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Caractérisation structurale d un régulateur transcriptionnel du « Quorum Sensing » chez Brucella abortus.

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1 Caractérisation structurale d un régulateur transcriptionnel du « Quorum Sensing » chez Brucella abortus

2 Le « Quorum Sensing » des bactéries Gram - « Le Quorum Sensing est un phénomène par lequel laccumulation dune phéromone de faible poids moléculaire permet à la cellule individuelle de percevoir quand lunité de population minimale ou quorum de bactéries est atteint, pour initier une réponse concertée de lensemble de la population » (Fuqua 1994) Production de lumière chez la bactérie marine Vibrio fischeri Haute densité cellulaire : Autoinduction de la luminescence

3 Quorum Sensing chez Vibrio fischeri Lux I : Lux I : La synthétase de phéromone OHHL : La phéromone ou l autoinducteur OHHL : La phéromone ou l autoinducteur Lux R : Lux R : Le régulateur transcriptionnel activé par OHHL luxR luxI luxCDABE OHHL + Lumière

4 Caractéristiques structurales des régulateurs de la famille LuxR actifs sous forme dun dimère association à la membrane organisés en deux domaines structuraux NC Liaison à la phéromone (HSL) Liaison à l ADN via un motif Hélice-coude-hélice (HTH) problèmes de purificationstructures 3D

5 Brucella abortus, notre organisme d intérêt Coccobacille Gram-négatifCoccobacille Gram-négatif Pathogène intracellulairePathogène intracellulaire Provoque une zoonose qui atteint quelquefois l hommeProvoque une zoonose qui atteint quelquefois l homme Un système de « Quorum Sensing » a récemment été identifié chez cette bactérie et le régulateur transcriptionnel correspondant a été nommé BabR. Cest un homologue de LuxR (25% d identité selon l alignement donné par ALIGN).

6 OBJECTIF Caractériser structuralement le régulateur transcriptionnel BabR de Brucella abortus à laide doutils bioinformatiques. Les différentes étapes suivies:.Obtenir la topologie de BabR et de ses homologues les plus proches.Obtenir un modèle 3D du domaine C-terminal de BabR pour pouvoir analyser plus en détail le motif HTH..Obtenir le plus dinformations structurales possibles sur le domaine N-terminal de BabR

7 Obtention de la topologie de BabR et de ses homologues 1

8 BabR Séquence complète Recherche de séquences similaires (BLAST) Sélection des homologues les plus similaires ( E-value < à 0,01) > à 30% d identité* avec BabR > à 30% d identité* avec BabR + LuxR (prot.réf.) Alignement multiple (Match-Box,ClustalW) * pourcentage d identité déterminé par ALIGN Alignement multiple (Match-Box,ClustalW) Alignement multiple (Match-Box,ClustalW) Toutes les séquences

9 > à 30% d identité avec BabR + LuxR (prot.réf.) Méthodes de prédictions de structures secondaires pour déterminer la topologie de BabR et des différents homologues ( PHD, PSIpred, PREDATOR, JPRED,PROF) CONSENSUS des méthodes de prédictions de structures secondaires

10 Méthode utilisée pour réaliser le consensus Score PHD Score PSIPRED

11 Consensus des différentes méthodes pour les 11 séquences (BabR et ses homologues ( en moyenne 240 a.a.)) N C Dom. N-termDom. C-term HELICE BRIN BabR LuxR HOMOL.

12 Obtention du modèle 3D du domaine C-terminal de BabR et analyse plus détaillée du HTH 2

13 Domaine C-Terminal de BabR Recherche d homologues dans la banque de structures PDB 1 résultat significatif: NarL (E-value=0,077) Reconnaissance de « Fold » (3DPSSM, THREADER 2.5, TOPITS, GENTHREADER, PSI-BLAST BORK) 1 résultat significatif (4 méthodes sur 5): NarL

14 Détermination dun consensus des alignements BabR-NarL fournis par différentes méthodes : Alignements séquence-séquence Alignements séquence-structure ALIGNEMENT SEQUENCE-STRUCTURE OPTIMAL : 61 derniers résidus de BabR alignés de façon certaine avec NarL (dom. Cterm) Les autres résidus: lien flexible et donc alignement incertain

15 Alignment BabR Cterm.-NarL final

16 Le modèle du domaine C-terminal de BabR

17 Caractérisation plus détaillée du HTH 1. Analyse de 4 complexes ADN-protéine : -répresseur -répresseur LexA -répresseur P22 -répresseur Cro Détermination des résidus de chaque HTH interagissant de manière spécifique avec l ADN Visualisation des ponts H entre le HTH et les bases nucléotidiques de chaque complexe

18 COMPLEXE HTH-ADN (1QAA)

19 Détermination des résidus interagissant de manière spécifique avec l ADN

20 Asn 215 His 212 Thr 208 Ser Extrapolation au domaine HTH de BabR (d après l analyse HTH-ADN et l alignement avec LuxR)

21 Caractérisation structurale du domaine N-terminal de BabR 3

22 Domaine N-Terminal de BabR Recherche de séquences similaires (BLAST): Aucun résultat significatif Reconnaissance de « Fold » (3DPSSM, THREADER 2.5, TOPITS, GENTHREADER, PSI-BLAST BORK) Pas de structure mais 1 topologie donnée par plusieurs méthodes : Le « Rossman Fold »

23 Modèle topologique d une protéine de type « Rossman fold »

24 Structure 3D d une protéine adoptant une topologie de « Rossman fold »

25 Modèle topologique du domaine N-term. de BabR L alignement BabR-LuxR permet de définir sur la topologie les résidus importants dans la liaison à l HSL et donc de localiser la région de liaison.

26 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES But dun modèle = générer des hypothèses testables au laboratoire Nous avons généré des hypothèses pour le domaine N- terminal et pour le domaine C-terminal. Nous avons pu caractériser structuralement une protéine de la famille LuxR. Des résidus ont été prédits comme importants, soit dans la liaison à l ADN soit à la phéromone; ils pourront donc être testés par des expériences de mutagenèse dirigée.


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