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Biologie Moléculaire Compétences Techniques. Compétences Micropipetage Micropipetage Préparation de solutions Préparation de solutions Travailler avec.

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Présentation au sujet: "Biologie Moléculaire Compétences Techniques. Compétences Micropipetage Micropipetage Préparation de solutions Préparation de solutions Travailler avec."— Transcription de la présentation:

1 Biologie Moléculaire Compétences Techniques

2 Compétences Micropipetage Micropipetage Préparation de solutions Préparation de solutions Travailler avec les concentrations Travailler avec les concentrations Dilutions Dilutions Quantités Quantités Électrophorèse sur gel dagarose Électrophorèse sur gel dagarose

3 Micropipetage- Mesurer de petits volumes Permet la mesure de microlitres (µL) Permet la mesure de microlitres (µL) X moins que 1 millilitre X moins que 1 millilitre 2-20 µL µL µL Max mL0.2mL1mL

4 Réglage du volume- P20 Dizaines (0, 1=10 or 2=20) Unités (0-9) Décimale (1-9 = )

5 Réglage du volume- P200 Centaines (0, 1=100 ou 2=200) Dizaines (0, 1-9=10-90) Unités (1-9)

6 Réglage du volume - P1000 Milliers (0, 1=1000) Centaines (0, 1-9= ) Dizaines (0, 1-9= )

7 Utilisation du micropipetteur Étape 1 Insérer embout Étape 2 Peser piston jusquau Premier arrêt Étape 3 Insérer embout dans la solution a être prise Étape 4 Aspirer léchantillon en relâchant lentement le piston Étape 5 Retirer pipetteur

8 Livraison Commencer à livrer 1 er arrêt =livrer 2 e arrêt = expulsion

9 Directives pour reproductibilité optimale Utiliser le pipetteur dont le volume se rapproche le plus de celui désiré Utiliser le pipetteur dont le volume se rapproche le plus de celui désiré VITESSE et FORCE consistante pour peser et relâcher le PISTON VITESSE et FORCE consistante pour peser et relâcher le PISTON PROFONDEUR DIMMERSION consistante PROFONDEUR DIMMERSION consistante 3-4mm sous la surface 3-4mm sous la surface EVITER les bulles dairs EVITER les bulles dairs Ne jamais aller au-delà des limites du pipetteur Ne jamais aller au-delà des limites du pipetteur

10 Préparation des Solutions

11 Définitions Solution Solution Mélange de 2 substances ou plus dans une phase unique Mélange de 2 substances ou plus dans une phase unique Solution composée de deux composantes Solution composée de deux composantes Soluté Soluté –Partie qui est dissoute ou diluée – Habituellement la plus petite quantité Solvant (OU Diluent) Solvant (OU Diluent) –Partie de la solution dans laquelle le soluté est dissout – Habituellement le plus grand volume

12 Concentration = Quantité de soluté Quantité de solution (Pas solvant) Façons dexprimer les concentrations: Concentration Molaire (Molarité) Pourcentages Masse par volume Rapports Concentrations

13 Molarité N o de Moles de soluté/Litre de solution Masse de soluté/PM de soluté = Moles de soluté Moles de soluté/vol en L de solution = Molarité

14 Pourcentages Les concentrations en pourcentage peuvent être exprimé en tant que : Les concentrations en pourcentage peuvent être exprimé en tant que : V/V – volume de soluté/100 mL de solution V/V – volume de soluté/100 mL de solution M/M – Masse de soluté/ 100g de solution M/M – Masse de soluté/ 100g de solution M/V – Masse de soluté/100 mL de solution M/V – Masse de soluté/100 mL de solution Tous représentent des fractions de 100 Tous représentent des fractions de 100

15 Pourcentages (suite) %V/V %V/V Ex. 4.1L soluté/55L solution =7.5% Ex. 4.1L soluté/55L solution =7.5% Doit avoir les mêmes unités en haut et en bas! Doit avoir les mêmes unités en haut et en bas! %M/V %M/V Ex. 16g soluté/50mL solution =32% Ex. 16g soluté/50mL solution =32% Dois avoir des unités du même ordre de grandeur en haut et en bas! Dois avoir des unités du même ordre de grandeur en haut et en bas! % M/M % M/M Ex. 1.7g soluté/35g solution =4.9% Ex. 1.7g soluté/35g solution =4.9% Dois avoir les mêmes unités en haut et en bas! Dois avoir les mêmes unités en haut et en bas!

