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Techniques détude et danalyse des protéines: 1- introduction Les techniques détude et danalyse dune protéine nécessite dabords son extraction et sa purification.

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1 Techniques détude et danalyse des protéines: 1- introduction Les techniques détude et danalyse dune protéine nécessite dabords son extraction et sa purification. Ceci peut donc apparaître comme un problème difficile pour 2 raisons : Les techniques détude et danalyse dune protéine nécessite dabords son extraction et sa purification. Ceci peut donc apparaître comme un problème difficile pour 2 raisons : Elle nexiste quà très faible concentration Elle nexiste quà très faible concentration Elle est mélangée à des millier dautres protéines Elle est mélangée à des millier dautres protéines Malgré cela les protéines peuvent être isolées et ceci pour 2 raisons: Malgré cela les protéines peuvent être isolées et ceci pour 2 raisons: Les méthodes disolement couvrent toutes les propriétés que peuvent avoir les protéines en solution (propriétés différentes due à lexpression de gènes différents) Les méthodes disolement couvrent toutes les propriétés que peuvent avoir les protéines en solution (propriétés différentes due à lexpression de gènes différents) Le pouvoir de résolution des techniques de séparations est très élevé (exemple focalisation isoélectrique) Le pouvoir de résolution des techniques de séparations est très élevé (exemple focalisation isoélectrique)

2 2- Méthodes dextraction et fractionnement des protéines Lextraction requiert que l'on brise le matériel biologique en question pour en libérer les substances ou les structures désirées. Lextraction requiert que l'on brise le matériel biologique en question pour en libérer les substances ou les structures désirées. Il s'agit d'une étape initiale à beaucoup de procédures expérimentales en biochimie et qui s'appelle lhomogénéisation. Celle-ci est obtenue par 2 types de traitements: Il s'agit d'une étape initiale à beaucoup de procédures expérimentales en biochimie et qui s'appelle lhomogénéisation. Celle-ci est obtenue par 2 types de traitements: Lyse: Lyse osmotique, lyse enzymatique, Détergents, solvants inorganiques Lyse: Lyse osmotique, lyse enzymatique, Détergents, solvants inorganiques Traitements mécaniques: Broyage, Mixeur, Homogéniseur, Sonicateur Traitements mécaniques: Broyage, Mixeur, Homogéniseur, Sonicateur

3 2.1-Centrifugation Après Traitements mécaniques ou lyse on obtiens : Après Traitements mécaniques ou lyse on obtiens : homogénéisation Centrifugation différentielle Centrifugation zonale un Homogénat

4 2.2- FILTRATION ET ULTRAFILTRATION La filtration est fréquemment employée en biochimie pour un grand nombre d'applications : stérilisation, isolement de précipité, élimination de sels de solutions, concentration de macromolécules, La filtration est fréquemment employée en biochimie pour un grand nombre d'applications : stérilisation, isolement de précipité, élimination de sels de solutions, concentration de macromolécules,

5 2.3- DIALYSE Il se produit souvent qu'une préparation de macromolécules contienne différents produits dont on veut se débarrasser. Ces produits, sels, glucides, détergents ou autres petites molécules, étaient présents dans la préparation initiale ou ont été introduits lors d'une étape de la purification. Une façon simple d'éliminer ces petites molécules est la dialyse Il se produit souvent qu'une préparation de macromolécules contienne différents produits dont on veut se débarrasser. Ces produits, sels, glucides, détergents ou autres petites molécules, étaient présents dans la préparation initiale ou ont été introduits lors d'une étape de la purification. Une façon simple d'éliminer ces petites molécules est la dialyse La dialyse est basée sur les principes régissant la diffusion à travers une membrane perméable ou semi-perméable. Les ions se déplacent du milieu le + concentré vers le - concentré La dialyse est basée sur les principes régissant la diffusion à travers une membrane perméable ou semi-perméable. Les ions se déplacent du milieu le + concentré vers le - concentré

