A. AIGLE, M. BARTOLOME et C. RIBEREAU M1 BEM, UE 227 FLUC

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1 A. AIGLE, M. BARTOLOME et C. RIBEREAU M1 BEM, UE 227 FLUC
Coral bleaching under thermal stress: putative involvement of host/symbiont recognition mechanisms D’après Jeremie Vidal-Dupiol et al., 2009 A. AIGLE, M. BARTOLOME et C. RIBEREAU M1 BEM, UE 227 FLUC Pocillopora damicornis

2 Biodiversité et complexité écologique Haute production primaire
Matériels et Méthodes Introduction Résultats Résultats Discussion Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Récifs coralliens : Biodiversité et complexité écologique Haute production primaire Valeur écologique et économique considérable blog-ecologie.fr 3 dernières décennies : augmentation de la fréquence et de l’amplitude de ces perturbations : naturelles + anthropiques  Réchauffement climatique  Blanchiment des coraux  Forte mortalité maxisciences.com Ex: 1998, mort de 16% des coraux du monde

3 Cause = stress environnementaux : augmentation anormale des
Matériels et Méthodes Introduction Résultats Résultats Discussion Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Cause = stress environnementaux : augmentation anormale des températures + forte irradiance solaire. Origine physiologique : Rupture de la symbiose mutualiste phototrophe entre l’hôte (scléractiniaire) et l’endosymbionte (dinoflagellé) Au niveau moléculaire : 1er effet = photoinhibition  surproduction de ROS (toxiques)  perte du symbionte par : nécrose et apoptose digestion in situ du symbionte par l’hôte exocytose / « pincement » détachement de la cellule hôte Nombreuses études pour tenter de comprendre les mécanismes moléculaires de réponse au stress.

4 Matériels et Méthodes Introduction Résultats Discussion Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Objectif : Identifier les gènes intervenant dans les 1ères étapes du stress thermique (avant le blanchiment) à l’origine de l’arrêt de la symbiose  biomarqueurs de la « santé » des coraux.

5 Matériel biologique utilisé et protocole de stress thermique
Matériels et Méthodes Introduction Résultats Discussion Conclusion Matériel biologique utilisé et protocole de stress thermique Espèce étudiée : Pocillopora damicornis. 46 nubbins répartis en deux groupes (stressé et contrôle) + acclimatation à 28°C.  Mise en place du protocole de stress thermique déclenchant in situ un blanchiment de masse.  Lombok Carte de l’Indonésie et localisation du site de prélèvement. Photo d’un groupe de nubbins (expérience de thermotolérance). Schéma du protocole de stress thermique.

6 Matériels et Méthodes Introduction Résultats Résultats Discussion
Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion EXPERIENCES REALISEES ET BUTS : Expérience de suivi du blanchiment : Déterminer à quel moment s’effectue la rupture de symbiose. (2) Hybridation soustractive suppressive : Construction de banques d’ADNc induisant / réprimant le blanchiment. (3) Séquençage EST + analyses BLASTX et BLASTN : Sélection et caractérisation des gènes d’intérêt. (4) Q-RT-PCR : Déterminer, à différents stades du stress thermique, la quantité de transcrits pour les gènes d’intérêt. (5) RACE-PCR (rapid amplification of cDNA ends) : Caractériser l’ORF (extrémité 3’ et 5’ des ADNc) des ADNc candidats dans le but de construire les amorces spécifiques des gènes correspondants. (6) PCR croisées sur l’holobionte (hôte + symbionte) et deux espèces de Symbiodinium en culture pure : Déterminer quel organisme (hôte ou symbionte) exprime les gènes candidats. (7) Expériences d’immunolocalisation : Déterminer la zone d’expression, chez Pocillopora damicornis, des gènes candidats.

7 Densité de Symbiodinium spp pendant une période de stress.
Matériels et Méthodes Introduction Résultats Discussion Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Suivi du blanchiment : Stressé Contrôle 15 j : début du blanchiment pas de blanchiment 18j : blanchiment total Lot stressé Lot contrôle Diminution de 79,9% Arrêt de la symbiose Densité de Symbiodinium spp pendant une période de stress.

8 PdC-Lectin : domaine DC SIGN: lectines de type C
Matériels et Méthodes Introduction Résultats Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion 2 gènes spécifiques trouvés : appartiennent à la classe fonctionnelle cellule / cellule ou cellule / ligand. Pdcyst-rich : similarité avec des protéines impliquées dans l’adhésion cellulaire.  Domaine fonctionnel connu (motif cystéine)  Protéine fonctionnelle ?  similarités avec Nematostella vectensis PdC-Lectin : domaine DC SIGN: lectines de type C Domaine fonctionnel connu (protéines extracellulaires des Métazoaires (CTLD)) Protéine fonctionnelle ?  Similarités avec la protéine Millectine (Acropora millepora). Reconnaissance et liaison avec des mannoses Ca²⁺ dépendantes ?  Exclusivement chez le scléractiniaire

9 Suivi du taux d’expression
Matériels et Méthodes Introduction Résultats Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Suivi du taux d’expression Diminution de la transcription Densité de symbiontes Pdcyst-rich PdC-Lectin Taux de transcription de PdC-Lectin et Pdcyst-rich en parallèle avec l’indicateur classique du blanchiment

10 Matériels et Méthodes Introduction Résultats Discussion Discussion
Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Schéma général de l’anatomie de P. damicornis. Schéma d’une coupe histologique au niveau des polypes de P. damicornis Immuno-marquage de PdC-Lectin au niveau des cellules endodermales du tissu oral des polypes.

