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Plateforme de Cytogénétique CYTOGÉNÉTIQUE CLINIQUE CHEZ LES ANIMAUX D’ÉLEVAGE : BILAN DE LA PLATEFORME DE L’UMR INRA/INPT GENPHYSE ATC le 10/09/2014.

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1 Plateforme de Cytogénétique CYTOGÉNÉTIQUE CLINIQUE CHEZ LES ANIMAUX D’ÉLEVAGE : BILAN DE LA PLATEFORME DE L’UMR INRA/INPT GENPHYSE ATC le 10/09/2014

2 Plan : Introduction : Présentation de l’INRA Présentation du département de Génétique Animale Présentation de la plateforme La cytogénétique clinique à l’INRA Bref historique Les principaux résultats Activité cytogénétique porcine Historique Motivations Principaux résultats ATC le 10/09/2014

3 Activités de recherche : analyse des effets des anomalies sur la reproduction Analyse des produits méiotiques Analyse du processus méiotique Nouveaux projets : Analyse de la recombinaison and interférence Analyse de l’infertilité mâle Etude des points de cassure ATC le 10/09/2014

4 INTRODUCTION ATC le 10/09/2014 Plateforme de Cytogénétique

5 L’INRA est un organisme de recherche en agronomie fondé en 1946, placé sous le statut et sous la double tutelle des ministères de l’Enseignement supérieur et de la Recherche et du ministère de l'Agriculture, de l'Agroalimentaire et de la Forêt. L'INRA mène des recherches finalisées pour une alimentation saine et de qualité, pour une agriculture durable et compétitive, et pour un environnement préservé et valorisé. ATC le 10/09/2014 L’INRA :

6 Le département de Génétique Animale : ATC le 10/09/2014 CT1 - le génome : structure fine et organisation fonctionnelle CT2 - l'animal : leviers génétiques pour un élevage innovant et durable CT3 - les populations animales : caractérisation, gestion et optimisation Equipe CYTOGENE : Plasticité du génome et de l’épigénome au cours de la gamétogenèse Architecture nucléaire 3D et expression du génome Caractérisation de la diversité génétique de l’abeille domestique

7 Anne Marie LOUSTAU Responsable Qualité AI Inra Nathalie MOUNEY Resp Activité Bovins, autres espèces TR Envt Anne CALGARO Resp Activité Porcs TR Ex Envt Alain PINTON Responsable Plateforme de Cytogénétique IR Inra Nathalie PRONO Secrétaire AJT FR Envt Nicolas MARY TR Inra Alain DUCOS Pr Envt CONTRÔLE CHROMOSOMIQUE DES POPULATIONS ANIMALES (porcs, bovins, chevaux, sangliers…) PROGRAMMES SCIENTIFIQUES Anomalies chromosomiques et reproduction Personnes impliquées dans les deux activités PLATEFORME DE CYTOGENETIQUE (ISO 9001) Périmètre de certification ISO 9001 Harmonie BARASC IE ENVT ATC le 10/09/2014

8 Missions  Mission 2 : Programmes scientifiques « cytogénétique et reproduction » Développer, dans la continuité de l’activité de contrôle, des programmes de recherche originaux dans le domaine de la « biologie de la reproduction »  Mission 1 : Contrôle chromosomique des populations animales Apporter un service au monde de l’élevage par la recherche d’anomalies chromosomiques susceptibles d’avoir des répercussions sur la « qualité des reproducteurs » ATC le 10/09/2014

9 Missions ATC le 10/09/2014  Recherches “finalisées ” Objectifs : Estimer les effets potentiels des anomalies chromosomiques  Recherches “académiques” Objectifs : Apport de nouvelles connaissances sur le processus de méiose en présence d’anomalies chromosomiques et recherche des causes d’infertilité « mâle »

10 ATC le 10/09/2014 La cytogénétique clinique à l’INRA ATC le 10/09/2014 Plateforme de Cytogénétique

11 ATC le 10/09/2014 Début de la cytogénétique animale dans les années : identification de la Rob 1/29 (bovin) et de la première translocation réciproque chez le porc Dans les années 70 développement des techniques de banding et établissement des premiers caryotypes standards L’association entre anomalies chromosomiques et troubles de la reproduction → développement de laboratoires de cytogénétique animale principalement en Europe Depuis les années 90 → déclin de la cytogénétique animale clinique Un peu d’histoire:

12 ATC le 10/09/2014 Un peu d’histoire: 1968: établissement des premiers laboratoires de cytogénétique à l’INRA (Jouy en Josas : Paul Popescu et Toulouse : Roland Darré) 1971: identification de la Rob 1/29 en France 1986: décret rendant obligatoire l’analyse des taureaux avant leur utilisation en insémination artificielle 2009: obligation d’élever des sangliers présentant un caryotype à 36 chromosomes

13 Entre 8000 et analyses chromosomiques réalisées chaque année (principalement chez le porc et le bovin) Ces analyses concernent généralement des individus à phénotype normal Les individus anormaux sont éliminés par les éleveurs Les anomalies détectées sont généralement équilibrées Aujourd’hui Comme chez l’Homme, peuvent être responsables d’anomalies congénitales, d’infertilité, de cancer…  Pertes économiques potentiellement importantes Quelques laboratoires principalement en Europe réalisent des contrôles systématiques (Ducos et al., 2008)

14 ATC le 10/09/2014 Résultats dans l’espèce bovine

15 ATC le 10/09/2014 Résultats dans l’espèce bovine  Rob 1/29 Obligation de tester les taureaux avant IA  Baisse de la fertilité entre 3 and 5% (Gustavsson, 1969, 1971; Refsdal, 1976; Logue and Harvey, 1978; Dyren-dahl and Gustavsson, 1979; King et al., 1980, 1981; Popescu 1980; Schmutz et al., 1991; Wilson, 1991; Lonergan et al.,1994)  1700 analyses par an

16 ATC le 10/09/2014 Résultats dans l’espèce bovine  Freemartinisme Le freemartin est une femelle presque toujours stérile née d’une naissance gémellaire hétérosexuée. Cette anomalie apparait dans 90% des naissances comportant au moins un mâle et une femelle. Le diagnostic de freemartinisme est réalisé par la recherche de chimérisme leucocytaire XX/XY résultant de l’anastomose placentaire entre les jumeaux hétérosexués.

17 Cattle  Autres anomalies Rcp(8;9) Rcp(1;15) Rcp(7;7) mosaic 10.7 % Inv (29) 2n=60,XY; 61,XXY (16%) ATC le 10/09/2014 Résultats dans l’espèce bovine Principales anomalies identifiées : ±20rcp, 7inv, 50Rob ±5 trisomies autosomales Aneuploïdies des chromosomes sexuels XXY, XY/XYY, XXX

18 Environ 400 analyses par an ATC le 10/09/2014 Résultats “sangliers”

19 ATC le 10/09/2014 Résultats “chevaux” Analyse de femelles présentant des problèmes de reproduction Principales anomalies identifiées : ±10 rcp ±10 trisomies autosomales Aneuploidies des chromosomes sexuels X0, XXX, XXY, XX/XY, XX sex reversal, XY sex reversal

20 ATC le 10/09/ , X0 / 65, XYY dans un cas de pseudohermaphrodisme mâle Paget et al. (2001) Résultats “chevaux”

21 ATC le 10/09/2014 Résultats “chiens”

22 ATC le 10/09/2014 Cytogénétique dans l’espèce porcine

23 ATC le 10/09/2014 Introduction: historique rapide Initiation du contrôle chromosomique à grande échelle dès : J. Rech. Porcine, 29, Présentation des objectifs, des premiers résultats 2002 : J. Rech. Porcine, 34, Résultats : J. Rech. Porcine, 39, Résultats : J. Rech. Porcine, 44, Résultats

24 ATC le 10/09/2014 Introduction: motivations Anomalies chromosomiques: acquises (cancers …) constitutionnelles (malformations, problèmes de reproduction) Anomalies déséquilibrées (ex : trisomies) Anomalies équilibrées (structure)

25 Anomalies de structure constitutionnelles équilibrées Chez les hétérozygotes  troubles de la reproduction ♂ ♂ et ♀ Perturbation de la spermatogenèse (azoospermie, oligozoospermie)  Qualité de semence dégradée Production de gamètes déséquilibrés Baisse de la prolificité des conjointes de verrats porteurs -40% en moyenne (de -10% à -100%) pour les t. réciproques Conséquences économiques importantes ! Introduction: motivations ATC le 10/09/2014

26 Introduction: motivations

27 ATC le 10/09/ verrat / 200 porteur d’anomalie Coût de la détection d’une anomalie : 200 x 60 € = € Coût du contrôle Coût de l’absence de contrôle 1.Coût direct : perte de porcelets (- 4 porcelets par portée) LW / LF 90 doses / mois (  110) 40 portées / mois P 190 doses / mois (  220) 80 portées / mois Utilisation des verrats pendant 4 mois (le temps de constater l’hypoprolificité) 160 portées produites manque 640 porcelets ~ € 320 portées produites manque 1280 porcelets ~ € 2.Coût indirect : diffusion de l’anomalie 50% des descendants d’un porteur d’anomalie sont eux-mêmes porteurs de l’anomalie ! La diffusion est potentiellement massive ! Introduction: motivations