6 3- Méthodes de purification et danalyse des protéines La purification dune protéine se fait en +sieurs étapes en faisant intervenir à chaque étape une des propriétés que peut avoir cette protéine en solution La purification dune protéine se fait en +sieurs étapes en faisant intervenir à chaque étape une des propriétés que peut avoir cette protéine en solution Lors de ces différentes étapes le contrôle de lefficacité de la purification simpose pour réussir un isolement avec un rendement acceptable Lors de ces différentes étapes le contrôle de lefficacité de la purification simpose pour réussir un isolement avec un rendement acceptable

7 Propriétés des protéines et Techniques de purification Propriétés de baseTechniques de séparation Taille et DensitéCentrifugation, Dialyse, Filtration et ultrafiltration Chromatographie dexclusion Electrophorèse sur gel de porosité ou Electrophorèse en SDS-page Solubilité, polaritéPrécipitation par différence de solubilité (PH, µ ) Chromatographie sur papier Chromatographie dadsorption ChargeChromatographie échangeuse dion Electrophorèse Focalisation isoélectrique SpécificitéChromatographie daffinité

8 Détection des composés séparés: Détection par rayonnements radioactifs si le composé est radioactif. Détection par rayonnements radioactifs si le composé est radioactif. Par éclairage UV si la structure de la molécule permet labsorption en lumière ultraviolette. Par éclairage UV si la structure de la molécule permet labsorption en lumière ultraviolette. Par pulvérisation d'une substance qui réagit avec le composé recherché pour donner une certaine couleur. Par pulvérisation d'une substance qui réagit avec le composé recherché pour donner une certaine couleur. Exemple: Exemple: les acides aminés réagissent avec la ninhydrine pour donner un composé violet foncé.les acides aminés réagissent avec la ninhydrine pour donner un composé violet foncé. Les amines secondaires, comme Pro, réagissent également avec ce composé mais pour donner une coloration jaune.Les amines secondaires, comme Pro, réagissent également avec ce composé mais pour donner une coloration jaune.

9 3-Techniques détude et danalyse des protéines: 3.1-Précipitation par différence de solubilité (pH et µ) 3.1-Précipitation par différence de solubilité (pH et µ) 3.2-Chromatographie 3.2-Chromatographie Chromatographie sur papier Chromatographie sur papier Chromatographie dadsorption Chromatographie dadsorption Chromatographie par échange d ions Chromatographie par échange d ions Chromatographie par gel filtration (exclusion de taille) Chromatographie par gel filtration (exclusion de taille) Chromatographie par affinité Chromatographie par affinité 3.3-Électrophorèse 3.3-Électrophorèse Électrophorèse sur papier Électrophorèse sur papier ou Electrophorèse non dénaturante sur gel de porosité ou Électrophorèse en SDS-page : Électrophorèse en SDS-page : Électrophorèse sur gradient de pH (focalisation isoélectrique ou électrofocalisation) Électrophorèse sur gradient de pH (focalisation isoélectrique ou électrofocalisation) 3.4-Electrochromatographie (carte peptidique, empreinte digital ou finger print) 3.4-Electrochromatographie (carte peptidique, empreinte digital ou finger print)

10 3.1- Précipitation par différence de solubilité On provoque la précipitation de la protéine à isoler soit par précipitation isoélectrique ou par relargage On provoque la précipitation de la protéine à isoler soit par précipitation isoélectrique ou par relargage Pour la première, on ajuste le pH dune solution dun mélange protéique au pHi de lune dentre elles, ainsi la totalité de cette protéines précipite laissant en solution les autres dont les pHi sont > ou ou < au pH choisi. Après centrifugation la totalité de cette protéine se trouve dans le culot Après centrifugation la totalité de cette protéine se trouve dans le culot

11 3.2-Chromatographie : Chromatographie sur papier Chromatographie sur papier Chromatographie dadsorption Chromatographie dadsorption Chromatographie par échange d ions Chromatographie par échange d ions Chromatographie par gel filtration (exclusion de taille) Chromatographie par gel filtration (exclusion de taille) Chromatographie par affinité Chromatographie par affinité

