jonction de Holliday Domaine Résolvase de jonction de Holliday (120 aa) Domaine Résolvase N Organisation en domaines des protéines de la famille A 5 + Interaction avec jonction de Holliday en forme « stacked X », rôle dans la recombinaison Études structurales dune jonction de Holliday Dans le cadre détudes des relations structure – fonction des protéines de la famille A 5 +, nous avons résolu la structure dun oligonucléotide en forme Jonction de Holliday. Forme Open X ou Stacked X ? Seule forme cristallisable sans protéine Références bibliographiques : [1] Lecompte O., Ripp R., Puzos-Barbe V., Duprat S., Heilig R., Dietrich J., Thierry J.-C., Poch O., Genome Res., 2001, 11, [2] Hays F.A., Vargason J.M., Ho, P.S. Biochemistry, 2003, 42, Statistiques de la collecte 2 7,4 (29,8) 2845 (428) ( ) Résolution (Å) Longueur donde (Å) a = 64.36, b =24.37, c = = Paramètres de maille (Å,°) C2C2 Groupe despace BM30A (ESRF) Source des rayons X No. Mol. dans U.A. R sym (%) I/ (I) Redondance Complétude (%) No. reflexions unique No. dobservations 11,91 (7,4) 4.1 (4.1) 96,9 (93,4) (1760) Forme « stacked X » 1 monomère CCGATATCGG CCGCTAGCGG CCGGTACCGG TCGGTACCGA CCGGCGCCGG CCAGTACUGG CCGGGCCCGG CCGGGACCGG 23 structures de type jonction de Holliday dans la NDB 8 séquences non redondantes Pu : Base purine Py : base pyrimidine


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