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Sécurité et cytométrie en flux Formation permanente Marseille 23 novembre 2007 Laboratoire de Microbiologie, Géochimie et Ecologie Marines CNRS UMR 6117.

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1 Sécurité et cytométrie en flux Formation permanente Marseille 23 novembre 2007 Laboratoire de Microbiologie, Géochimie et Ecologie Marines CNRS UMR Avenue de Luminy - Case 901- Bât TPR1, Marseille cedex 9 Tél. : (+33) Fax : (+33) Contact : Adapté du Cours de Cytométrie organisé dans le cadre du congrès ISAC (Québec, 2006) par G. Grégori et L. Krebs (Elly Lilly, USA) Gérald Grégori

2 Les risques Risques biologiques Risques biologiques Risques électriques Risques électriques Irradiation par les LASERS Irradiation par les LASERS Source:

3 Risques biologiques

4 Sources communes de risques biologiques en cytométrie en flux Echantillons frais (non fixés) Echantillons frais (non fixés) Matériel humain ou animal (singes, porcs) Matériel humain ou animal (singes, porcs) Vecteurs viraux pour transfections génétiques Vecteurs viraux pour transfections génétiques Transmission de maladies entre espèces Transmission de maladies entre espèces Pathogènes résistants aux traitement Pathogènes résistants aux traitement OGM OGM Certains virus carcinogènes (hépatite) Certains virus carcinogènes (hépatite)

5 Fausses idées préconçues Le matériel non humain/primate ne présente pas de risque Le matériel non humain/primate ne présente pas de risque Les échantillons préparés pour les analyses de virus HIV ou Hépatite, & autres maladies sont sûrs Les échantillons préparés pour les analyses de virus HIV ou Hépatite, & autres maladies sont sûrs Les cellules issues de cultures ne présentent pas de risque Les cellules issues de cultures ne présentent pas de risque Impossible dobtenir un soutien institutionnel pour améliorer les procédures de manipulation des échantillons Impossible dobtenir un soutien institutionnel pour améliorer les procédures de manipulation des échantillons

6 Le risque induit par les aérosols générés lors du tri (buse Jet-in-air) Génération de gouttelettes Normales Génération de gouttelettes Normales Petites (40-200µm) Petites (40-200µm) Micro (3-7µm) Micro (3-7µm) Le splash dans le réceptacle pour la collecte Le splash dans le réceptacle pour la collecte Problème instrumental (bouchage) Problème instrumental (bouchage) Tri à haute vitesse / haute pression augmente le risque Tri à haute vitesse / haute pression augmente le risque Perfetto et. al., Cytometry A Apr;52(2):122-30

7 Les aérosols : Source de risque élevé Quand risque dinfection potentiel : -Niveaux plus élevés de confinement -Multiples barrières secondaires pour empêcher le dispersion et la propagation dans lenvironnement Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Fourth Edition April 1999

8 Questions sur les risques biologiques ISAC 2005 Surveillance Committee Survey Tri à haute vitesse dans 85% des labos Tri à haute vitesse dans 85% des labos 65% des tris dans labos standards 65% des tris dans labos standards <10% des tris se font en BioSafetyLevel (BSL) 3 <10% des tris se font en BioSafetyLevel (BSL) 3 67% des labos ne mesurent pas la présence daérosols 67% des labos ne mesurent pas la présence daérosols Seulement 21% des tris nécessitent une formation particulière pour du matériel potentiellement à risque Seulement 21% des tris nécessitent une formation particulière pour du matériel potentiellement à risque Seulement ~ 50% des labos utilisent un questionnaire pour identifier la nature et le risque des échantillons avant daccepter le tri. Seulement ~ 50% des labos utilisent un questionnaire pour identifier la nature et le risque des échantillons avant daccepter le tri. J.Lannigan Communication – Ingrid Schmid, UCLA, Chair, ISAC Biosafety Committee

9 Dépôts potentiels des aérosols Source: (Aerosols 101)

10 Risque relatif Tous les échantillons ont un niveau de risque Les manipulations doivent être appropriées au risque Risque faible – échantillons fixés Risque faible – échantillons fixés Risque faible à modéré – lignées cellulaires non- humaines/primates et non manipulées (BSL1) Risque faible à modéré – lignées cellulaires non- humaines/primates et non manipulées (BSL1) Risque élevé – lignées cellulaires humaines/primates, manipulées génétiquement ou cellules infectées (BSL1/2) Risque élevé – lignées cellulaires humaines/primates, manipulées génétiquement ou cellules infectées (BSL1/2) Risque le plus élevé – matériel primaire humain/primate (BSL2+), cellules infectées (BSL3) Risque le plus élevé – matériel primaire humain/primate (BSL2+), cellules infectées (BSL3)

