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1 IV- La chromatographie en phase gazeuse Domaine dapplication –Molécules volatiles (pression de vapeur notable en dessous de 250°C) –Dérivatisation pour.

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1 1 IV- La chromatographie en phase gazeuse Domaine dapplication –Molécules volatiles (pression de vapeur notable en dessous de 250°C) –Dérivatisation pour augmenter la volatilité –Masse moléculaire < 500 g.mol -1 –Les molécules fortement polaires sont moins volatiles quand elles sont dans des solvants polaires (forces intermoléculaires) Mécanismes –Adsorption (phase stationnaire solide) –Partage (phase stationnaire polymérique)

2 2 1- Le chromatographe Injecteur Gaz vecteur Gaz pour détecteur Four (T<400) Détecteur Enregistrement et traitement des données Colonne

3 3 2- Le gaz vecteur Inerte chimiquement Choix selon détecteur H 2 ou He pour les catharomètres N 2, H 2 ou He pour les FID N 2 ou Ar/CH 4 pour les ECD Pureté (filtres séchant et réducteur) Bouteille ou génération in situ (pureté) Viscosité des gaz He, N2, H2, Ar, CO2

4 3- Les seringues chromatographiques Le volume injecté ne doit pas être inférieur à 10% du volume total de la seringue Seringue à aiguille fixe: - pour les chromatographistes expérimentés - Ont les volume morts les plus faibles Seringue à aiguille amovible - Pour les chromatographistes moins expérimentés Optimisation de linjection –Immerger laiguille dans la solution –Retirer le pison pour aspirer le volume de la seringue –Retirer laiguille de la solution –Éjecter le liquide dans un récipient à déchets –Répéter les étapes 1 à 4 fois –Immerger laiguille dans la solution. Aspirer la solution et la rejeter 5 fois (laiguille doit être maintenue dans la solution) –Remplir la seringue en dépassant le volume souhaité dau moins 4 mm –Placer le piston sur la graduation du volume désiré (attention aux erreurs de parallaxe) –Vérifier quil ny a pas de microbulles, sinon recommencer) –Retirer le piston pour aspirer environ 1 µl dair (laiguille est vidée) –Placer la graduation face à vous. Placer vos avant bras sur le coin du chromatographe pour maintenir lorientation de la seringue. Ceci permet de maintenir identique lorientation de la seringue et déviter dendommager le septum –Insérer laiguille dans linjecteur (aiguille entière) –Maintenir la seringue environ 5s (ce temps doit être reproduit à lidentique pour chaque injection) –Injecter rapidement –Maintenir laiguille en place 15 à 20 secondes –Retirer la seringue –Ce protocole assure une RSD<1%

5 4- Les injecteurs 4-1- Les vannes à gaz –T° constante : Variation de 3°C - Variation de 1% sur la quantité injectée –P constante Entrée du gaz vecteur Entrée de l échantillon Sortie Colonne Position chargement Position analyse boucle

6 4-2- Les injecteurs à vaporisation Vaporisation directe –Léchantillon introduit est immédiatement vaporisé et part dans la colonne –Convient pour les colonnes remplies et les grosses colonnes capillaires Injecteurs split/splitless Mode de fonctionnement split -Une fraction de léchantillon pénètre dans la colonne -Pour fortes concentrations -Volatilisation rapide : pics étroits -Phénomène de ségrégation Mode de fonctionnement splitless - Injection lente -La vanne 2 est fermée (0,5 à 1 min.) -Concentration des soluté en tête de colonne -Ouverture de la vanne 2 pour éliminer le restant de léchantillon -Pour les faibles concentrations -Très répétable -Plus complexe (optimisation du temps de splitless) -Problème avec les produits thermodégradables - Cryofocusing

7 Injecteur à température programmable PTV –Température de linjecteur peut être programmée de 20 à 400°C en quelques dizaines de secondes Modes de fonctionnement - Injection à froid en mode split - Introduction de léchantillon dans linjecteur froid - Ouverture de la vanne de fuite et montée en température - Le solvant et les différents composés pénètrent dans la colonne en fonction de leur point débullition - Injection à froid en mode splitless - Introduction de léchantillon dans linjecteur froid - La vanne de fuite reste fermée lors de la montée en température - Injection avec élimination du solvant - Introduction de léchantillon dans linjecteur froid - Ouverture de la vanne de fuite pour éliminé le solvant - Montée en température avec la vanne de fuite fermée 4-3- Les injecteurs on-column –Laiguille de la seringue pénètre dans la colonne –Léchantillon est déposé en tête de colonne –La tête de la colonne est refroidie pendant linjection