11 Matériels et Méthodes Introduction Résultats Discussion Discussion
Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Schéma général de l’anatomie de P. damicornis. Schéma d’une coupe histologique du coenosarc chez P. damicornis Immuno-marquage de Pdcyst-rich dans les cellules calicoblatsiques

12 Matériels et Méthodes Introduction Résultats Discussion Discussion Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Originalité de cette étude : conditions « naturelles » (amplitude et rapidité de l’augmentation des températures). 2 gènes isolés : Down regulation Pdcyst-rich Problème : domaine fonctionnel commun à un grand nombre de protéines  différentes fonctions. Expression + stockage : ectoderme calicoblastique. HYPOTHESE : Rôle possible dans les processus de minéralisation et de calcification ? Concordance entre les effets du stress (arrêt de croissance et calcification) et la diminution de la transcription. Étude récente chez Montastraea faveolata.

13 Matériels et Méthodes Introduction Résultats Discussion Discussion Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion PdC-Lectin Alignement + analyse structurale  valide la fonction de PdC-Lectin : reconnaissance et liaison de mannose Ca²⁺ dépendantes. HYPOTHESE : Rôle dans l’acquisition et la séquestration du symbionte Plusieurs travaux sur les lectines (Acropora millepora, Laxus oneistu, Fungia scutaria) tendent à valider cette hypothèse. Zone d’expression : endoderme en contact avec les symbiontes + interface hôte / symbionte Recrutement et acquisition par interaction avec les ligands mannose du symbionte ?

14 Matériels et Méthodes Introduction Résultats Discussion Conclusion Obtention d’un biomarqueur fonctionnel de stress thermique : évaluer la santé des colonies. Mise en évidence d’un nouveau mécanisme hypothétique du blanchiment = diminution de la séquestration et de l’acquisition des Symbiodinium.

15 Matériels et Méthodes Introduction Résultats Discussion Conclusion Autre étude : blanchiment = réponse immunitaire innée de l’hôte contre les symbiontes (suite à la production de ROS)  exocytose + apoptose. Millectine : rôle dans la réponse immunitaire innée + séquestration des Symbiodinium (Kvennefors ECE et al., 2008). CTLD invertébrés : première structure de la reconnaissance du non soi + défense humorale (Alex N. Zelensky and Jill E. Gready, 2005) + acquisition / séquestration des Symbiodinium (Jeremie Vidal-Dupiol et al., 2009). Remarques : Vocabulaire : ‘zooxanthelle’ Discussion PdC-Lectin : emballement ? Rôle du symbionte ? Relation mutualiste

16 Bibliographie J. Vidal-Dupiol, M. Adjeroud, E. Roger, L. Foure, D. Duval, Y. Mone, C. Ferrier-Pages, E. Tambutte, S. Tambutte, D. Zoccola, D. Allemand, G. Mitta, 4/08/2009, Coral bleaching under thermal stress: putative involvement of host/symbiont recognition mechanisms, BMC Physiology 9:14. Alex N Zelensky1 and Jill E Gready, Août 2004, C-type lectin-like domains in Fugu rubripes. BMC Genomics. Alex N. Zelensky and Jill E. Gread, Octobre 2005, The C-type lectin-like domain superfamil. FEBS Journal. Charneau Sébastien, Janvier 2005, Approches moléculaires des mécanismes mis en jeu en fin de schizogonie intraérythrocytaire de Plasmodium falciparum (agent du paludisme) par Hybridation soustractive suppressive et Puce à ADN (Matériel et méthodes). E.C.E. Kvenneforsa, W. Leggata,c, O. Hoegh-Guldberga, B.M. Degnanb, A.C. Barnesa, 11/06/2008, An ancient and variable mannose-binding lectin from the coral Acropora millepora binds both pathogens and symbionts, Developmental and Comparative Immunology (2008) 32, 1582–1592. Kvennefors, E. Charlotte E., Leggat, William, Kerr, Caroline C., Ainsworth, Tracy D., Hoegh-Guldberg, Ove, and Barnes, Andrew C. (2010) Analysis of evolutionarily conserved innate immune components in coral links immunity and symbiosis. Developmental and Comparative Immunology, 34 (11). pp ISSN S. Bulgheresi, I. Schabussova, T. Chen, N.P. Mullin, R.M. Maizels, J. A. Ott, Avril 2006, A New C-Type Lectin Similar to the Human Immunoreceptor DC-SIGN mediates Symbiont Acquisition by a Marine Nematode, Envir. Microbiology p. 2950–2956 Vol. 72, No. 4. V.M. Weis, Cellular mechanisms of Cnidarian bleaching: stress causes the collapse of symbiosis, 6/08/2008, The Journal of Experimental Biology 211, Vimal Julien, mai 2007, Physiopathologie des coraux.

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18 Matériels et Méthodes Introduction Résultats Résultats Discussion
Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Schémas x : Schémas de présentation de la technique SSH (Supression Subtractive Hybridisation)

19 Matériels et Méthodes Introduction Résultats Résultats Discussion
Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Schémas x (suite) : Schémas de présentation de la technique SSH (Supression Subtractive Hybridisation)

20 (9) Seconde PCR suppressive : utilisation des amorces imbriquées
Matériels et Méthodes Introduction Résultats Résultats Discussion Discussion Discussion Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion Schémas x (suite) : Schémas de présentation de la technique SSH, résultats de la première PCR suppressive. (9) Seconde PCR suppressive : utilisation des amorces imbriquées Augmentation de la concentration en séquences différentielles (e). Diminution de l’enrichissement en séquences de base (b). (10) Clonage des produits PCR et construction de quatre banques d’ADNc BIG : gène induisant le blanchiment (x2). BRG : gène réprimant le blanchiment (x2).