Bioinformatique et Biologie Structurale

Présentation au sujet: "Bioinformatique et Biologie Structurale"— Transcription de la présentation:

1 Bioinformatique et Biologie Structurale
I/ – Principes et techniques A/ L’information structurale B/ Les différentes techniques de détermination de structure C/ Les nouveaux challenges de la biologie structurale II/ – Application à l’étude d’enzymes d’intérêt médical A/ Un bref aperçu de ce que l’on appelle « Drug design » B/ Recherche d’inhibiteurs d’aminopeptidases de Streptocoques C/ Relations structure-fonction d’hélicases impliquées dans les cancers

2 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ
Activité hélicase Il en existe de 2 types : les ADN-hélicases et les ARN-hélicases Les ADN-hélicases sont des enzymes qui déroulent l'hélice d'ADN en 2 brins, permettant ainsi la replication et la transcription de l'ADN Ces dernières années, nos effort ont porté sur la biochimie et l’enzymologie de ces molécules. Nous avons obtenus nombre de résultats intéressants. Ainsi nous avons élucidé la structure quaternaire de l’hélicase RecQ de E.coli, montrant que celle-ci fonctionne en monomère. Nous avons également étudié les propriétés de fixation de l’ADN. Nous avons trouvé que certaines hélicases (E. Coli) étaient capable de changer brusquement de direction dans leur parcours du brin d’ADN. Enfin, nous avons trouvé récemment que le doigt de zinc joue un rôle crucial dans la fixation de l’ADN mais aussi dans le repliement de la protéine. DNA helicase activity

3 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ
Fonctionnement d’une ADN-hélicase Les ADN-hélicases sont des protéines ubiquitaires agissant comme des moteurs moléculaires qui exploitent l’énergie libre fournie par l’hydrolyse de l’ATP pour catalyser la séparation des duplexes d’ADN énergétiquement stables. On trouve les hélicases chez les procaryotes comme chez les eucaryotes, incluant les virus et les bactériophages. Ces enzymes rompent les liaisons hydrogène entre les deux brins de l’hélice et se déplacent selon une seule direction sur le brin auquel elles sont liées. Toutes les hélicases sont aussi des translocases et des ATPases ADN-dépendantes. Ces dernières années, nos effort ont porté sur la biochimie et l’enzymologie de ces molécules. Nous avons obtenus nombre de résultats intéressants. Ainsi nous avons élucidé la structure quaternaire de l’hélicase RecQ de E.coli, montrant que celle-ci fonctionne en monomère. Nous avons également étudié les propriétés de fixation de l’ADN. Nous avons trouvé que certaines hélicases (E. Coli) étaient capable de changer brusquement de direction dans leur parcours du brin d’ADN. Enfin, nous avons trouvé récemment que le doigt de zinc joue un rôle crucial dans la fixation de l’ADN mais aussi dans le repliement de la protéine.

4 Les hélicases sont essentielles à la vie cellulaire et contribuent à la stabilité génomique

5 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ
ADN-Hélicases répertoriées Since the discovery of the first DNA helicase in Escherichia coli in 1976, and the first eukaryotic one in the lily in 1978, a large number of these enzymes have been isolated from both prokaryotic and eukaryotic systems, and the number is still growing. Most contain conserved helicase motifs that act as an engine to power DNA unwinding. All DNA helicases share some common properties, including nucleic acid binding, NTP binding and hydrolysis, and unwinding of duplex DNA in the 3' to 5' or 5' to 3' direction. humain E. coli Qu’est-ce qu’une hélicase? Une hélicase est une enzyme spécialisée pour désappareiller la double hélice de l’DNA en simple brin de l’ADN dans la cellule. La disponibilité du simple brin d’ADN est absolument requise dans le métabolisme de l’ADN, telle que la réplication, la réparation, la recombinaison ou encore le maintien du telomère.