11 Eléments de confinement Equipement –Barrière primaire Equipement –Barrière primaire Laboratoire –Barrière secondaire Laboratoire –Barrière secondaire Management du labo & pratique Management du labo & pratique

12 Equipement de sécurité Equipement personnel de protection Equipement personnel de protection Hotte de protection (Biosafety Cabinet (BSC)) Hotte de protection (Biosafety Cabinet (BSC)) Confinement des aérosols Confinement des aérosols

13 Equipement de protection personnel Vêtements (blouse) Vêtements (blouse) Gants Gants Protection faciale (lunettes et masque) Protection faciale (lunettes et masque) Appareil respiratoire Appareil respiratoire

14 Confinement daérosols au niveau du cytomètre Trieur MoFlo (DAKO) Trieur FACSAria (BD)

15 Source: Cytek Development website Confinement daérosols au niveau du cytomètre FACStar Plus & FACSVantage SE

16 Eléments de confinement Equipement –Barrière primaire Equipement –Barrière primaire Laboratoire –Barrière secondaire Laboratoire –Barrière secondaire Protection de lopérateur Protection de lopérateur Protection des autres membres du laboratoire Protection des autres membres du laboratoire Protection de lextérieur du laboratoire Protection de lextérieur du laboratoire Management du labo & pratique Management du labo & pratique Questionnaire sur la nature des échantillons Questionnaire sur la nature des échantillons Traçabilité des échantillons Traçabilité des échantillons Formation du personnel Formation du personnel Zones à accès règlementés Zones à accès règlementés Bonnes pratiques de laboratoire (pipetage, nettoyage, etc.) Bonnes pratiques de laboratoire (pipetage, nettoyage, etc.) Gestion des déchets : javelliser les déchets; fixer les échantillons (Formaldéhyde) Gestion des déchets : javelliser les déchets; fixer les échantillons (Formaldéhyde) Tests/détection de contamination Tests/détection de contamination Procédure de décontamination si besoin (Péroxide) Procédure de décontamination si besoin (Péroxide)

17 Choc électrique Electrical Shock Source:

18 Plaques électriques des trieurs électromagnétiques Courant ~10µA (3X inférieur au seuil de dangerosité humaine) Courant ~10µA (3X inférieur au seuil de dangerosité humaine) Voltage ~ V Courant alternatif Voltage ~ V Courant alternatif Source: Source: MoFlo Owners Handbook

19 Choc électrique : Arc électrique des trieurs électromagnétiques Génération dun arc: résulte de plaques électriques humides Génération dun arc: résulte de plaques électriques humides Parade: Parade: Arrêter lalimentation des plaques Arrêter lalimentation des plaques Enlever les plaques et les sécher Enlever les plaques et les sécher Remonter les plaques, reprendre le tri Remonter les plaques, reprendre le tri Source: Illustration of electric arc between two metals. Reproduced by permission of Photo Researchers, Inc.

20 Choc électrique issu de la charge du jet Les trieurs appliquent une charge électrique au jet pour dévier les gouttelettes à trier Les trieurs appliquent une charge électrique au jet pour dévier les gouttelettes à trier Charge ~±200 V Courant alternatif Charge ~±200 V Courant alternatif Charge au niveau de la Charge au niveau de la chambre de flux Source:

21 Choc électrique au niveau du cristal piézoélectrique Charge sur le cristal Piézoélectrique 135 V AC Source:

22 Irradiation par les lasers Irradiation LaserAttention Source:

23 Le terme LASER est un acronyme … Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation

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25 Lumière monochromatique Lumière généralement monochromatique (longueur donde unique) au contraire dautres sources lumineuses (soleil & ampoules) Lumière généralement monochromatique (longueur donde unique) au contraire dautres sources lumineuses (soleil & ampoules) Lumière émise dans lUV, le visible, et linfrarouge Lumière émise dans lUV, le visible, et linfrarouge Certains lasers émettent plusieurs longueurs dondes. Certains lasers émettent plusieurs longueurs dondes.

