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Bioinformatique et Biologie Structurale I/ – Principes et techniques A/ Linformation structurale B/ Les différentes techniques de détermination de structure.

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Présentation au sujet: "Bioinformatique et Biologie Structurale I/ – Principes et techniques A/ Linformation structurale B/ Les différentes techniques de détermination de structure."— Transcription de la présentation:

1 Bioinformatique et Biologie Structurale I/ – Principes et techniques A/ Linformation structurale B/ Les différentes techniques de détermination de structure C/ Les nouveaux challenges de la biologie structurale II/ – Application à létude denzymes dintérêt médical A/ Un bref aperçu de ce que lon appelle « Drug design » B/ Recherche dinhibiteurs daminopeptidases de Streptocoques C/ Relations structure-fonction dhélicases impliquées dans les cancers

2 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ –Il en existe de 2 types : les ADN-hélicases et les ARN-hélicases –Les ADN-hélicases sont des enzymes qui déroulent l'hélice d'ADN en 2 brins, permettant ainsi la replication et la transcription de l'ADN Activité hélicase DNA helicase activity

3 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Les ADN-hélicases sont des protéines ubiquitaires agissant comme des moteurs moléculaires qui exploitent lénergie libre fournie par lhydrolyse de lATP pour catalyser la séparation des duplexes dADN énergétiquement stables. On trouve les hélicases chez les procaryotes comme chez les eucaryotes, incluant les virus et les bactériophages. Ces enzymes rompent les liaisons hydrogène entre les deux brins de lhélice et se déplacent selon une seule direction sur le brin auquel elles sont liées. Toutes les hélicases sont aussi des translocases et des ATPases ADN-dépendantes. Fonctionnement dune ADN-hélicase

4 Les hélicases sont essentielles à la vie cellulaire et contribuent à la stabilité génomique

5 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ ADN-Hélicases répertoriées humain E. coli Since the discovery of the first DNA helicase in Escherichia coli in 1976, and the first eukaryotic one in the lily in 1978, a large number of these enzymes have been isolated from both prokaryotic and eukaryotic systems, and the number is still growing. Most contain conserved helicase motifs that act as an engine to power DNA unwinding. All DNA helicases share some common properties, including nucleic acid binding, NTP binding and hydrolysis, and unwinding of duplex DNA in the 3' to 5' or 5' to 3' direction.

6 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Les hélicases de la famille RecQ sont hautement conservées de la bactérie à lhomme et sont requises dans le maintien de lintégrité du génome. Elle sont impliquées dans diverses troubles génétiques humains. On a répertorié 5 hélicases de la famille RecQ chez lhomme : RECQL, WRN, BLM, RECQL4, et RECQL5. Les hélicases de la famille RecQ ont été ainsi désignées daprès leur homologies avec lhélicases de E. coli et partagent des voies de recombinaison similaires. Toutes hélicases RecQ ont des domaines conservés. RecQ Family

7 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Syndrome de Bloom Syndrome de Werner - vieillissement prématuré Syndrome de Rothmund-Thompson Chaque maladie est caractérisée par une instabilité génétique, un cancer, et : Des mutations apparaissant dans WRN et RECQ4 sont à lorigine, respectivement, des syndromes de Werner et de Rothmund-Thomson. Ces 2 maladies, tout comme le syndrome de Bloom, augmentent la prédisposition individuelle au cancer. Hair loss/graying - Cataracts - Subcutaneous fat loss - Osteoporosis - Arteriosclerosis - Diabetes mellitus Sparse hair - Poikiloderma - Short stature - Cataracts - Skeletal defects Short stature - Immunodeficiency – Photosensitivity - Diabetes mellitus - Male sterility

8 Clearing the path for DNA replication G-rich regions at telomere, rDNA clusters and d(CGG)n repeats. WRN G4 DNA impede fork movement WRN unravels G4 DNA Replication goes on Possibles rôles de WRN dans la cellule Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ

9 La protéine du Syndrome de Werner impliquée dans le métabolisme du télomère

10 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Lhélicase RecQ fonctionne en tant que monomère Exemple de moteur moléculaire Propriétés de fixation de lADN Parcours de lADN avec changement de direction La technique de la molécule unique révèle les propriétés spécifiques des hélicases de la famille RecQ