6 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ
RecQ Family Les hélicases de la famille RecQ sont hautement conservées de la bactérie à l’homme et sont requises dans le maintien de l’intégrité du génome. Elle sont impliquées dans diverses troubles génétiques humains. On a répertorié 5 hélicases de la famille RecQ chez l’homme : RECQL, WRN, BLM, RECQL4, et RECQL5. Les hélicases de la famille RecQ ont été ainsi désignées d’après leur homologies avec l’hélicases de E. coli et partagent des voies de recombinaison similaires. Toutes hélicases RecQ ont des domaines conservés. Ces dernières années, nos effort ont porté sur la biochimie et l’enzymologie de ces molécules. Nous avons obtenus nombre de résultats intéressants. Ainsi nous avons élucidé la structure quaternaire de l’hélicase RecQ de E.coli, montrant que celle-ci fonctionne en monomère. Nous avons également étudié les propriétés de fixation de l’ADN. Nous avons trouvé que certaines hélicases (E. Coli) étaient capable de changer brusquement de direction dans leur parcours du brin d’ADN. Enfin, nous avons trouvé récemment que le doigt de zinc joue un rôle crucial dans la fixation de l’ADN mais aussi dans le repliement de la protéine.

7 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ
Des mutations apparaissant dans WRN et RECQ4 sont à l’origine, respectivement, des syndromes de Werner et de Rothmund-Thomson. Ces 2 maladies, tout comme le syndrome de Bloom, augmentent la prédisposition individuelle au cancer. Chaque maladie est caractérisée par une instabilité génétique, un cancer, et : Syndrome de Bloom Hair loss/graying - Cataracts - Subcutaneous fat loss - Osteoporosis - Arteriosclerosis - Diabetes mellitus Syndrome de Werner - vieillissement prématuré Sparse hair - Poikiloderma - Short stature - Cataracts - Skeletal defects Syndrome de Rothmund-Thompson Short stature - Immunodeficiency – Photosensitivity - Diabetes mellitus - Male sterility

8 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ
Possibles rôles de WRN dans la cellule Clearing the path for DNA replication G-rich regions at telomere, rDNA clusters and d(CGG)n repeats. WRN WRN WRN WRN unravels G4 DNA G4 DNA impede fork movement Replication goes on

9 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ
La protéine du Syndrome de Werner impliquée dans le métabolisme du télomère

10 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ
La technique de la molécule unique révèle les propriétés spécifiques des hélicases de la famille RecQ L’hélicase RecQ fonctionne en tant que monomère Exemple de moteur moléculaire Propriétés de fixation de l’ADN Parcours de l’ADN avec changement de direction Ces dernières années, nos effort ont porté sur la biochimie et l’enzymologie de ces molécules. Nous avons obtenus nombre de résultats intéressants. Ainsi nous avons élucidé la structure quaternaire de l’hélicase RecQ de E.coli, montrant que celle-ci fonctionne en monomère. Nous avons également étudié les propriétés de fixation de l’ADN. Nous avons trouvé que certaines hélicases (E. Coli) étaient capable de changer brusquement de direction dans leur parcours du brin d’ADN. Enfin, nous avons trouvé récemment que le doigt de zinc joue un rôle crucial dans la fixation de l’ADN mais aussi dans le repliement de la protéine.

11 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ
Vue d’ensemble Un thématique de recherche axé sur l’étude des relations structure-fonction d’enzymes impliquées dans la régulation du génome et certains cancers Biologie Moléculaire Biochimie Enzymologie Bioinformatique Radiocristallographie Physique - Molécule unique Des expertises complémentaires Dans le cadre du regroupement des équipes sous 3 thématiques, notre projet de recherche axé sur l’étude des relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ , sera associé à la constitution d’une équipe réunissant nos expertises. Elle a l’ambition d’utiliser le maximum de techniques pour résoudre un problème biologique. Ainsi, la cristallographie des protéines complétera les expertises déjà présentent dans l'équipe en biochimie, enzymologie et biologie moléculaire. Cette équipe s’insérera dans le groupe thématique Génome et intégrité du génome conduit par Jean-François MOUSCADET.

