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AEB20111 Marc Bonneu ESTBB 2008 Les approches protéomiques.

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1 AEB20111 Marc Bonneu ESTBB 2008 Les approches protéomiques

2 Plan 1-Séparation des protéines par électrophorèse 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Carte peptidique Séquençage peptidique 3-Quantification des protéines Comparaison gel 2D Marquage isotopique Label Free 4-Caractérisation des protéines Interactions protéine-protéine Modifications post-traductionnelles

3 SDS-PAGE 1-Séparation des protéines par électrophorèse Avantage : toutes les protéines y compris les protéines membranaires Inconvénient : Plusieurs protéines dans la même bande Les petites protéines migrent toutes ensemble au niveau du front de migration

4 Petites protéines emprisonnées dans des micelles de SDS Remplacement de la glycine par un tripeptide de glycine (Tricine) Tris-Tricine 1-Séparation des protéines par électrophorèse

5 pI taille Avantages : Excellente résolution Les limites : Protéines majeures Protéines solubles 4 < pI < Da < PM < Da IPG/SDS-PAGE 1-Séparation des protéines par électrophorèse

6 16-BAC (benzyldimethyl-n-hexadecylammonium chloride) Détergent cationique 16-BAC SDS 16-BAC/SDS-PAGE 1-Séparation des protéines par électrophorèse Avantages : Séparation des protéines hydrophobes possible Les limites : Résolution réduite

7 SyproRuby Bleu Colloïdal ProQ diamond Nitrate dargent Coomassie R Ruthenium 16µl/L : 1000 ng/ protéine 2: 500 ng/ protéine 3: 250 ng/ protéine 4: 125 ng/ protéine 5: 62.5 ng/ protéine 6: ng/ protéine 7: 15.6 ng/ protéine La détection des protéines sur gel 1-Séparation des protéines par électrophorèse

8 Limite de détection Gamme dynamique Coloration au bleu de Coomassie500 ng1 ordre Coloration au bleu de Coomassie colloïdal classique 100 ng2 à 3 ordres Coloration au bleu de Coomassie colloïdal rapide20 ng2 à 3 ordres Coloration au nitrate dargent10 ng 1 ordre + prot spécifique Coloration au nitrate dargent non compatible avec la masse 1 ng 1 ordre + prot spécifique SyproRuby ®, DeepPurple ®, Ruthénium1 ng3 ordres Marquage radioactif ngexcellente 1-Séparation des protéines par électrophorèse La détection des protéines sur gel La gamme dynamique est définie comme le rapport du signal maximal mesurable sur le signal minimal mesurable

9 Spectromètre de masse : mesure précise du rapport m/z dun ion peptide ou protéine ionm/z m : masse de lion z : valence de lion unité : Thompson IonisationAnalyse en m/z H+H+ Spectromètre de Masse 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse protéinegène

10 Pourquoi le spectromètre de masse mesure le rapport m/z ? 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Champ électrostatique m = 1000 Da m = 2000 Da m/z = = 1001 = 501 = 2001 H + = 1 Da Vide suffisant

11 Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ? 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse m/z = = 1001 = 501 = 2001 H + = 1 Da

12 Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ? 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse m/z = = 1001 = 501 = 2001 H + = 1 Da

13 Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ? 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse m/z = = 1001 = 501 = 2001 H + = 1 Da Le massif isotopique

14 Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ? 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Le massif isotopique x 12 C ( x -1) 12 C C ( x -2) 12 C C La différence de masse entre deux pics successifs dun massif isotopique est égale à 1Da

15 Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ? 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse x 12 C ( x -1) 12 C C ( x -2) 12 C C La différence de masse entre deux pics successifs dun massif isotopique est égale à 1Da a Th

16 Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ? 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse x 12 C ( x -1) 12 C C ( x -2) 12 C C La différence de masse entre deux pics successifs dun massif isotopique est égale à 1Da a Th a = 1 z = 1 a = 0.5 z = 2 a = 0.33 z = 3