11 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Un thématique de recherche axé sur létude des relations structure-fonction denzymes impliquées dans la régulation du génome et certains cancers Vue densemble Biologie Moléculaire Biochimie Enzymologie Bioinformatique Radiocristallographie Physique - Molécule unique Des expertises complémentaires

12 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Fonction très conservée dans l'évolution Domaine hélicase Liaison à lADNATPase Une enzyme multifonctionnelle Hélicase - désappariement - association dble brin Bernstein, D. A., Zittel, M. C., and Keck, J. L. (2003) EMBO J. 22, Structure 3D RecQ E. Coli

13 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Fonction très conservée dans l'évolution

14 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Une Enzyme conservée à travers lévolution (Alignement des séquences humaine (WRN) et bactérienne (E. coli) réalisé avec CLUSTALW) 36 % identité ; 52 % similitudes

15 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Modélisation moléculaire de la protéine du Syndrome de Bloom -Modélisation par homologie (MODELLER) -Information structurale d'origine : RecQ E. coli -Alignement de séquences : CLUSTALW bioinformatique structurale 4 domaines Guo, R.B., Rigolet, P., Zargarian, L., Fermandjian, S. and Xi, X.G. (2005). Nucleic Acids Res. 33,

16 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ BLME. coli Etude de mutants : le doigt de zinc contrôle toutes les fonctions de lenzyme Guo, R.B., Rigolet, P., Zargarian, L., Fermandjian, S. and Xi, X.G. (2005). Nucleic Acids Res. 33, Liu, J.L., Rigolet, P., Dou, S.X.,Wang, P.Y. and Xi, X.G. (2004). J Biol Chem. 279;

17 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Mesure de l'activité de séparation des double brins d'ADN (B) 32 P

18 Isoforms RecQ5β RecQ5α dRecQ5a RecQ5γ dRecQ5b dRecQ5c 410 aa 435 aa 468 aa 991 aa 1057 aa 470 aa Helicase core Zn Finger C-terminal extension Helicase activity No yes Not determined Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Isoformes et domaines du doigt de zinc

19 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Mutations répertoriés

20 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Etude in vitro et in vivo de mutations associées à des cancer -Etude in vitro et in vivo des cons é quences structurales et fonctionnelles de mutations observ é es chez des malades atteints du Syndrome de Bloom -Mutagenèse dirigée -Enregistrement systématique des données Banque de données

21 Relations structure-fonction des hélicases de la famille de RecQ Bases moléculaires du fonctionnement de lenzyme sites de fixation à lADN domaines impliqués modélisation des mouvements du moteur moléculaire Etude structurale des hélicases BLM, WRN et RECQL5 Enzymes seules complexées à lADN Essais de différents ligands de petite taille (inférieure à 20 pdb) simple brin double brin hétéroduplex Nouveau protocole de purification construction sans HIS-Tag Nouvelle technique de cristallisation : microfluidique méthode semi automatique économie de matériel biologique très grand nombre dessais

22 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Relations avec le télomère S3D enzyme complexé à un motif du télomère Spécificité vis-à-vis de certains substrats Effet des métaux autre que zinc Etude de RIG I, un autre membre la famille RecQ [leucémie aiguë] Autres projets

23 Collaborations -O. MAUFFRET et S. FERMANDJIAN Structure des Acides Nucléiques et Peptides (Institut G. ROUSSY) Etude en solution du doigt de zinc de BLM en complexe avec l'ADN -V. CROQUETTE et D. BENSIMON Laboratoire de physique statistique – département de biologie (ENS PARIS) Etude des propriétés de RecQ par la technique de molécule unique -Thierry BIZEBARD LBPC – Paris -Chen YONG Laboratoire de microfluidique – département de chimie (ENS PARIS) Xu Guang Xi[CR1] Pascal Rigolet[MCF] Sophia Guo [Doctorante] Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Cancer et vieillissement prématuré

24 IFR dAlembert Biologie-Physique-Chimie Ligue contre le cancer JC. Brochon E. deprez Fluorescence P. Tauc Imagerie M. Le Bret Dynamique V. Croquette D. Bension Paris R.Pansu ENS F. Müller Roche Suisse G. Zocchi California USA Z. Chen Shanghai Chine Programme PCV CNRS COLLABORATIONS et FINANCEMENT M.Amor-Gueret Institut Curie Orsay VA. Bohr NIH USA


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