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La protéomique : principales techniques et outils informatiques dédiés à l'étude des protéines Cédric PIONNEAU Plate-forme Post-génomique.

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1 La protéomique : principales techniques et outils informatiques dédiés à l'étude des protéines Cédric PIONNEAU Plate-forme Post-génomique de la Pitié-Salpétrière (P3S)

2 Terme définit par Wilkins et al., Biotechnol. Gene.Eng.Rev. (1995), 13, Concept désignant lensemble des produits fonctionnels des gènes dun organisme vivant = ensemble des protéines à un temps t dun organisme vivant dans un environnement donné. Protéome : Etude du protéome, cest-à-dire létude à grande échelle des protéines, et plus particulièrement létude de leurs : - niveaux dexpression - modifications - interactions Protéomique :

3 Génome et transcriptome : supports de linformation génétique Protéines : éléments fonctionnels Pourquoi létude du protéome ? Chaque protéine a une structure et une fonction qui lui est propre. - hemoglobine : forme globulaire. Fixation de loxygène et du CO 2 - actine : filament. Permet la contraction des muscles

4 Pourquoi létude du protéome ? Le séquençage du génome humain a révélé lexistence de gènes. On peut déterminer la séquence des protéines à partir de la séquence des gènes. Mais connaître la séquence théorique des protéines ne suffit pas… la séquence ne permet pas toujours de prédire la fonction de la protéine : celle-ci est souvent reliée à sa structure dans lespace la protéine est très souvent modifiée après sa fabrication (coupure, ajout dautres composés,…) 1 gène peut donner plusieurs formes dune même protéine. Chez lhomme : gènes mais protéines supposées Après létude du génome, létude du protéome est donc indispensable et constitue une nouvelle étape.

5 Comprendre les processus cellulaires normaux ou responsables de maladies (cancers, maladie neurodégénératives, etc...) Identifier de nouvelles protéines Identifier des protéines indicatrices de maladies (bio-marqueurs) Applications de la protéomique

6 La structure des protéines Chaque protéine est élaborée à partir de 20 briques élémentaires : les acides aminés. Une protéine est une combinaison, sous la forme dune chaîne plus au moins longue et orientée, de ces 20 acides aminés (100 à 200 acides aminés).On représente chacun des acides aminés par une lettre. La séquence des acides aminés dune protéine constitue la structure primaire de la protéine. MNRCAIL

7 La structure des protéines Des régions de la protéines peuvent adopter 2 formes particulières : hélices ou feuillets. On parle de structure secondaire. La structure tridimensionnelle finale qu'adopte la chaîne d'acides aminés, constitue la structure tertiaire de la protéine. Structure tertiaire dune protéine Structures secondaires

8 La structure des protéines Plusieurs protéines peuvent sassocier pour former des ensembles complexes. On parle de structure quaternaire.

9 Techniques détudes des protéines Les protéines sont extraites à partir : - de tissus - de cellules en culture - de liquides biologiques (sang, liquide céphalo-rachidien, etc..) On utilise des solutions à la composition bien définie pour solubiliser les protéines et les séparer des autres constituants. On obtient ainsi un extrait protéique = matériel de base pour létude des protéines. Extrait : mélange dun grand nombre de protéines (plusieurs milliers). Il faut individualiser les protéines pour mieux les étudier.

10 Technique développée par O'Farrell en 1975 (30 ans !). Combine 2 séparations séquentielles des protéines en gel de polyacrylamide (20 X 20 X 0,1 cm). Electrophorèse bidimensionnelle Extrait 1ere séparation (charge) 2eme séparation (masse) -

11 Le gel de polyacrylamide est incubé dans une solution qui colore les protéines. Electrophorèse bidimensionnelle Chaque « tache » sur le gel représente une protéine. Plus la « tache » est grosse et foncée, plus la protéine est abondante.

12 Electrophorèse bidimensionnelle Application : comparer les gels dans différentes conditions (cellules normales vs cellules cancéreuses par exemple) pour trouver des différences de quantité de protéine et/ou des absences de protéines. cellules normales cellules cancéreuses

13 Logiciel danalyse dimages Après numérisation, détection automatique des protéines dans limage du gel Quantification : mesure de lintensité en niveaux de gris des protéines Matching : un algorithme dappariement compare les gels 2 à 2 pour trouver les taches qui représentent la même protéine dans les 2 gels

14 Logiciel danalyse dimages Outils de visualisation 3D pour mieux voir les « taches » Aide pour vérifier la détection faite par le logiciel

15 Logiciel danalyse dimages But : repérer les variations dexpression des protéines et les valider par des tests statistiques.

16 Spectrométrie de masse Technique permettant didentifier les protéines séparées par électrophorèse bidimensionnelle ou les protéines en solution (mais en nombre limité). Il faut casser au préalable les protéines : on utilise un enzyme qui fragmente les protéines toujours après 2 acides aminés bien précis. Les fragments produits sont caractéristiques de la protéine : « empreinte digitale »

17 Principe : propulser les fragments de protéines dans un tube sous vide. Pendant leur vol, les fragments se séparent selon leur masse, les plus légers arrivent les premiers sur le détecteur en bout de tube. Spectrométrie de masse Mesure du temps de parcours = mesure de la masse

18 Résultat : spectre de masse des fragments de la protéine Spectrométrie de masse Liste de masses …

19 Analyse des données : la liste de masses de la protéine est comparée aux listes de masses théoriques obtenues à partir des séquences protéiques dérivées du génome. Spectrométrie de masse Protéine X Actine Cytochrome C Cytokeratine Génome connu Protéome

20 Bases de données Comme pour le gènes, les séquences de toutes les protéines sont stockées dans des bases de données accessibles par Internet. SwissProt : base contenant les séquences de protéines connues. En plus de la séquence, sont stockées des informations sur la protéine (structure, fonction, etc…) Logiciels de recherche dans les bases de données Pour les données de spectrométrie de masse par exemple. Différent algorithmes : SEQUEST : calcul dun score basé sur la corrélation entre la liste de masses et les listes de masses théoriques MASCOT : calcul dun score basé sur la probabilité de trouver une correspondance entre la liste de masse et les listes théoriques qui nest pas due au pur hasard Outils informatiques pour létude des protéines

21 Prédiction de structure A partir de la séquence, des programmes tentent de déterminer la structure tridimensionnelle de la protéine. Nécessite beaucoup de calculs (très grand nombre de combinaisons possibles) : réalisés sur des supercalculateurs. Souvent les programmes se basent sur des modèles de structures de protéines connues (détermination de la structure par homologie).

22 Le calcul partagé (grid computing) Programme Décrypthon : Mieux comprendre le fonctionnement et le rôle des protéines, prédire leur fonction si elle est inconnue, progresser dans la connaissance de leur structure en 3 dimensions, croiser les données du protéome et celles du génome - 3 supercalculateurs (Bordeaux, Lille et Paris 6) connecté par le réseau à haut débit RENATER. Puissance de calcul initiale de de 298 Gflops - grille dinternautes : volontaires qui ont permis la comparaison de séquences protéiques en moins de deux mois Berkeley Open Infrastructure for Network Computing (BOINC) -projet et : pour la prédiction de structure de protéines impliquées dans les maladies telle que le SIDA, les cancers, etc… Outils informatiques pour létude des protéines

23 Conclusions Après létude génome (toujours en cours), létude du protéome est actuellement le nouveau défi des chercheurs. Le nombre de données biologiques sur les protéines ne cesse daugmenter et on aura encore plus besoin de linformatique pour gérer et analyser toutes ces données.


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