17 Protéine à identifier Peptides générés par protéolyse Spectre MS expérimental YILMNPRTHSEIKNPMLKL LIHGFDSQASDRTFGNHG GTKTRFDFEEKMLIYTRNV CWCHGFPITREAESDD LKLLIHGFDSQASDR FGNHGGTK TRFDFEEK YILMNPR THSEIK Séquences des protéines Peptides générés in silico Spectres MS théoriques Comparaison m/z I I K K K K R R Carte peptidique 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse

18 ProtéinePeptides générés par protéolyse Spectre MS expérimental YILMNPRTHSEIKNPMLKL LIHGFDSQASDRTFGNHG GTKTRFDFEEKMLIYTRNV CWCHGFPITREAESDD LKLLIHGFDSQASDR FGNHGGTK TRFDFEEK YILMNPR THSEIK Séquences des protéines Peptides générés in silico Spectres MS 2 théoriques Comparaison m/z I I K K K K R R I Spectre MS 2 expérimental Séquençage peptidique 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse

19 découpage Digestion in-gel Identification par spectrométrie de masse LC/MS/MS Compilation et élimination de la redondance Identification des protéines dans un mélange complexe 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse

20 trypsine Protéines dénaturation Peptides pH 3.5 pH cm 32 morceaux électrophorèse Identification par spectrométrie de masse LC/MS/MS Compilation et élimination de la redondance Strip IPG 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse

21 Digestion in-gel Carte peptidiqueséquence peptidique Identification par MS Rapide Peu coûteux Attention à loverlapping Identification systématique des protéines dun protéome 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse

22 3-Quantification des protéines Quantification relative par électrophorèse Quantification relative spectrométrie de masse Marquage isotopique SILAC ICAT iTRAQ Label Free Quantification absolue par spectrométrie de masse Comparaison de labondance des protéines entre des états physiologiques différents synthèsedégradationabondance modification synthèseabondancedégradation

23 1 2 Identification par MS Carte peptidique Séquence peptidique Quantification relative par électrophorèse bidimensionnelle 3-Quantification des protéines

24 La spectrométrie de masse nest pas quantitative I m/z MS 1 ProtéineDigestion Peptides équimolaires p 3-Quantification des protéines

25 La spectrométrie de masse nest pas quantitative et pourtant … I m/z MS 1 ProtéineDigestion Peptides équimolaires I m/z MS Peptide p 14 N Peptide p 15 N p I m/z MS I m/z MS 1:1 1:2 1:10 3-Quantification des protéines

26 SILAC ICAT iTRAQ Digestion trypsique échantillon protéine peptide Spectrométrie de masse La comparaison par marquage isotopique et analyse MS Marquage isotopique 3-Quantification des protéines

27 iTRAQ® : isobaric tags for relative and absolute quantification reporterbalance Groupement réactif H 2 N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-… R1R1 R2R2 H3CH3C N N N O O O O 3-Quantification des protéines

28 Mélange Marquage iTRAQ 114 protéine protéolyse t0T0+20 min Marquage iTRAQ 115 protéine protéolyse T0+40 min Marquage iTRAQ 116 protéine protéolyse T0+60 min Marquage iTRAQ 117 protéine protéolyse 3-Quantification des protéines iTRAQ® : isobaric tags for relative and absolute quantification

29 intensité m/z MS intensité m/z MS/MS intensité m/z peptide balance reporter peptide balance reporter peptide balance reporter peptide balance reporter 3-Quantification des protéines iTRAQ® : isobaric tags for relative and absolute quantification

30 quantité temps de rétention Label Free LC/MS/MS intensité m/z MS C18 3-Quantification des protéines

31 Label Free intensité m/z MS intensité Même temps de rétention 3-Quantification des protéines

32 Label Free intensité Même temps de rétention intensité Même temps de rétention Échantillon 1 Échantillon 2 3-Quantification des protéines

