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Bi 231: Ingénierie des Protéines

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Présentation au sujet: "Bi 231: Ingénierie des Protéines"— Transcription de la présentation:

1 Bi 231: Ingénierie des Protéines
cours 1

2 Plan Général I. Introduction et rappels.
II. Purification des protéines. III. Surexpression d'une protéine. IV. Mutagenèse: techniques et applications. V. L'insuline : exemple d'une stratégie. VI. Analyse d'articles.

3 I. Introduction et rappels.
11 –Objectifs du module. 12 –Rappels : Propriétés physico-chimiques des protéines (aa, pI, spectre d'absorption), structure II, III et IV des protéines, modifications post-traductionnelles. 13 –Rôles des Protéines in vivo.

4 Expression de protéines,
11 –Objectifs du module : Notions de bases sur : Expression de protéines, Purification, mutagenèse. Pourquoi et comment ?

5 Définitions : Ingénierie des protéines : Ensemble des techniques d’expression et de modifications de protéines recombinantes. Protéines recombinantes : Protéines exprimées à partir d’un ADN modifié. Vecteur d’expression : molécule d’ADN permettant l’expression d’une protéine dans un hôte donné. Hôte : Organisme ou type cellulaire où la protéine est exprimée.

6 Propiétés physico-chimiques des protéines :
12 –Rappels : Propiétés physico-chimiques des protéines : Une protéine = polymère d’acides aminés. Formule générale : 20 types (cf poly)

7 pI = point isoélectrique = pH où la charge globale d’une protéine est nulle.
Masse molaire en kiloDalton (kDa ou kD) (1kD= 1000 g.mol-1). Autres caractéristiques : - Spectre visible, - IR, - CD, - RMN, - Spectrométrie de masse, - …

8 Modifications post-traductionnelles :
Types de modification - Pont disulfure, Phosphorylation, Glycosylation Acylation Clivage Biotinylation Rôles (a) Régulation de l'activité des protéines (b) Etiquettage : reconnues par des partenaires métaboliques ou systèmes de dégradation (c) ancrer dans une membrane (d) cascades de signalisation (e) adressage (f) définir une identité immunologique

9 Structure des protéines
Structure I : séquence = enchaînement linéaire des aa Structure II : repliement d’aa proches, hélice a, feuillet b, boucles, non structuré (random coil). Structure III : interactions des structures II entre elles. Structure IV : interactions stables entre plusieurs chaînes polypeptidiques.

10 Rôle des Protéines in vivo
Structure Transport Stockage Fixation Catalyseur Mécanique Signalisation Capteur Immunité kératine hemoglobine Ferrétine Enzyme Myosine Hormones Guanylate cyclase anticorps

11 Plan Général I. Introduction et rappels.
II. Purification des protéines. III. Surexpression d'une protéine. IV. Mutagenèse: techniques et applications. V. L'insuline : exemple d'une stratégie. VI. Analyse d'articles.

12 II. Purification des protéines.
21 –Buts et objectifs. 22 –Moyens. 23 –Origine de la protéine. 24 –Méthodes de caractérisation.

13 21 –Buts et Objectifs : Expression d’une protéine : étudier son fonctionnement, sa structure, … Modification de sa séquence : Conséquences sur son fonctionnement, Facilite sa purification, Ajout d’autres caractéristiques (chromophore, épitope => suivit),

14 22 purification d’une protéine
Selon : Charge, pI Masse moléculaire Affinité Hydrophobicité/ polarité Volume Electrophorèse,et chromato échangeuse d’ions SDS PAGE et masse Chromato d’affinité Chromato hydrophobe et phase inverse Tamis moléculaire =gel filtration

15 23 Origine de la protéine Organisme d’origine (Procaryotes, Archea, Eucaryotes / animaux, végétaux, levures) Compartiment cellulaire. toxicité

16 24 Méthodes de caractérisation
Identité. Pureté. Séquence. Spectre UV-vis, RMN, IR, Raman, CD, ... Tests enzymatiques. Tests d’affinité (Biacore). Immunogénéicité. ...

17 Identification d’une protéine.
Séparation des peptides par gels 2D, Découpage et extraction, Digestion trypsique, Séparation sur C18 Analyse par spectrométrie de masse  Etude d'un protéome d’une cellule à un temps t

18 Pureté d’une protéine SDS-PAGE, IEF, gel 2D Spectrométrie de masse
séquençage


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