8 4-4- Les différents modes dinjection Aiguille froide –Injection très rapide –Laiguille ne reste pas dans linjecteur –Laiguille na pas le temps de chauffer –Certains composés peuvent être retenus sur laiguille sauf si le piston rentre à lintérieur de celle-ci –Possibilité de condensation des molécules moins volatiles à lextérieur de laiguille Aiguille chaude –Laiguille reste 5s dans linjecteur avant linjection –Augmentation de la vaporisation –Aucun composé ne reste dans laiguille –Pas de condensation des molécules à la surface de laiguille –Moins de discrimination

9 Air gap technique –Remplir la seringue au delà de la marque et rejeter lexcès déchantillon –Remonter entièrement le liquide jusque dans le corps de la seringue jusquà voir lair arriver –Injecter rapidement et retirer rapidement laiguille –Pas de perte des volatils –Meilleure répétabilité –Transfert complet de léchantillon Solvent flush – technique utilisée avec des composés polaires pouvant sadsorber –Introduction de solvant –Introduction dair –Introduction de léchantillon –Le solvant évite ladsorption

10 10 5- Les colonnes (régulées en température) 5-1- Les colonnes remplies Matériaux –Acier inoxydable –Aluminium –Cuivre –Verre –Teflon Dimensions –Longueur : 2 à 3 mètres –Diamètre : 1/8 ou 1/4 Remplissage –Adsorbant –Support inactif imprégné d une phase

11 Les colonnes capillaires Matière plastique Teflon Métaux Acier inoxydable Nickel Aluminium WCOT (Wall Coated Open Tubular) COT (Coated Open Tubular) Golay SCOT (Support Coated Open Tubular) (support imprégné) PLOT (Porous Layer Open Tubular) (à couche poreuse) Capillaires remplies Micropacked Verres et silice Verre Silice fondue 1: Limite basse de température 2: Limite haute de température 3: Limite haute de température en programmation Caractéristiques et Domaine de températures BP1 PhaseDimensions L.DI.e Températures

12 12 Les phases stationnaires solides: pour le gaz permanents et les composés très volatils Tamis moléculaire Alumine Charbon actif Noir de carbone graphitisé Polymères poreux Copolymères du styrène et du divinylbenzène

13 13 Les phases stationnaires liquides Les hydrocarbures ramifiés Squalane (hexaméthyl tétradécane) 60 < T° travail < 120°C Apiezon 50 < T° travail < 200°C Apolane 20 < T° travail < 220°C Les polysiloxanes -20 < T°travail< 400°C Les polyéthers Carbowax OH-(CH 2 -CH 2 -O) n -H

14 Différence colonne remplies – colonnes capillaires

15 Choix de la phase stationnaire Les composés dissolvent leurs semblables : analytes non polaires sur phase non polaire composés polaires sur colonne polaire

16 Interactions dispersives - Tous les types de phase donnent des interactions dispersives - Les méthyl et phenyl polysiloxanes donnent les interactions les plus fortes - Les composés les plus volatils sont les premiers élués - Si les analytes comportent des fonctions chimiques différentes, lanalogie avec le point débullition nest plus vrai - Si les composés ont des points débullition différant de plus de 30°C ils peuvent être séparés par toutes les phases - Si les composés ont des points débullition différant de moins de 10°C lanalogie des points débullition est une erreur

17 Interactions dispersives et polarité - Importance du taux de groupements phényl dans une phase stationnaire - Plus le taux est important plus la phase est polaire (présence délectrons ) - Plus la teneur est importante plus la rétention des composés aromatiques est importante par rapport aux alcanes

18 Interactions dipolaires et liaisons hydrogène - Si la phase donne des interactions dipolaires, elle permet de séparer les composés dont les moments dipolaires sont différents –Cyanopropyl, trifluoropropyl et polyethylène glycol (PEG) - Si la différence de moment dipolaire des analytes est faible, une grande quantité de groupement approprié dans la phase stationnaire est nécessaire –Ex: 50%cynopropyl-methyl au lieu de 14%cynopropyl-methyl –Ces phases sont bien adaptées pour la séparation daromatiques, halocarbones, pesticides - Ces mêmes phases peuvent donner des liaisons hydrogènes –PEG donnent les interactions les plus fortes