33 Protéines dont protéine P à doser protéolyse Peptides dont peptide p de la protéine p Peptide p marqué par un isotope stable (quantité connue) Analyse par LC/MS/MS La quantification absolue : AQUA® 3-Quantification des protéines m/z MS Peptide p Peptide p AQUA®

34 3-Caractérisation des protéines Complexe protéique Agglomérats Modification post- traductionnelle

35 Complexe protéique Le système double hybride Blue Native / SDS-PAGE Co-immunoprécipitation Far Western Purification : -Pull down -Purification des interactants par chromatographie daffinité -Co-purification : TAP-tag Puce à protéine Phage display Complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) Transfert dénergie de fluorescence par résonance Résonance plasmonique des surfaces 3-Caractérisation des protéines

36 promoteurreporteur Gal4p TA DB TA DB signal Gal4p active la transcription de GAL1 et GAL10 Le système double hybride 3-Caractérisation des protéines

37 X Y promoteurreporteur X Y TA DB + signal Le système double hybride 3-Caractérisation des protéines

38 Principe BN/SDS-PAGE 3-Caractérisation des protéines

39 4%18%7%12 % complexes hétéromultimériques cytosoliques 3-Caractérisation des protéines

40 La co-immunoprécipitation Extrait Anticorps spécifique de + Protéine A sépharose Identification par spectrométrie de masse SDS-PAGE 3-Caractérisation des protéines

41 Le Pull Down lysat + GST Glutathion sépharose GST Identification par spectrométrie de masse SDS-PAGE Glutathion sépharose GST Variantes : -fixation préalable de la protéine de fusion sur la colonne de Glutathion séparose -autres étiquettes : 6His, Streptavidine, HaloTag, … 3-Caractérisation des protéines

42 NHS activated sepharose lysat Identification par spectrométrie de masse SDS-PAGE La purification des interactants par chromatographie daffinité 3-Caractérisation des protéines

43 La co-purification : TAP-Tag Protéine appât Calmoduline Binding Peptide Site de clivage de la protéase du TEV Fragment ZZ de la protéine A IgG Sepharose Calmoduline Sepharose Caractérisation des protéines

44 Le phage display Banque de phage M13 avec PIII rec ou PVIII rec Sélection Lavage Elution Amplification et re-sélection 3-Caractérisation des protéines

45 Le Far Western Transfert sur membrane Renaturation Incubation avec la protéine appât Incubation avec lanticorps dirigé contre la protéine appât Révélation avec un anticorps secondaire Découpage de la zone Identification par spectrométrie de masse 3-Caractérisation des protéines

46 Complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) Protéine ALinkerNYFP 1154 Protéine BLinkerCYFP Caractérisation des protéines

47 Transfert dénergie de fluorescence par résonance Y Y X FRET X 3-Caractérisation des protéines

48 Résonance plasmonique des surfaces Source de lumière Unité de détection optique Prisme Puce avec film dor Canal Lumière polarisée Lumière réfléchie Angle Intensité 3-Caractérisation des protéines

49 Puce à protéine 3-Caractérisation des protéines

50 Agglomérats Problème récurrent en bioproduction Mise au point du process de production Mesure de la masse du produit purifié 3-Caractérisation des protéines

51 Modification post- traductionnelle Mesure de masse exacte de la protéine Exemple : Masse mesurée = ,338 Da Masse calculée = ,435 Da +58Carboxymethyl (on Cysteine) +60sodium + potassium +64Selenocysteine (from Serine) +67Asp transamidation with piperidine +683,5-Dichlorination (of Tyrosine with 35Cl) masse = + 64,097 3-Caractérisation des protéines

52 Modification post- traductionnelle MS fragmentation protéolyse MS 2 MS 3 MS 4 3-Caractérisation des protéines

53 Merci de votre attention


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