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Analyse des lipides par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) Par Helena ALVES- REMY NAMC, équipe communication.

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1 Analyse des lipides par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) Par Helena ALVES- REMY NAMC, équipe communication chimique CNRS, UMR 8620 Université Paris Sud, bât 446 ORSAY. Octobre 2004

2 Définition : Molécules insolubles dans leau, mais solubles dans les solvants organiques non polaires comme léther, le chloroforme, le méthanol ou le cyclohexane. LIPIDES

3 Lipides simples : Alcools, aldéhydes, acides, esters gras Acylglycérols (MG, DG, TG) Stérols Hydrocarbures (alcanes, alcènes, ß-carotène,..) Quinones (vit. K, coenzyme Q) Céramides Cires Lipides aminés (dopamine,…)

4 Lipides complexes : Phospholipides (PE, PI, PC, PS, SM, …) Glycolipides (groupes sanguins,…)

5 Mise en évidence des différentes classes de lipides Chromatographie sur Couche Mince (CCM) ou Thin Layer Chromatography (TLC)

6 Chromatographie Définition: Méthode de séparation des constituants dun mélange qui utilise deux phases non miscibles: Une phase stationnaire qui établit des liaisons +/- fortes avec les molécules à séparer Une phase mobile qui entraîne et décroche les molécules retenues sur la phase stationnaire.

7 CCM lipides Migration Phase stationnaire = Gel de silice Phase mobile = 4 mélanges de solvants différents Visualisation des spots: sous UV après vaporisation de Primuline.

8 Lipides totaux transportés par la lipophorine Lipophorine: lipoprotéine hémolymphatique spécialisée dans le transport des lipides chez les insectes. Lipides totaux extraits par un mélange Méthanol – Chloroforme (1:2, v/v).

9 Lipides transportés par la lipophorine Hydrocarbures

10 Lipides transportés par la lipophorine Hydrocarbures Triglycérides

11 Lipides transportés par la lipophorine Hydrocarbures Triglycérides AGL

12 Lipides transportés par la lipophorine Hydrocarbures Triglycérides AGL DG 1,3

13 Lipides transportés par la lipophorine Hydrocarbures Triglycérides AGL DG 1,3 DG 1,2

14 Lipides transportés par la lipophorine Hydrocarbures Triglycérides AGL DG 1,3 DG 1,2 Stérols

15 Lipides transportés par la lipophorine Hydrocarbures Triglycérides AGL DG 1,3 DG 1,2 Stérols MG

16 Lipides transportés par la lipophorine Hydrocarbures Triglycérides AGL DG 1,3 DG 1,2 Stérols MG PE

17 Lipides transportés par la lipophorine Hydrocarbures Triglycérides AGL DG 1,3 DG 1,2 Stérols MG PE PC

18 Identification individuelle de chaque lipide Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse ou GC-MS

19 Chromatographie en phase gazeuse ou CPG: Phase mobile = éluant gazeux inerte (He, H 2, N 2 ) qui entraîne le mélange à analyser. Phase stationnaire, fixée sur un support inerte, retient +/- les constituants du mélange.

20 Injection à haute température CPG sapplique aux gaz et aux composés susceptibles dêtre vaporisés sans décomposition à haute température

21 En masquant les fonctions polaires, elles permettent d'augmenter: la volatilité la stabilité la détectabilité Réactions de dérivation des lipides Alkylation; Silylation

22 Alkylation : réduit la polarité des lipides en remplaçant les H actifs par des groupements alkyles

23 Silylation : réduit la polarité des lipides en remplaçant les H actifs par des groupements triméthylsilyl ou tert- butyl-diméthyl-silyl (t-BDMS)

24 Séparation des lipides dans la colonne capillaire

25 Phase stationnaire Phase stationnaire apolaire de type BP-X5 = Polymethylphenylsiloxanes

26 Le détecteur de masse

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29 Electrons cibles de limpact électronique Électron arraché, par ordre de préférence: 1) électron des doublets n (O, N, …) 2) électron Π (double liaison) 3) électron σ Réarrangements moléculaires Rupture de liaisons Les fragments chargés + sont détectés.

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33 Acides gras libres (AGL) avant dérivation :

34 Esters méthyliques dacides gras :

35 AGL après silylation :

36 Standard de distéarine après silylation

37 Spectre de la tricaprine

38 TG composé de 3 AG différents

39 Mécanismes de fragmentation des acyl-sn-glycérols:

40 1,3-dimyristine

41 1,2-dimyristine

42 Hydrocarbures ramifiés: Formation de carbocations secondaires

43 Localisation des doubles liaisons: dérivation au DMDS

44 Spectre du 7-pentacosène

45 Phéromones chez Drosophila melanogaster Femelle 7,11 Heptacosadiene CH 3 -(CH 2 ) 5 -CH=CH-(CH 2 ) 2 -CH=CH-(CH 2 ) 14 -CH 3 5,9 Heptacosadiene CH 3 -(CH 2 ) 3 -CH=CH-(CH 2 ) 2 -CH=CH-(CH 2 ) 16 -CH 3

46 Phéromones chez Drosophila melanogaster Mâle

47 Identification des phospholipides 1) identification du type de PL par CCM grâce à la co-migration de standards 2) identification des AG estérifiés par GC-MS

48 Lipides transportés par la lipophorine Hydrocarbures Triglycérides AGL DG 1,3 DG 1,2 Stérols MG PE PC

49 Analyse des spots correspondant à PE et à PC par GC-MS

50 Lanalyse des lipides par GC-MS permet : didentifier les AG libres didentifier les AG estérifiés dans les MG, DG, TG et PL de distinguer entre DG 1,2 et 1,3 didentifier les hydrocarbures de localiser la position dune ramification de localiser la position dune double liaison didentifier les stérols


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