19 Longueur de colonne - Lefficacité de la colonne est proportionnelle à la longueur –Doubler la longueur de la colonne double lefficacité - La résolution est proportionnelle à la racine carrée de N –Doubler la longueur de la colonne augmente de 41% lefficacité - Doubler la longueur de la colonne –double le temps danalyse en isotherme –Multiplie entre 1,5 et 1,7 fois le temps danalyse en mode programmation - Plus la colonne est longue plus la pression appliquée doit être importante - Plus la colonne est longue plus le coût est élevé Les colonnes capillaires sont disponibles dans des longueurs de : 10, 15, 20, 25, 30, 50, 60, 120 m Augmenter la longueur de la colonne est la dernière option pour augmenter la résolution Utiliser la colonne la plus courte (commencer par 25 – 30m) La pression en tête de colonne et le bleeding croît avec la longueur les colonnes de 10 – 15 m est bien adaptée pour les composés bien séparés ou pour des échantillons à nombre danalytes réduits Les colonnes de 50 – 60 m sont utilisés lorsque le nombre de soluté est important et lorsque lutilisation de diamètres plus faibles, de phase différentes et de programmation différentes a échoué

20 Diamètre interne de la colonne - Lefficacité est inversement proportionnelle au diamètre de la colonne –Diminuer par 2 le diamètre de la colonne double lefficacité Augmente la résolution dun facteur 1,4 - Le temps de rétention –est inversement proportionnel au diamètre en isotherme –1,25 à 1,5 fois le temps de rétention en programmation - La pression est inversement proportionnelle au carré du rayon de la colonne –Pression multipliée par 1,7 quand on passe dun diamètre 0,32mm à 0,25mm - Capacité augmente avec le diamètre de la colonne

21 Épaisseur de phase Lépaisseur du film modifie –La rétention Le temps de rétention est proportionnel à lépaisseur du film en isotherme En programmation de température le rapport est de 1,5/1 –Linertie Les colonnes à films épais sont plus inertes – moins de sites silanol actifs –La capacité La capacité est supérieure pour des colonnes à film épais –La résolution Les composés dont k < 2 sont mieux résolus lorsque lon augmente lépaisseur La résolutions augmente pour les composés dont 2 < k < 10 Pour les composés dont k >10 lamélioration nest pas notable –Le bleeding Le bleeding est plus important aux températures limites

22 Rapport de phase Augmenter le rapport de phase diminue la rétention Le rapport de phase diminue lorsque –le diamètre diminue –Lépaisseur de phase augmente - Intérêt du rapport de phase -Garder la même rétention -Changer lallure du chromatogramme Ex: - on veut augmenter N réduction du diamètre mais augmentation du temps - si on diminue d f, reste contant : la durée de lanalyse reste constante et lanalyse est plus efficace d I = diamètre interne de la colonne d f = épaisseur du film de phase stationnaire

23 23 6- Rôle de la température - La température est un paramètre important. Elle joue un rôle sur la rétention, la sélectivité, lefficacité - Les courbes montrent que: –La rétention augmente quand la température diminue –Les droites ne sont pas parallèles : la sélectivité diminue avec la température –La séparation est meilleur à basse température –Lintersection des courbes indique une co-élution à cette température

24 24 Mode programmation –Température initiale faible pour la séparation des composés à bas point débullition –Augmentation de la température pour permettre lélution des « autres » composés –Pour une série homologue la rétention est linéaire avec la température –Les composés sont élués avec à peu près la même largeur de pic –La sensibilité augmente pour les composés élués le plus tardivement 6-1- Isotherme et gradient de température Mode isotherme - Pour les composés de même volatilité - Rétention similaire - Pour les composés dont la rétention diffère - Mauvaise forme de pics - Mauvaise sensibilité pour les composés fortement retenus - Mauvaise séparation pour les composés dont k < 2 - Pour les composés dune série homologue la rétention varie de manière logarithmique