12 3.2.1-Chromatographie sur papier: Solvant monte par capillarité Solvant monte par capillarité Vit. de migration dépend de la solubilité dans la phase stationnaire polaire et la phase mobile non-polaire Vit. de migration dépend de la solubilité dans la phase stationnaire polaire et la phase mobile non-polaire Les molécules se séparent selon leur caractère polaire. Les molécules se séparent selon leur caractère polaire. Les non polaires se déplacent plus vite que les polaires sur un support hydrophille Les non polaires se déplacent plus vite que les polaires sur un support hydrophille coefficient de partage (C p ) : coefficient de partage (C p ) : C p = [dans la phase stationnaire] [dans la phase mobile] [dans la phase mobile]

13 3.2.1-Chromatographie sur papier: La vitesse de migration d'un composé peut être définie par le rapport : La vitesse de migration d'un composé peut être définie par le rapport : R f = Dist. parcourue par la substance R f = Dist. parcourue par la substance Dist. parcourue par le front de solvant Dist. parcourue par le front de solvant Chaque composé possède un R f caractéristique pour un système de solvant donné et un type de support choisi. Chaque composé possède un R f caractéristique pour un système de solvant donné et un type de support choisi.

14 3.4- Chromatographie bidimensionnelle

15 3.2.2-Chromatographie dadsorption type HPLC HPLC série 1100 HPLC série 1100 Fait appel à des pressions élevées pour pousser le solvant dans la colonne Fait appel à des pressions élevées pour pousser le solvant dans la colonne Avantages: Avantages: Grande résolution Grande résolution Vitesse de l'analyse Vitesse de l'analyse Grande reproductibilité Grande reproductibilité Bon contrôle des paramètresBon contrôle des paramètres Instrument et analyse informatisés Instrument et analyse informatisés

16 Chromatographie par échange dions:

17 Les contres ions liés à un support insoluble sont remplacés de manière réversible par dautres ions en solution avec lesquels ils ont plus daffinité: Les contres ions liés à un support insoluble sont remplacés de manière réversible par dautres ions en solution avec lesquels ils ont plus daffinité: R + C - + P - R + P - + C - R + C - est un échangeur d'anions, et P - représente les anions en solutions. R + C - est un échangeur d'anions, et P - représente les anions en solutions. Les échangeurs de cations, portent des groupements chargés négatifs qui lient des cations de manière réversible. Les échangeurs de cations, portent des groupements chargés négatifs qui lient des cations de manière réversible. Les protéines, lampeuvent aussi bien se lier à des échangeurs de cations qu'à des échangeurs d'anions, selon la valeur de leur charge nette. Les protéines, lampeuvent aussi bien se lier à des échangeurs de cations qu'à des échangeurs d'anions, selon la valeur de leur charge nette.

18 Chromatographie par échange dions: Les composés qui n'interagissent pas avec l'échangeur d'ions ne sont pas retenus. Les composés qui n'interagissent pas avec l'échangeur d'ions ne sont pas retenus. Plus les composés interagissent avec l'échangeur d'ions, plus ils sont retenus par la colonne. Plus les composés interagissent avec l'échangeur d'ions, plus ils sont retenus par la colonne. Une fois que les composés non voulus sont élués de la colonne, ceux voulus peuvent être élués plus facilement en remplaçant le tampon d'élution par un autre de concentration saline supérieure et/ou de pH convenable. Une fois que les composés non voulus sont élués de la colonne, ceux voulus peuvent être élués plus facilement en remplaçant le tampon d'élution par un autre de concentration saline supérieure et/ou de pH convenable.

19 Les échangeurs d'ions sont des groupements chargés liés de façon covalente à une matrice- support (résine). Les échangeurs d'ions sont des groupements chargés liés de façon covalente à une matrice- support (résine). L'échangeur d'anions cellulosique le plus utilisé est le (DEAE)-cellulose L'échangeur d'anions cellulosique le plus utilisé est le (DEAE)-cellulose L'échangeur de cations cellulosique le plus utilisé est le (CM)-cellulose L'échangeur de cations cellulosique le plus utilisé est le (CM)-cellulose Chromatographie par échange dions:

20 3.2.4-Chromatographie par exclusion de taille (gel-filtration):

21 Les billes sont composées de dextran (Séphadex), d'agarose (Sépharose) ou de polyacrylamide (Séphacryl). Les billes sont composées de dextran (Séphadex), d'agarose (Sépharose) ou de polyacrylamide (Séphacryl). La taille des pores des billes est voisine des macromolécules à séparer. La taille des pores des billes est voisine des macromolécules à séparer.