16 Les Dilutions Réduire une Concentration Une Fraction

17 Dilutions Dilution = produire des solutions plus faibles à partir de solutions plus fortes Dilution = produire des solutions plus faibles à partir de solutions plus fortes Exemple : Faire du jus dorange à partir de concentré. Mélanger une cannette de concentré de jus dorange congelé avec trois (3) cannettes deau Exemple : Faire du jus dorange à partir de concentré. Mélanger une cannette de concentré de jus dorange congelé avec trois (3) cannettes deau

18 Dilutions (suite) Les dilutions sont exprimées comme le volume de la solution étant diluée par le volume total final de la dilution Les dilutions sont exprimées comme le volume de la solution étant diluée par le volume total final de la dilution Dans lexemple du jus dorange, la dilution serait exprimée comme 1/4, pour une cannette de jus à un TOTAL de quatre cannettes de jus dilué. Quand on parle de la dilution, vous diriez pour lexemple du jus : « un dans quatre ». Dans lexemple du jus dorange, la dilution serait exprimée comme 1/4, pour une cannette de jus à un TOTAL de quatre cannettes de jus dilué. Quand on parle de la dilution, vous diriez pour lexemple du jus : « un dans quatre ».

19 Dilutions (suite) Un autre exemple : Un autre exemple : Si vous diluez 1 ml de sérum avec 9 ml de salin, la dilution serait écrite 1/10 ou dite « un dans dix », car vous exprimez le volume de la solution étant diluée (1 ml de sérum) par le volume final TOTAL de la dilution (10 ml totaux). Si vous diluez 1 ml de sérum avec 9 ml de salin, la dilution serait écrite 1/10 ou dite « un dans dix », car vous exprimez le volume de la solution étant diluée (1 ml de sérum) par le volume final TOTAL de la dilution (10 ml totaux).

20 Dilutions (suite) Un autre exemple : Un autre exemple : Une (1) partie dacide concentré est diluée avec 100 parties deau. Le volume total de solution est 101 parties (1 partie dacide parties deau). La dilution est écrite comme 1/101 ou dite un dans cent un. Une (1) partie dacide concentré est diluée avec 100 parties deau. Le volume total de solution est 101 parties (1 partie dacide parties deau). La dilution est écrite comme 1/101 ou dite un dans cent un.

21 Dilutions (suite) Remarquez que les dilutions nont pas dunités (cannettes, ml, ou parties) mais sont plutôt exprimées comme un nombre par rapport à un autre nombre Remarquez que les dilutions nont pas dunités (cannettes, ml, ou parties) mais sont plutôt exprimées comme un nombre par rapport à un autre nombre Exemple : 1/10 ou « un dans dix» Exemple : 1/10 ou « un dans dix»

22 Dilutions (suite) Les dilutions sont toujours exprimées avec la substance originale étant diluée comme étant un (1). Si plus dune partie de la substance originale est initialement utilisée, il est nécessaire de convertir la partie de la substance originale à un (1) quand la dilution est exprimée. Les dilutions sont toujours exprimées avec la substance originale étant diluée comme étant un (1). Si plus dune partie de la substance originale est initialement utilisée, il est nécessaire de convertir la partie de la substance originale à un (1) quand la dilution est exprimée.