26 Irradiation par LASER Brûlures (le plus généralement) … À lexception de quelques situations particulières les brûlures de la peau sont moins graves que celles de loeil

27 Collimation (Parallélisme) de la lumière Photons des Lasers cohérents (« parallèles ») Photons des Lasers cohérents (« parallèles ») Lœil focalise la lumière en un point Lœil focalise la lumière en un point Focalisation des photons risque potentiel pour la rétine Focalisation des photons risque potentiel pour la rétine La lentille de loeil augmente la puissance par unité de surface (W/cm2) de la lumière des LASERS par fois La lentille de loeil augmente la puissance par unité de surface (W/cm2) de la lumière des LASERS par fois

28 Dommages de loeil Thermique Thermique oedème, hémorragie oedème, hémorragie Photochimique (lumière bleue & UV) Photochimique (lumière bleue & UV) Production de toxines & modifications biochimiques inflammation, lésions & opacité Production de toxines & modifications biochimiques inflammation, lésions & opacité Photo-accoustique (impulsions courtes et intenses) Photo-accoustique (impulsions courtes et intenses) explosion induite par lexpansion de gaz explosion induite par lexpansion de gaz

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30 nm > 1400 nm < 400 nm Lentille Cornée Rétine Comment les lasers ciblent les différentes structures de loeil

31 Risques majeurs sur la rétine Lumière Laser entre nm (risque pour la rétine) intensifiée par X par leffet lentille de loeil. Lumière Laser entre nm (risque pour la rétine) intensifiée par X par leffet lentille de loeil. Focalisation sur la macula, la région la plus sensible et la plus importante de la rétine. Focalisation sur la macula, la région la plus sensible et la plus importante de la rétine. Cécité partielle (lumière directe ou réflexion). Cécité partielle (lumière directe ou réflexion).

32 Exemple –Laser Argon = 488 nm et 514 nm (visible) = 488 nm et 514 nm (visible) Laser continu Laser continu Puissance de sortie = 700 mW Puissance de sortie = 700 mW Classe 4 Classe 4 Organe ciblé: rétine Organe ciblé: rétine Dommage: thermique Dommage: thermique

33 Exemples de dommages induits par Laser Source: Laser-Professionals.com Brûlure sur rétine

34 Résumé des longueurs donde à risque pour les structures de loeil UVCUVBUVAVISIBLEIRAIRBIRC Rétine Lentille Cornée Photochimique Thermique Lentille Cornée

35 Most cytometer lasers are Class I with coverings & interlocks operative

36 Classement des Lasers ClasseDescription Puissance (mW) Lasers continus, Visibles ( µm) I Pas de danger < 0.5 II Danger si longue exposition 0.5 – 1.0 III Dangereux par lumière directe & réflexion IIIaIdem 1.0 – 5.0 IIIbIdem 5.0 – IVidem > 500.0

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41 Exemple de lasers sur cytomètres analyseurs-trieurs DAKO MoFlo Laser Options Solid-State Lasers Solid-State Lasers 635nm, 25mW diode 635nm, 25mW diode 488nm, 200 mW diode 488nm, 200 mW diode Air-Cooled Laser Air-Cooled Laser Melles Griot HeNe 25mW, LHP 928 Melles Griot HeNe 25mW, LHP 928 Water-Cooled Lasers from Coherent® Water-Cooled Lasers from Coherent® Enterprise II 621, UV Enterprise II 621, UV Innova 70-2W, Argon Innova 70-2W, Argon Innova 70-3W, Argon Innova 70-3W, Argon Innova 70-4W, Argon Innova 70-4W, Argon Innova 70-5W + UV, Argon Innova 70-5W + UV, Argon Innova 70-5W, Argon Innova 70-5W, Argon Innova 70K, Krypton Innova 70K, Krypton Innova 70-Spec, Argon Innova 70-Spec, Argon Innova 70-Spec + UV Innova 70-Spec + UV Innova 90C-3W Innova 90C-3W Innova 90C-4W Innova 90C-4W Innova 90C-4W + UV Innova 90C-4W + UV Innova 90C-5W Innova 90C-5W Innova 90C-5W + UV Innova 90C-5W + UV Innova 90C-6W Innova 90C-6W Innova 90C-6W +UV Innova 90C-6W +UV Innova 90C-K, Krypton Innova 90C-K, Krypton Innova W Krypton + UV Innova W Krypton + UV Innova 304-4W, Argon Innova 304-4W, Argon Innova 305-5W, Argon Innova 305-5W, Argon Innova UV Innova UV Innova 306-6W, Argon Innova 306-6W, Argon Source: Source: Cytopeia inFlux V-GS Laser Options Solid-State Lasers Solid-State Lasers UV 355nm UV 355nm Violet 408nm Violet 408nm Violet-Blue 479nm Violet-Blue 479nm Blue-488nm Blue-488nm Green-531nm Green-531nm Red-635nm Red-635nm Red-647nm Red-647nm Coherent Water-Cooled 70, 90, 300 series lasers Coherent Water-Cooled 70, 90, 300 series lasers

42 Autres risques LASER Choc électrique (voltage élevé Choc électrique (voltage élevé Exposition chimique Exposition chimique Matériel cryogénique Matériel cryogénique Gaz comprimé Gaz comprimé Explosions Explosions Contamination de lair Contamination de lair …


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