22 3.2.4-Chromatographie par exclusion de taille (gel-filtration): V e est le volume nécessaire de phase mobile pour éluer un composé de la colonne après son dépôt sur le gel. V e est le volume nécessaire de phase mobile pour éluer un composé de la colonne après son dépôt sur le gel. V 0 est déterminé par mesure du V e d'un composé dont la masse moléculaire est supérieure à la limite d'exclusion du gel. V 0 est déterminé par mesure du V e d'un composé dont la masse moléculaire est supérieure à la limite d'exclusion du gel. V t est déterminé par mesure du V e d'un composé dont la masse moléculaire est inférieure à la limite d'exclusion du gel. V 0 < V e < V t V t est déterminé par mesure du V e d'un composé dont la masse moléculaire est inférieure à la limite d'exclusion du gel. V 0 < V e < V t Plus la molécule est grosse, plus difficilement elle pénétrera dans les pores, elle sortira plus rapidement. Plus la molécule est grosse, plus difficilement elle pénétrera dans les pores, elle sortira plus rapidement. Plus la molécule est petite, plus elle pourra occuper une plus grande portion du volume V i, plus grand sera son V e, plus elle sera ralentie et elle sortira plus tard. Plus la molécule est petite, plus elle pourra occuper une plus grande portion du volume V i, plus grand sera son V e, plus elle sera ralentie et elle sortira plus tard.

23 3.2.4-Chromatographie par exclusion de taille (gel-filtration): Si la molécule peut entrer dans les pores du gel, sa répartition entre la phase interne et la phase externe est donnée par le coefficient de distribution K D : Si la molécule peut entrer dans les pores du gel, sa répartition entre la phase interne et la phase externe est donnée par le coefficient de distribution K D : K D = (V e - V 0 ) / (Vt – V 0 ) = -a log MM + b Avec 0 K D 1 Méthode utilisée également pour la détermination de la masse moléculaire des protéines Méthode utilisée également pour la détermination de la masse moléculaire des protéines

24 V e en fonction de la MM de différentes protéines: Sephadex G-200 (5-600 kDa) pH 7,5

25 3.2.5-Chromatographie par affinité: Fait appelle aux fonctions biologiques des protéines. Fait appelle aux fonctions biologiques des protéines. formation de liaisons ou de complexes avec de petites molécules biologiques spécifiques (ligands). formation de liaisons ou de complexes avec de petites molécules biologiques spécifiques (ligands). liaison covalente du ligand sur un support insoluble comme la cellulose ou l'acrylamide. liaison covalente du ligand sur un support insoluble comme la cellulose ou l'acrylamide. la protéine recherchée ayant une affinité pour le ligand se fixera à ce dernier et sera immobilisée. la protéine recherchée ayant une affinité pour le ligand se fixera à ce dernier et sera immobilisée. Lavage pour enlever les autres protéines Lavage pour enlever les autres protéines 2 ème lavage pour éluer la protéine fixée 2 ème lavage pour éluer la protéine fixée

26 Comparaison des trois types de chromatographie:

27 3.3-Électrophorèse Électrophorèse sur papier Électrophorèse sur papier ou Electrophorèse non dénaturante sur gel de porosité ou Électrophorèse en SDS-page Électrophorèse en SDS-page Électrophorèse sur gradient de pH (focalisation isoélectrique ou électrophocalisation) Électrophorèse sur gradient de pH (focalisation isoélectrique ou électrophocalisation)

28 3.3-L'électrophorèse: Déplacement d'ions dans un champ électrique. Déplacement d'ions dans un champ électrique. La force électrique, F électrique, qui s'exerce sur un ion porteur d'une charge q dans un champ électrique de potentiel E est : La force électrique, F électrique, qui s'exerce sur un ion porteur d'une charge q dans un champ électrique de potentiel E est : F électrique = qE F électrique = qE La force de friction s'oppose au déplacement électrophorétique: La force de friction s'oppose au déplacement électrophorétique: F friction = vf F friction = vf v est la vitesse de déplacement de l'ion et f est son coefficient de friction. v est la vitesse de déplacement de l'ion et f est son coefficient de friction. f: dépend de la taille, de la forme et de l'état de solvatation de l'ion ainsi que de la viscosité de la solution. f: dépend de la taille, de la forme et de l'état de solvatation de l'ion ainsi que de la viscosité de la solution.