12 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ
Bernstein, D. A., Zittel, M. C., and Keck, J. L. (2003) EMBO J. 22, Structure 3D RecQ E. Coli Liaison à l’ADN ATPase Une enzyme multifonctionnelle Hélicase - désappariement - association dble brin Fonction très conservée dans l'évolution Domaine hélicase Les hélicases se fixent sur l’ADN, puis s’avancent sur la molécule pour finalement séparer son double brin en simple brin. L'énergie qu'elle utilise est fournie par l'hydrolyse de l'ATP. De ce point de vue, une hélicase fonctionne comme un nano-moteur moléculaire qui transforme l’énergie chimique en l’énergie mécanique. Cette molécule est ainsi intéressante autant pour les biologistes que pour les physiciens.

13 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ
Fonction très conservée dans l'évolution Les hélicases se fixent sur l’ADN, puis s’avancent sur la molécule pour finalement séparer son double brin en simple brin. L'énergie qu'elle utilise est fournie par l'hydrolyse de l'ATP. De ce point de vue, une hélicase fonctionne comme un nano-moteur moléculaire qui transforme l’énergie chimique en l’énergie mécanique. Cette molécule est ainsi intéressante autant pour les biologistes que pour les physiciens.

14 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ
Une Enzyme conservée à travers l’évolution Le motif en doigt de zinc est un domaine particulièrement bien conservé chez les hélicases de la famille de RecQ. Nous avons ainsi récemment modélisé le motif en doigt de zinc de la protéine de Bloom. Deux mutations, identifiées chez les patients présentant le syndrome de Bloom, correspondent à la position de C1 et C2 sur ce modèle. Ces études permettent d'élucider les premières bases moléculaires de cette maladie. Nous voudrions savoir si les cystéines du doigt de zinc sont directement impliquées dans la fixation de l'ADN. J'ai produit en quantité intéressante ce domaine qui est soluble, ce qui peut également permettre son étude par RMN et tout particulièrement en ce qui concerne ses propriétés de fixation à l'ADN. Nous sommes donc très attachés à travailler avec les RMNistes sur ce projet. Les aspects de partenariat avec une autre protéine qui soit associé dans le repliement 3D de la protéine. Etude de complexes déjà d'un point de vue biologique. 36 % identité ; 52 % similitudes (Alignement des séquences humaine (WRN) et bactérienne (E. coli) réalisé avec CLUSTALW)

15 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ
Modélisation moléculaire de la protéine du Syndrome de Bloom 4 domaines bioinformatique structurale Modélisation par homologie (MODELLER) Information structurale d'origine : RecQ E. coli Alignement de séquences : CLUSTALW Guo, R.B., Rigolet, P., Zargarian, L., Fermandjian, S. and Xi, X.G. (2005). Nucleic Acids Res. 33,

16 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ
Etude de mutants : le doigt de zinc contrôle toutes les fonctions de l’enzyme BLM E. coli Liu, J.L., Rigolet, P., Dou, S.X.,Wang, P.Y. and Xi, X.G. (2004). J Biol Chem. 279; Guo, R.B., Rigolet, P., Zargarian, L., Fermandjian, S. and Xi, X.G. (2005). Nucleic Acids Res. 33,

17 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ
Mesure de l'activité de séparation des double brins d'ADN Les hélicases se fixent sur l’ADN, puis s’avancent sur la molécule pour finalement séparer son double brin en simple brin. L'énergie qu'elle utilise est fournie par l'hydrolyse de l'ATP. De ce point de vue, une hélicase fonctionne comme un nano-moteur moléculaire qui transforme l’énergie chimique en l’énergie mécanique. Cette molécule est ainsi intéressante autant pour les biologistes que pour les physiciens. 32 P (B)

18 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ
Isoformes et domaines du doigt de zinc Isoforms RecQ5β RecQ5α dRecQ5a RecQ5γ dRecQ5b dRecQ5c 410 aa 435 aa 468 aa 991 aa 1057 aa 470 aa Helicase core Zn Finger C-terminal extension Helicase activity No yes Not determined

19 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ
Mutations répertoriés Qu’est-ce qu’une hélicase? Une hélicase est une enzyme spécialisée pour désappareiller la double hélice de l’DNA en simple brin de l’ADN dans la cellule. La disponibilité du simple brin d’ADN est absolument requise dans le métabolisme de l’ADN, telle que la réplication, la réparation, la recombinaison ou encore le maintien du telomère.