28 ATC le 10/09/2014 Organisation de la filière porcine Très large utilisation de l’ Insémination Artificielle (IA)  Potentielle dissémination des anomalies chromosomiques  Mise en place d’un contrôle chromosomique IFIP, 2008 Matériels et méthodes:

29 90% jeunes verrats de race pure (6-10 mois) 3% verrats hypoprolifiques 7% analyses familiales 90% de ces animaux: 3 organismes de sélection Cytogénétique classique (GTG) and FISH ATC le 10/09/2014 Leica GSL120

30 ATC le 10/09/2014 Résultats Plus de individus analysés à ce jour (1700/an) 169 anomalies de structure29 anomalies des chromosomes sexuels

31 ATC le 10/09/2014 Résultats Le plus important… La fréquence des anomalies de structure équilibrées: 0,47% Plus de 86% sont des translocations réciproques (baisse de prolificité de 40% en moyenne)

32 ATC le 10/09/2014 Recherche : analyse des effets des anomalies sur la reproduction Plateforme de Cytogénétique

33 ATC le 10/09/2014 Anomalies de structure constitutionnelles équilibrées Chez les hétérozygotes  troubles de la reproduction ♂ ♂ et ♀ Perturbation de la spermatogenèse (azoospermie, oligozoospermie)  Qualité de semence dégradée Production de gamètes déséquilibrés Introduction:

34 ATC le 10/09/2014 Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques 0,5% chez le porc

35 ATC le 10/09/2014 Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques Ségrégation alterne

36 ATC le 10/09/2014 Facteurs influençant le comportement méiotique : Chromosomes impliqués Taille des fragments transloqués… Sexe Fond génétique Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques

37 ATC le 10/09/2014 rcp (12;14)(q13;q21) rcp (3;15)(q27;q13) SSC12 SSC14 der14der12 SSC 3SSC 15 der 15 der 3 Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques

38 ATC le 10/09/2014 Mâles : alternate/ adjacent 1adjacent 23:1diploïd/4:0 adjacent-1alternate/adjacent-1 adjacent-2 3:1 alternate Femelles : Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques

39 Effet du sexe sur la ségrégation méiotique Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques ATC le 10/09/2014

40 Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques ATC le 10/09/2014 Pas de variabilité inter- ou intra-individuelle

41 Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques ATC le 10/09/2014 Porcelet avec un caryotype déséquilibré 2n=38, XX (ou XY), der16 t(3;16)(q23;q22) Verrat transloqué t(3;16)(q23;q22) and palatoschisis (fentes palatines) Ducos et al., 2004

42 Production de gamètes déséquilibrés: translocations Robertsoniennes ATC le 10/09/2014 déséquilibréséquilibrés der(13;17) AlterneAdjacente 3:0 0,013% chez le porc

43 Production de gamètes déséquilibrés: translocations Robertsoniennes ATC le 10/09/2014

44 Production de gamètes déséquilibrés: inversions ATC le 10/09/ %-0,06% chez le porc Inversion Péricentrique Inversion Paracentrique

45 ATC le 10/09/2014 Production de gamètes déséquilibrés: inversions SSC2 normalSSC2 inversé région inversée : 36 % p1.1 q2.1 SSC2 normalSSC2 inversé région inversée : 23 % SSC2 normalSSC2 inversé région inversée : 8 % p1.1 q1.1 inv(2)(q1.3;q2.5) inv(2)(p1.1;q2.1)inv(2)(p1.1;q1.1) inv(1)(q1.2;q2.4)inv(1)(p2.1;q2.10)inv(1)(p2.4;q2.9) *** SSC1 inverséSSC1 normal SSC1 inversé région inversée : 20 % région inversée : 71 % région inversée : 85,5 %

46 ATC le 10/09/2014 Production de gamètes déséquilibrés: inversions

47 ATC le 10/09/2014 Taux de gamètes recombinés <5% Production de gamètes déséquilibrés: inversions

48 ATC le 10/09/2014 Troubles de la spermatogenèse Anomalies de structure constitutionnelles équilibrées Chez les hétérozygotes  troubles de la reproduction ♂ ♂ et ♀ Perturbation de la spermatogenèse (azoospermie, oligozoospermie)  Qualité de semence dégradée Production de gamètes déséquilibrés