29 3.3-L'électrophorèse: Dans un champ électrique constant, les forces qui s'exercent sur l'ion s'équilibrent : Dans un champ électrique constant, les forces qui s'exercent sur l'ion s'équilibrent : qE = vf Ainsi la vitesse de l'ion est équivalente à : Ainsi la vitesse de l'ion est équivalente à : La mobilité M r d'un ion se définit par: La mobilité M r d'un ion se définit par: M r = pHe – pHi / MM M r = pHe – pHi / MM Des protéines différentes se déplacent à des vitesses différentes en raison de de leurs charges (proportionnelle à pHe – pHi) et de leurs coefficients de friction (inversement proportionnelle à MM). Des protéines différentes se déplacent à des vitesses différentes en raison de de leurs charges (proportionnelle à pHe – pHi) et de leurs coefficients de friction (inversement proportionnelle à MM).

30 3.3-L'électrophorèse:

31 3.3.1-Électrophorèse sur papier Papier filtre ou acétate de cellulose Papier filtre ou acétate de cellulose Champ électrique: env. 20 V/cm Champ électrique: env. 20 V/cm cathode (-): attire les cations (+) cathode (-): attire les cations (+) anode (+): attire les anions (-) anode (+): attire les anions (-)

32 Important: Important: Dans l'électrophorèse sur papier: Dans l'électrophorèse sur papier: Les molécules sont séparés en fonction de leurs masses molaires et leurs chargesLes molécules sont séparés en fonction de leurs masses molaires et leurs charges Dans la chromatographie sur papier: Dans la chromatographie sur papier: Les molécules se séparent en fonction de leur caractère polaireLes molécules se séparent en fonction de leur caractère polaire Électrophorèse sur papier

33 Gels avec pores de dimensions moléculaires de taille variable Gels avec pores de dimensions moléculaires de taille variable Polyacrylamide: petite taille des pores Polyacrylamide: petite taille des pores Agarose: grande taille des pores Agarose: grande taille des pores La taille des pores varie aussi avec la concentration des gels La taille des pores varie aussi avec la concentration des gels Plus la concentration, plus la taillePlus la concentration, plus la taille La séparation des molécules repose sur: La séparation des molécules repose sur: Gel-filtration (grosses molécules ralenties par rapport aux petites) Gel-filtration (grosses molécules ralenties par rapport aux petites) Électrophorèse en gel:

34 Électrophorèse en gel: Électrophorèse en gel: Électrophorèse en gel: Migration des molécules dans un champ électrique Migration des molécules dans un champ électrique Les grosses molécules sont ralenties par rapport aux petites Les grosses molécules sont ralenties par rapport aux petites Chromatographie en gel-filtration: Chromatographie en gel-filtration: Migration des molécules par gravité Les petites molécules sont ralenties par rapport aux grosses

35 Électrophorèse en gel: Migration selon la taille et la charge des molécules Migration selon la taille et la charge des molécules Les plus chargées (-) migrent plus loin vers l'anode Les plus chargées (-) migrent plus loin vers l'anode Pour deux molécules de même charge: Pour deux molécules de même charge: Les plus petites migrent plus loin que les plus grossesLes plus petites migrent plus loin que les plus grosses La charge des molécules dépend du pH du tampon La charge des molécules dépend du pH du tampon

36 à pH fixe ou Electrophorèse à pH fixe sur gel de porosité ou Dans ce type délectrophorèse on annule leffet du pHi Dans ce type délectrophorèse on annule leffet du pHi Les molécules protéiques non dénaturées arrêtent leurs migration dès que le gel devient impénétrable Les molécules protéiques non dénaturées arrêtent leurs migration dès que le gel devient impénétrable Méthode utilisée également pour la détermination de la MM des protéines: m e = -a log MM + b Méthode utilisée également pour la détermination de la MM des protéines: m e = -a log MM + b