23 Dilutions (suite) Exemple: Deux (2) parties dun colorant sont diluées avec huit (8) parties de diluant. Le volume total de solution est 10 parties (2 parties de colorant + 8 parties de diluent). La dilution est initialement exprimée comme 2/10, mais la substance originale doit être exprimée comme étant un (1). Pour convertir le volume original à un (1), utiliser une équation de rapport et de proportion. Rappelez-vous que les dilutions sont exprimées en terme de 1 à quelque chose : __2 parties de colorant = ___1.0___ Volume total de 10 parties x Volume total de 10 parties x 2 x = 10 2 x = 10 x = 5 x = 5 La dilution est exprimée comme étant 1/5.

24 Dilutions (suite) La dilution nest pas toujours représentée par des nombres entiers. Exemple: Deux parties (2) de sang sont diluées avec cinq (5) parties de saline. Le volume total de solution est sept (7) parties (2 parties de sang + 5 parties de saline). La dilution serait 2/7, ou plus précisément 1/3.5. Encore une fois, ceci est calculé en utilisant une équation de rapports et de proportions. Rappelez-vous que les dilutions sont exprimées en terme de 1 à quelque chose: __2 parties de sang_____ = ___1.0___ Volume total de 7 parties x Volume total de 7 parties x 2 x = 7 2 x = 7 x = 3.5 x = 3.5 La dilution est exprimée comme 1/3.5

25 Quest que cela veut dire?? Si une solution possède une dilution de 1/10 le nombre représente 1 partie de léchantillon ajouté à 9 parties de diluant. Si une solution possède une dilution de 1/10 le nombre représente 1 partie de léchantillon ajouté à 9 parties de diluant. Si cette solution était préparée à un volume final de 110 mL, quels volumes de soluté et de solvant doivent être utilisés? Si cette solution était préparée à un volume final de 110 mL, quels volumes de soluté et de solvant doivent être utilisés? Ceci représente 1 partie déchantillon ajoutée à 9 parties de diluant. Ceci représente 1 partie déchantillon ajoutée à 9 parties de diluant. En autres mots, quel est le volume de 1 partie et de 9 parties? En autres mots, quel est le volume de 1 partie et de 9 parties?

26 Déterminer la dilution requise Dilution: Une fraction du facteur de dilution Dilution: Une fraction du facteur de dilution Ex. Vous avez une solution de 25 mg/mL et désirez une solution de 5mg/mL Facteur de dilution = Conc. que jai Conc. que je veux Facteur de dilution = 25mg/mL 5mg/mL = 5X Dilution = 1/le facteur de dilution = 1/5 = 1 partie/5 parties Totales

27 Exemple Comment est-ce que vous prépareriez 25 mL dune solution de 2mM à partir dun solution mère de 0.1M Comment est-ce que vous prépareriez 25 mL dune solution de 2mM à partir dun solution mère de 0.1M

28 Quantités Les quantité ne sont PAS des concentrations! Les quantité ne sont PAS des concentrations! Ex 1. Ex 1. Deux pommes par sac = une concentration Deux pommes par sac = une concentration Deux pommes = une quantité Deux pommes = une quantité Ex 2. Ex 2. 10g par 100 mL = une concentration 10g par 100 mL = une concentration 10g = une quantité 10g = une quantité

29 Dune concentration aux quantités La concentration indique la quantité dans un volume donné La concentration indique la quantité dans un volume donné Ex. 1mM = 1millimole par chaque litre Ex. 1mM = 1millimole par chaque litre Donc la quantité dans 1 L est 1 millimole Donc la quantité dans 1 L est 1 millimole Quel volume de la solution auriez vous besoin pour avoir 0.05 millimole? Quel volume de la solution auriez vous besoin pour avoir 0.05 millimole?