49 ATC le 10/09/2014 Des anomalies du spermogramme sont observées dans 50% des couples infertiles (Huynch et al., 2002) La prevalence des anomalies chromosomiques est plus élevée chez les hommes presentant des spermogrammes anormaux (21X, azoospermies ; 7X oligospermies) (Mau-Holzmann, 2005) Troubles de la spermatogenèse

50 ATC le 10/09/2014 Les remaniements peuvent conduire à des anomalies de la méiose responsables de troubles de la spermatogenèse (Van Assche 1996; Martin, 2008) 1) Association des chromosomes remaniés avec le bivalent XY:  propagation de l’inactivation du chromosome X aux segments autosomiques associés (Jaafar et al., 1993)  transcription de gènes du chromosome X (Lifschytz and Lindsley, 1972) 2) Présence des protéines BRCA1, ATR and  H2AX sur les régions non appariées et génétiquement réprimées (Turner et al., 2005 ; Homolka et al., 2007, 2012) Troubles de la spermatogenèse

51 ATC le 10/09/2014 Troubles de la spermatogenèse

52 ATC le 10/09/2014 Troubles de la spermatogenèse rcp(7p+;13q-) (Gustavsson et al., 1988) (Oliver-Bonet et al., 2004) anomalies d’appariement des chromosomes en particulier dans les régions des points de cassure (Luciani and Guichaoua, 1990) association des régions non appariées avec le bivalent sexuel apparié uniquement par les régions pseudo-autosomale

53 ATC le 10/09/2014 Troubles de la spermatogenèse

54 ATC le 10/09/2014 Troubles de la spermatogenèse  Présence des protéines BRCA1, ATR and  H2AX sur les régions non appariées et génétiquement réprimées (Turner et al., 2005 ; Homolka et al., 2007, 2012) Turner et al. 2005

55 ATC le 10/09/2014 Troubles de la spermatogenèse : translocation Y/1 chez le porc

56 ATC le 10/09/2014 RNA/DNA FISH Troubles de la spermatogenèse : translocation Y/1 chez le porc

57 ATC le 10/09/2014 Troubles de la spermatogenèse : verrat 38,XY/39,XXY - cellules XXY dans le testicule mais seulement les cellules XY entrent en division de méiose -Méiose perturbée: spermatogenèse anormale  environnement testiculaire inapproprié

58 ATC le 10/09/2014 Oligo-, Astheno-, Térato-spermique ( /ml) Spermatogenèse fortement perturbée Troubles de la spermatogenèse : translocation 1/14 chez le porc

59 ATC le 10/09/2014 Troubles de la spermatogenèse : translocation 1/14 chez le porc SCP1+SCP3 SCP3 γH2AX Centro Q + NO T + A SSC1 SSC14 der1 der14 Poster H. Barasc

60 ATC le 10/09/2014 Troubles de la spermatogenèse : translocation 1/14 chez le porc SSC1: 293,925,712 der14 SSC1 der1 SSC1, BAC CH E5 SSC14: 148,080 der14 der1 SSC14 SSC14, BAC SBAB-234D5 Poster H. Barasc

61 ATC le 10/09/2014 Troubles de la spermatogenèse : translocation 1/14 chez le porc der 1: PCR entre les primers 1 4 der 14: PCR entre les primers 32

62 PERSPECTIVES ATC le 10/09/2014 Plateforme de Cytogénétique

63 ATC le 10/09/2014 Identification de remaniements chromosomiques et étude de leurs effets sur la reproduction Analyse de nouveaux cas identifiés lors du contrôle sur la plateforme  donner un conseil plus documenté aux éleveurs Analyse des effets des anomalies

64 Analyse de la recombinaison et de l’interférence chez le porcs(N. Mary) Acquisition de données de référence, étude de l’effet de la race, de l’âge… A partir de ces données, analyser les effets des anomalies chromosomiques sur la recombinaison Analyse de la recombinaison méiotique ATC le 10/09/2014

65 Analyse de la recombinaison méiotique MLH1 SCP3 Centromeres

66 Analyse de l’infertilité mâle (génétique et épigénétique) Analyse CGH de verrats présentant des qualités de semence dégradées 1895 CNVs detectés  plus de délétions que de duplications Corrélation nombre de délétions/concentration

67 Caractérisation des points de cassure  séquençage verrats transloqués Analyse des intéractions des régions de points de cassure au cours de la méiose Analyse des points de cassure

68 Merci de votre attention ATC le 10/09/ Plateforme de Cytogénétique


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