37 Détection des protéines en électrophorèse: Les bandes du gel peuvent être détectées par: Les bandes du gel peuvent être détectées par: Coloration des protéines par complexation avec un colorant (bleu de Coomassie) Coloration des protéines par complexation avec un colorant (bleu de Coomassie) Précipitation Ag/Ac (immunoblotting) Précipitation Ag/Ac (immunoblotting) Comptage radioactif Comptage radioactif

38 Électrophorèse en SDS-page : Électrophorèse en SDS-page : Le SDS est un détergent anionique qui couvrent la totalité de la protéine ce qui brise les interactions et détruit les structures tertiaires et quaternaires Le SDS est un détergent anionique qui couvrent la totalité de la protéine ce qui brise les interactions et détruit les structures tertiaires et quaternaires La mobilité électrophorétique ( m e ) des protéines en SDS-PAGE est inversement proportionnelle au logarithme de sa masse moléculaire. La mobilité électrophorétique ( m e ) des protéines en SDS-PAGE est inversement proportionnelle au logarithme de sa masse moléculaire. SDS-PAGE utilisé pour déterminer la masse moléculaire d'une protéine ou de ses sous-unités, en utilisant des protéines « marqueurs » de masses moléculaires connues. SDS-PAGE utilisé pour déterminer la masse moléculaire d'une protéine ou de ses sous-unités, en utilisant des protéines « marqueurs » de masses moléculaires connues. Méthode utilisée pour la détermination de la MM des sous unités protéiques: m e = -a log MM + b Méthode utilisée pour la détermination de la MM des sous unités protéiques: m e = -a log MM + b On peux explorer la structure quaternaire dune protéine en comparant les différentes MM des sous unité obtenues dans les conditions ND, DNR et DR. On peux explorer la structure quaternaire dune protéine en comparant les différentes MM des sous unité obtenues dans les conditions ND, DNR et DR.

39 Principe de la formation SDS-Protéine

40 Électrophorèse en SDS-page: détermination de la MM Électrophorèse en SDS-page: détermination de la MM KD + -

41 Électrophorèse en SDS-page: détermination de la MM de la protéine Électrophorèse en SDS-page: détermination de la MM de la protéine KD

42 Électrophorèse en SDS-page: détermination de la MM de sous unité de la protéine Électrophorèse en SDS-page: détermination de la MM de sous unité de la protéine électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions non dénaturante: séparation des molécules protéiques natives (non dénaturées) en fonction de leur charge nette et de leur PM électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturante réductrice (SDS et mercaptoéthanol qui entraîne une réduction de pont disulfure): séparation des sous unités des molécules protéiques dénaturées en fonction de leur PM PM de P non dénaturée/ PM de P dénaturée = nombre de sous unité

43 3.3.4-Focalisation isoélectrique Repose sur les différences de pI entre protéines. Repose sur les différences de pI entre protéines. Une première électrophorèse est effectuée avec une solution de molécules amphotères à travers un gel. Une première électrophorèse est effectuée avec une solution de molécules amphotères à travers un gel. La migration de ces molécules dans un champ électrique crée un gradient de pH au niveau du gel. La migration de ces molécules dans un champ électrique crée un gradient de pH au niveau du gel. Les molécules amphotères vont se répartir en fonction de leurs pI: Les molécules amphotères vont se répartir en fonction de leurs pI: les plus acides se rassemblent vers l'anodeles plus acides se rassemblent vers l'anode les plus basiques se positionnent vers la cathodeles plus basiques se positionnent vers la cathode Ainsi, le pH de l'anode vers la cathode. Ainsi, le pH de l'anode vers la cathode.