30 Les rapports Façon dexprimer les solutions en indiquant le rapport entre les différentes composantes: Façon dexprimer les solutions en indiquant le rapport entre les différentes composantes: Rapports masses Rapports masses Rapports molaires Rapports molaires Rapports volumes Rapports volumes

31 Les rapports masses Ex. 12g de NaCl est dissout dans 100ml deau Ex. 12g de NaCl est dissout dans 100ml deau Convertir les unités pour quelles soit les mêmes Convertir les unités pour quelles soit les mêmes 12g de NaCl dans 100g deau 12g de NaCl dans 100g deau Diviser les quantités par la valeur de la plus petite quantité Diviser les quantités par la valeur de la plus petite quantité 12g/12g : 100g/12g 12g/12g : 100g/12g Le rapport Le rapport NaCl : eau = 1:8,3 NaCl : eau = 1:8,3

32 Les rapports molaires Ex. 12g de NaCl est dissout dans 100ml deau Ex. 12g de NaCl est dissout dans 100ml deau Convertir les unités en moles Convertir les unités en moles 12g/(58g/mole) de NaCl dans 100g/(18g/mole) deau 12g/(58g/mole) de NaCl dans 100g/(18g/mole) deau –0,2 mole de NaCl : 5,6 moles deau Diviser les quantités par la valeur de la plus petite quantité Diviser les quantités par la valeur de la plus petite quantité 0,2mole/0,2mole : 5,6moles/0,2moles 0,2mole/0,2mole : 5,6moles/0,2moles Le rapport Le rapport NaCl : eau = 1:28 NaCl : eau = 1:28

33 Les rapports volumes Ex. 12ml dalcool sont ajoutés à 1L deau Ex. 12ml dalcool sont ajoutés à 1L deau Convertir les unités pour quelles soit les mêmes Convertir les unités pour quelles soit les mêmes 12ml dalcool dans 1000ml deau 12ml dalcool dans 1000ml deau Diviser les quantités par la valeur de la plus petite quantité Diviser les quantités par la valeur de la plus petite quantité 12ml/12ml : 1000ml/12ml 12ml/12ml : 1000ml/12ml Le rapport Le rapport Alcool : eau = 1:83,3 Alcool : eau = 1:83,3

34 Électrophorèse sur gel dagarose Séparation de molécules dacides nucléiques simples ou doubles brins daprès leur taille et leur conformation Séparation de molécules dacides nucléiques simples ou doubles brins daprès leur taille et leur conformation Sépare les fragments entre 100pb et 10 Kbp Sépare les fragments entre 100pb et 10 Kbp Pouvoir de résolution entre fragments 100pb Pouvoir de résolution entre fragments 100pb

35 Plasmide non digéré sur gel Les plasmide non digérés génèrent un patron de bandes Les plasmide non digérés génèrent un patron de bandes La migration est une fonction de la taille et de la conformation La migration est une fonction de la taille et de la conformation Super enroulé Super enroulé Relâché Relâché Multimèrs? Multimèrs? Super enroulé - + relâché multimèrs -

36 Migration dADN linéaire (plasmide digéré) La vitesse de migration est une fonction de la taille La vitesse de migration est une fonction de la taille Les plus petits fragments migrent plus rapidement Les plus petits fragments migrent plus rapidement La vitesse de la migration est inversement proportionnelle au log 10 de la taille La vitesse de la migration est inversement proportionnelle au log 10 de la taille

37 Migration dADN linéaire (plasmide digéré) 1000 bp 850 bp 750 bp 600 bp 200 bp 100 bp - +

38 Taille (pb) Distance (mm) 23, , , , , , Déterminer les tailles

39 Visualisation: Bromure déthidium Colorant utilisé pour rendre les acides nucléiques visibles Colorant utilisé pour rendre les acides nucléiques visibles Fluorescent sous les UV Fluorescent sous les UV Liaison proportionnelle à Liaison proportionnelle à La taille La taille La quantité La quantité La conformation La conformation

40 Que peut-on déterminer dune électrophorèse sur gel dagarose? Est-ce quil y a de lADN Est-ce quil y a de lADN Combiens de conformations Combiens de conformations Combien de fragments Combien de fragments Taille des fragments Taille des fragments Taille totale des molécules dacides nucléiques Taille totale des molécules dacides nucléiques Nombre de coupures Nombre de coupures Linéaire? Linéaire? Circulaire? Circulaire?


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