20 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ
Etude in vitro et in vivo de mutations associées à des cancer Etude in vitro et in vivo des conséquences structurales et fonctionnelles de mutations observées chez des malades atteints du Syndrome de Bloom Mutagenèse dirigée Enregistrement systématique des données Banque de données

21 Relations structure-fonction des hélicases de la famille de RecQ
Etude structurale des hélicases BLM, WRN et RECQL5 Bases moléculaires du fonctionnement de l’enzyme sites de fixation à l’ADN domaines impliqués modélisation des mouvements du moteur moléculaire Enzymes seules complexées à l’ADN Essais de différents ligands de petite taille (inférieure à 20 pdb) simple brin double brin hétéroduplex TRANSPARENT 4 Je me suis donc tourné vers une autre technique : la fluorescence Résolue en tempsCette méthode permet d’obtenir des renseignements sur l’environnement local des chromophores et sur la variabilité de la structure qui entoure ces chromophores. Elle peut aussi apporter des renseignements sur la dynamique conformationnelle interne et sur l’assemblage des macromolécules. En introduisant un résidu tryptophane par mutagenèse dirigée dans une région dont la structure est très sensible à la fixation du substrat (boucle 240) et à l'interface entre les sous unités régulatrices et catalytiques (r-c), nous avons été capables de voir des changements de structure très fin. L’utilisation de la fluorescence résolue en temps sur l’ATCase m’a donné envie de rejoindre JC Brochon pour exploiter au mieux cette technique. Avant de le rejoindre je suis parti chez G. Weber aux USA, spécialiste en fluorescence pour me perfectionner. Nouveau protocole de purification construction sans HIS-Tag Nouvelle technique de cristallisation : microfluidique méthode semi automatique économie de matériel biologique très grand nombre d’essais

22 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ
Autres projets Relations avec le télomère S3D enzyme complexé à un motif du télomère Spécificité vis-à-vis de certains substrats Effet des métaux autre que zinc Etude de RIG I, un autre membre la famille RecQ [leucémie aiguë]

23 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ
Cancer et vieillissement prématuré Xu Guang Xi [CR1] Pascal Rigolet [MCF] Sophia Guo [Doctorante] Collaborations O. MAUFFRET et S. FERMANDJIAN Structure des Acides Nucléiques et Peptides (Institut G. ROUSSY) Etude en solution du doigt de zinc de BLM en complexe avec l'ADN V. CROQUETTE et D. BENSIMON Laboratoire de physique statistique – département de biologie (ENS PARIS) Etude des propriétés de RecQ par la technique de molécule unique Thierry BIZEBARD LBPC – Paris Chen YONG Laboratoire de microfluidique – département de chimie (ENS PARIS) L'équipe est actuellement composée de quatre personnes dont deux thésards outre Pascal et moi même. Nous ambitionnons d'accueillir très prochainement un étudiant en Master d'ingénierie des protéines et un post doc européen.

24 Biologie-Physique-Chimie
COLLABORATIONS et FINANCEMENT VA. Bohr NIH USA F. Müller Roche Suisse G. Zocchi California USA M.Amor-Gueret Institut Curie Orsay JC. Brochon E. deprez Fluorescence R.Pansu ENS V. Croquette D. Bension Paris Z. Chen Shanghai Chine M. Le Bret Dynamique P. Tauc Imagerie IFR d’Alembert Biologie-Physique-Chimie Programme PCV CNRS Ligue contre le cancer