44 Focalisation isoélectrique La solution de protéines est ensuite déposée sur le gel pour effectuer une seconde électrophorèse. La solution de protéines est ensuite déposée sur le gel pour effectuer une seconde électrophorèse. Les protéines se déplacent dans le gradient de pH du gel, jusqu'à ce qu'elles arrivent à une zone correspondant à leur pI respectif. Les protéines se déplacent dans le gradient de pH du gel, jusqu'à ce qu'elles arrivent à une zone correspondant à leur pI respectif. À ce pI, les protéines n'auront plus de charge nette, elles vont donc arrêter de migrer. À ce pI, les protéines n'auront plus de charge nette, elles vont donc arrêter de migrer. Chaque protéine se trouve donc concentrée sous forme d'une bande étroite autour de son point isoélectrique à ± 0.01 unités de pH. Chaque protéine se trouve donc concentrée sous forme d'une bande étroite autour de son point isoélectrique à ± 0.01 unités de pH.

45 Focalisation isoélectrique Ampholytes basiques Ampholytes acides

46 Electrophorèse bidimensionnelle

47 3.4-Electrochromatographie (carte peptidique, empreinte digital ou finger print)

48 Protéines et maladies héréditaires Ex. anémie falciforme Globules rouges normaux Globules rouges anormaux (anémie falciforme)

49 L'hémoglobine est formée de quatre chaînes d'acides aminés: 2 chaînes dites et 2 chaînes dites. 2 chaînes

50 Hémoglobine normale (chaîne ) Hémoglobine anormale (anémie falciforme) Mutation a touché la polarité et la charge de la protéine

51 Contrôle de la purification des protéines Trois paramètres permettent de suivre let dévaluer lefficacité dune purification Trois paramètres permettent de suivre let dévaluer lefficacité dune purification R%= Qté de P à chaque étape/ Qté de P de départ R%= Qté de P à chaque étape/ Qté de P de départ R% = Activité enzymatique à chaque étape/ Activité enzymatique de départ R% = Activité enzymatique à chaque étape/ Activité enzymatique de départ AS = Activité enzymatique à chaque étape/ Qté de P à chaque étape AS = Activité enzymatique à chaque étape/ Qté de P à chaque étape IP = AS à chaque étape /AS de départ IP = AS à chaque étape /AS de départ

52 Évolution des paramètres de la purification

53 Méthodes de détermination de la masse moléculaire des protéines 1- méthode chimique: 1- méthode chimique: Elle repose sur le dosage dun constituant de très faible proportion dans la molécule protéine. Elle repose sur le dosage dun constituant de très faible proportion dans la molécule protéine. Le PM min est établi en postulant quil nexiste quune seul molécule du constituant par molécule protéique Le PM min est établi en postulant quil nexiste quune seul molécule du constituant par molécule protéique PM min de P / PM du C = % de P / % du C PM min de P / PM du C = % de P / % du C = 100% de P / % du C = 100% de P / % du C PM min = PM du C X 100 / % du C PM min = PM du C X 100 / % du C Le PM réel = n x PM de P; n étant le nombre de répétition du C dans la molécule de P. Le PM réel = n x PM de P; n étant le nombre de répétition du C dans la molécule de P.

54 Méthodes de détermination de la masse moléculaire des protéines 2- par chromatographie dexclusion diffusion 2- par chromatographie dexclusion diffusion K D = (V e - V 0 ) / (Vt – V 0 ) = -a log MM + b K D = (V e - V 0 ) / (Vt – V 0 ) = -a log MM + b Détermination de la MM de la protéine native Détermination de la MM de la protéine native 3- par électrophorèse non dénaturante 3- par électrophorèse non dénaturante m e = -a log MM + b ou mr = ma–ml/mr-ml= -alogMM+b m e = -a log MM + b ou mr = ma–ml/mr-ml= -alogMM+b Détermination de la MM de la protéine native Détermination de la MM de la protéine native 4- par électrophorèse SDS-age 4- par électrophorèse SDS-age m e = -a log MM + b m e = -a log MM + b Détermination des MM des sous unités (CDNR) Détermination des MM des sous unités (CDNR) 5- par électrophorèse SDS-age + mercaptoéthanol: 5- par électrophorèse SDS-age + mercaptoéthanol: m e = -a log MM + b m e = -a log MM + b Détermination des MM des sous unités (CDR) Détermination des MM des sous unités (CDR)

55 Détermination des MM des protéines dans les conditions ND (1), DNR (2) et DR (3): Application à la détermination de la structure IV aire du Glutathion


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