25 6-2- Théorie de la programmation de température - Augmenter la température de 30°C conduit à une diminution par 2 de la rétention - En gradient de température la rétention est diminuée par 2 tous les 30°C - Les analytes sont initialement immobilisés en tête de colonne - Ils stagnent jusquà ce que la température devienne compatible avec leur vaporisation et le partage dans la colonne - Comme chaque analyte à une pression de vapeur propre, cest le principal processus de séparation en gradient de température - Une fois que le composé commence à être chromatographié, il accélère dans la colonne à la même vitesse que les autres analytes Utilisation et mise en place de la programmation Une programmation classique est utilisée pour évaluer la nature de léchantillon (gamme de volatilité, nombre de composés, adaptation de la phase, etc.) en général on adopte la programmation suivante : La température initiale doit être aussi basse que possible Le gradient doit être de 10°C/min La température finale doit être compatible avec la température limite de la colonne Le temps final doit être de 10 min pour permettre lélution des composés

26 26 Si les pics éluent dans un temps inférieur à 25% du temps du gradient Il est possible de travailler en isotherme Se placer à T = T f + 45

27 Avantages et inconvénients dune programmation de température Avantages –Utile pour découvrir la nature de léchantillon –Meilleure séparation pour des composés qui ont des rétentions différentes –Amélioration de la limite de détection, la forme des pics et la précision –Permet le nettoyage de la colonne –Est nécessaire pour certains types dinjection : splitless Inconvénients - Plus complexe - Augmentation du bruit de fond - Dégradation plus rapide de la colonne - Analyse plus longues du fait du refroidissement de la température Besoins instrumentaux Gaz secs Possibilité de maîtriser la température du four Utiliser une régulation de pression pour maintenir le débit constant La phase de la colonne doit supporter les températures utilisées

28 Exercice dapplication : Lévolution du facteur de rétention du n-décane et du n-tridécane en fonction de la température dans une colonne GC à débit de gaz vecteur constant est : n-décane : log k 1 = - 6,58 + ; n-tridécane : log k 2 = - 7,91 + ( T en K ) A ) à quelle température ces 2 solutés co-éluraient ils ? B ) déterminer le facteur de sélectivité à 100 °C C) en déduire les coefficients de distribution K 1 et K 2 sachant que le rapport de phase de la colonne est = 250

29 29 7- Caractéristiques des phases stationnaires 7-1- Les indices de Kovats Le temps de rétention varie avec une longueur de chaîne dune fonction chimique déterminée n : nombre de C de la chaîne linéaire a et b sont des constantes Droite de Kovats -On co-injecte un composé X avec une série homologue de n-alcanes en mode isotherme - L indice du composé X est égal à Ix = 100 x où x correspond au nombre de C de « lalcane théorique » ayant le même t R -Ix ne dépend que de la nature de la phase stationnaire

30 n est le nombre datomes de carbone de lalcane linéaire précédant la sortie du composé X t R(X) est le temps de rétention réduit du composé X t R(n) est le temps de rétention réduit de lalcane linéaire à n atomes de carbone précédant la sortie du composé X t R(n+1) est le temps de rétention réduit de lalcane linéaire à n+1 atomes de carbone suivant la sortie du composé X Détermination de Ix - Méthode graphique On reporte logt R(X) sur la droite de Kovats - Par le calcul On utilise les t R des 2 alcanes qui encadrent X sur le chromatogramme

31 7-2- Tables des indices des composés sur différentes phases Lindice de rétention sur une phase et dans des conditions données constitue une information sur lidentification des molécules Cette méthode est exploitable si lon dispose pour les composés étudiés de tables dindices de rétention sur les phases courantes ( squalane,SE 30,Carbowax…)

32 Exercice dapplication : Au cours dune séparation dun mélange dhydrocarbures, les temps de rétention réduits mesurés sont : propane : 2,23 min ; isobutane : 5,71 min ; butane : 6,67 min Calculer lindice de Kovats de chaque composé

33 7-3- Constantes de McReynolds des phases stationnaires Constante calculée par comparaison des indices de Kovats de 5 composés témoins appartenant à des familles chimiques différentes sur la phase étudiée dune part, et dautre part sur le squalane (C 30 H 62 ) utilisée comme référence ( seule phase reproductible car produit pur) Les 5 constantes sont calculées, pour une phase donnée: La somme des ces 5 valeurs est retenue pour définir la polarité globale de la phase testée Ces constantes permettent dapprécier les forces dinteraction soluté/phase stationnaire en relation avec quelques grandes classe de composés. Un produit dont lindice est élevé indique que la phase étudiée retient fortement les composés qui seront porteur de la fonction chimique considérée Ainsi pour séparer un aromatique dun mélange de cétones, on choisira une colonne pour laquelle la constante du benzène est assez différente de celle de la 2-pentanone

