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Bi 231: Ingénierie des Protéines cours 1. Plan Général I. Introduction et rappels. II. Purification des protéines. III. Surexpression d'une protéine.

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1 Bi 231: Ingénierie des Protéines cours 1

2 Plan Général I. Introduction et rappels. II. Purification des protéines. III. Surexpression d'une protéine. IV. Mutagenèse: techniques et applications. V. L'insuline : exemple d'une stratégie. VI. Analyse d'articles.

3 I. Introduction et rappels. 11 –Objectifs du module. 12 –Rappels : Propriétés physico-chimiques des protéines (aa, pI, spectre d'absorption), structure II, III et IV des protéines, modifications post-traductionnelles. 13 –Rôles des Protéines in vivo.

4 11 –Objectifs du module : Notions de bases sur : Expression de protéines, Purification, mutagenèse. Pourquoi et comment ?

5 Définitions : Ingénierie des protéines : Ensemble des techniques dexpression et de modifications de protéines recombinantes. Protéines recombinantes : Protéines exprimées à partir dun ADN modifié. Vecteur dexpression : molécule dADN permettant lexpression dune protéine dans un hôte donné. Hôte : Organisme ou type cellulaire où la protéine est exprimée.

6 12 –Rappels : Propiétés physico-chimiques des protéines : Une protéine = polymère dacides aminés. Formule générale : 20 types (cf poly)

7 pI = point isoélectrique = pH où la charge globale dune protéine est nulle. Masse molaire en kiloDalton (kDa ou kD) (1kD= 1000 g.mol -1 ). Autres caractéristiques : - Spectre visible, - IR, - CD, - RMN, - Spectrométrie de masse, - …

8 Modifications post-traductionnelles : Types de modification - Pont disulfure, -Phosphorylation, -Glycosylation -Acylation -Clivage -Biotinylation - … Rôles (a) Régulation de l'activité des protéines (b) Etiquettage : reconnues par des partenaires métaboliques ou systèmes de dégradation (c) ancrer dans une membrane (d) cascades de signalisation (e) adressage (f) définir une identité immunologique

9 Structure des protéines Structure I : séquence = enchaînement linéaire des aa Structure II : repliement daa proches, hélice, feuillet, boucles, non structuré (random coil). Structure III : interactions des structures II entre elles. Structure IV : interactions stables entre plusieurs chaînes polypeptidiques.

10 Rôle des Protéines in vivo Structure Transport Stockage Fixation Catalyseur Mécanique Signalisation Capteur Immunité kératine hemoglobine Ferrétine Enzyme Myosine Hormones Guanylate cyclase anticorps

11 Plan Général I. Introduction et rappels. II. Purification des protéines. III. Surexpression d'une protéine. IV. Mutagenèse: techniques et applications. V. L'insuline : exemple d'une stratégie. VI. Analyse d'articles.

12 II. Purification des protéines. 21 –Buts et objectifs. 22 –Moyens. 23 –Origine de la protéine. 24 –Méthodes de caractérisation.

13 21 –Buts et Objectifs : Expression dune protéine : étudier son fonctionnement, sa structure, … Modification de sa séquence : Conséquences sur son fonctionnement, Facilite sa purification, Ajout dautres caractéristiques (chromophore, épitope => suivit), …

14 22 purification dune protéine Selon : Charge, pI Masse moléculaire Affinité Hydrophobicité/ polarité Volume Electrophorèse,et chromato échangeuse dions chromato échangeuse dions SDS PAGE et masse Chromato daffinité Chromato hydrophobe et phase inversehydrophobephase inverse Tamis moléculaire =gel filtrationgel filtration

15 23 Origine de la protéine Organisme dorigine (Procaryotes, Archea, Eucaryotes / animaux, végétaux, levures) Compartiment cellulaire. toxicité

16 24 Méthodes de caractérisation Identité. Pureté. Séquence. Spectre UV-vis, RMN, IR, Raman, CD,... Tests enzymatiques. Tests daffinité (Biacore). Immunogénéicité....

17 Identification dune protéine. Séparation des peptides par gels 2D, Découpage et extraction, Digestion trypsique, Séparation sur C18 Analyse par spectrométrie de masse Etude d'un protéome dune cellule à un temps t

18 Pureté dune protéine SDS-PAGE, IEF, gel 2D Spectrométrie de masse séquençage


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