34 Exercice dapplication : Le temps de rétention réduit du butan-1-ol sur une colonne de type DB-1 est 168 s Léquation de la droite de Kovats pour cette colonne déterminée à partir du chromatogramme dun mélange de n-alcanes est logt R = 0,39 n – 0,29 ( t R exprimé en secondes ) Déterminer la constante de McReynolds du 1-butanol sur cette colonne sachant que son indice de Kovats sur colonne squalane est de 590

35 35 8- Les détecteurs 8-1- Caractéristiques générales Détecteurs universels Détection des composés toutes familles chimiques confondues Détecteurs spécifiques Détection de composés spécifiques Détecteurs structuraux Identification des composés DétecteurSpécSensGd Emission atomique (AED)non ChimiluminescenceS,O, N, P Détecteur par capture délectron (ECD)halogènes pg 10 4 Carbonyles0.1-1 ng 10 4 Nitrates1-100 pg 10 4 Détecteur à ionisation de flamme (FID)non ng 10 8 Détecteur thermo-ionique (NPD)P, N1-10 pg 10 5 Photométrie de flamme (FPD)P1-10 pg 10 4 S10-100pg--- Spectromètre de masse (MS)non1-10 pg 10 6 Détecteur à photo-ionisation (PID)n, conjugués pg 10 6 Catharomètre (TCD)non1 ng10 6

36 36 La "réponse" du détecteur, dépend: - de la concentration du soluté dans le gaz vecteur, en sortie de colonne - du débit massique La sélectivité : la réponse peut-être : - universelle,détection de tous les composés Ex: TCD - sélective, seuls certains composés seront détectés Ex:ECD La sensibilité : La sensibilité d'un détecteur peut être augmentée par amplification électronique du signal, mais un " bruit de fond " apparaît; La quantité minimale détectable (Q.M.D.)est la quantité de soluté égal à 2 fois le bruit de fond La linéarité : La "gamme linéaire" définit le domaine où la réponse du détecteur en fonction de la concentration du soluté est linéraire.

37 Le catharomètre Détecteur universel Principe : Mesure de la conductibilité thermique des composés chimiques Performances –Sensibilité : µg –Linéarité : 10 5 –Facile dutilisation

38 Détecteur à ionisation de flamme (FID) Détecteur universel le plus utilisé en CPG : Réponse à presque tous les composés organiques Principe : Mesure du courant ionique dans la flamme Performances –Sensibilité : 10 pg –Linéarité : 10 7 –Facilité dutilisation –stabilité Dans la zone chauffée sans O 2 Formation CH, CH 2, CH 3 Formation d ions par ionisation chimique CH + O CHO + + e - Les ions réagissent dans une atmosphère de vapeur d eau CHO+ +H 2 O H 3 O + +CO

39 Détecteur à capture délectrons (ECD) Détecteur sélectif –Composés halogénés –Composés azotés –Composés oxygénés Principe –Emission de radiations (Ni63 : 15 mCi) –Ionisation du gaz vecteur –Piégeage des électrons par le soluté Performances –Sensibilité : 0,01 pg –Linéarité : non linéaire sauf en mode pulsé –Délicat dutilisation Mécanismes de captureNon dissociatif e - + AB AB - + énergie Dissociatif e - + AB A 0 + B -

40 Détecteur FPD et PID FPD(Flame Phometry Detector ) PID (Photo Ionisation Detector

41 Applications de la CPG

42 Conclusion Comparaison CPG - HPLC CPGHPLC - Séparation en phase gazeuse - Composés volatils et non thermolabiles - Séparation à température élevée - Sélectivité limitée - Constante de diffusion élevée - Viscosité faible - Séparation en phase liquide - Indifférent - Séparation à température ambiante - Grande latitude dajustement des sélectivités - Constante de diffusion faible - Viscosité élevée Technique analytique de routine Travail sur des quantité infimes de produits Domaines dapplications variés Possibilité de coupler la technique avec dautres méthodes analytiques (AA, SM, IRTF…) Évolution vers la « Fast GC »


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