Animal-Modèles Animaux et Produits Animaux

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1 Animal-Modèles Animaux et Produits Animaux
JOURNEE de la RECHERCHE 07 MAI-2009 Claire Gaiani, Yves Le Roux

2 Entretiens Lipidomix : T. Pillot LSGC : I. Chevalot, J.L. Goergen, A. Marc URAFPA : C. Feidt, G. Rychen LAE : B. Amiaud, F. Bourgaud LSE : J. Cortet, C. Schwartz LIBIO : C. Sanchez, M. Linder, E. Arab Tehrany

3 Plusieurs Laboratoires, pour plusieurs problématiques
BioProcédés LSGC Valorisation des co-produits et structuration moléculaire LIBIO Fonctionnalité de Molécules (positive ou négative) URAFPA/LIBIO/LIPIDOMIX/LSGC Prévention pathologies neurodégénératives LIPIDOMIX Pratiques Agricoles et Biodiversité LSE/LAE

4 Quels Outils ? Cellules, Tissus d’origine animale Animal
In vitro cultures cellulaires : primaires, lignées Cérébrale, intestinales, adipeuse, mammaire VERO, CHO, Cellules Souches Ex vivo (tissus, organes) Intestinale Animal Modèles pour l’homme porc, rat, souris Animaux de rentes lait, viande, œuf (bovin, caprins, avins, poissons) Animaux : Marqueur de biodiversite ou bioindicateurs de pollution des sols (nématodes, collemboles) Produits Animaux - Lait, produits de la mer, viande

5 BIOPROCEDES (LSGC)

6 Production de molécules par des cellules animales
BioProcédés Production de molécules par des cellules animales * Effet des conditions de milieu et de culture - Interferon : effet sur le niveau de glycosylation (CHO…) * Ingénierie tissulaire - Régénération de ligament Recherche de molécules à activité biologique/optimisation de procédés * peptides de colza * extraits de levures Optimisation du milieu de culture (milieu sans sérum, sans prot animales…)

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9 Améliorer des critères de performance
Chaîne Polypeptidique Chaînes Glycanniques Catalyseurs : cellules génétiquement améliorées Produits : protéines glycosylées actives et non immunogènes Procédé de production cuves agités réacteurs membranaires fermés, continus, perfusés milieux réactionnels (milieux de culture) complexes C.H.O. hybridomes VERO … Interféron E.P.O. anticorps Améliorer des critères de performance (rendement, qualité, productivité…)

10 Densité cellulaire, 105 cellules/mL
Etude de la glycosylation d’une protéine à usage thérapeutique, IFN-, au cours des cultures de cellules CHO Temps, heures Densité cellulaire, 105 cellules/mL Glycoformes, % IFN-g 0N IFN-g 1N IFN-g 2N Cellules viables IFN-g 2N IFN-g 1N IFN-g 0N Dans l’industrie il est important d’avoir des produits de bonne qualite et de qualite constante. On constate sur cette diapo que la glycosylation de l’IFN-g diminue au cours du temps pour cette culture (le pourcentage de la forme 2 fois glycosylée, appelee 2N, diminue) Notre travail consiste à essayer de comprendre pourquoi on a cette variation au cours du procede. Qualité variable au cours du temps Pourquoi ?

11 DEMARCHE EXPERIMENTALE
MILIEUX DE CULTURE RPMI sans sérum (« pauvre ») PF-BDM sans sérum (« riche ») MODES DE CULTURE Discontinu Semi-continu CELLULES CHO CARACTERISATION DE LA GLYCOSYLATION DE L’IFN-g ENVIRONNEMENT EXTRACELLULAIRE Substrats énergétiques (glucose, glutamine) Métabolites toxiques (lactate, ions ammonium) Production d’IFN-g Croissance cellulaire PRECURSEURS OLIGOSACCHARIDIQUES PARAMETRES INTRACELLULAIRES Analyse qualitative et quantitative des glycannes NUCLEOTIDES ET NUCLEOTIDES-SUCRES CHARGE ENERGETIQUE Cette diapo explique la demarche : on fait varier le milieu de culture (en haut à gaughe), le mode de culture (haut, droite)et on regarde ensuite l’effet sur la glycosylation. Lorsqu’on a une variation de cette glycosylation, on va regarder comment les cellules se comportent (comment elles poussent, meurent, combien on produit d’IFN, ce qu’elles consomment et produisent comme catabolites toxiques) (en bas à gauche) mais egalement les parametres intracellulaires qui sont affectes (en bas à droite) tels que les concentrations intracellulaires des precurseurs des glycannes et les precurseurs de ces precurseurs c’est-à-dire les nucleotides sucres et la charge energetique (qui n’est pas un precurseur mais qui conditionne l’etat physiologique des cellules).

12 Impact des peptides sur la croissance de cellules eucaryotes (CHO-IFN)
Référence Alcalase à 4 g/l Suivi par analyse d’images Système non invasif et micro-échelle T=0 T=96h Amélioration densit cellulaire, aspect T=240h

13 Valorisation des co-produits et structuration moléculaire
(LIBIO)

14 Valorisation des co-produits et Structuration moléculaire
LAIT Ingrédients laitiers protéines, lipides, lactose, minéraux stabilisation par séchage POUDRE complexes supramoléculaires GA, pectine… Interactions Mécanismes dynamiques de structuration Structures Modélisation Complexes supramoléculaires GA/BLG Mésomodélisation Cryo-MET

15 Valorisation des co-produits et Structuration moléculaire
LAIT Ingrédients laitiers protéines, lipides, lactose, minéraux stabilisation par séchage POUDRE réactivité de surface Propriétés fonctionnelles Dynamique de réhydratation, mouillage, agrégation… Relations structure/fonction Particule laitière observée par MCBL Particule laitière observée par XPS NPC NPC+UF NPC+LAC 5 10 15 20 25 lactose en surface (%) 40 60 80 temps de mouillage (s) relation entre réactivité de surface et propriétés techno-fonctionnelles

16 Valorisation des co-produits et Structuration moléculaire
SAUMONS Phospholipides marins Nanovecteurs potentiels Extraction Purification Association biomolécules Dynamique moléculaire d’une bicouche phospholipidique phospholipide marin DHA phosphate Ac. Stéarique choline Fluidité du système Diffusion d’eau dans la bicouche Interactions entre constituants (CHARMM 27, NAMD 2.6) Simulation bicouche

17 Valorisation des co-produits et Structuration moléculaire
SAUMONS Phospholipides marins Nanovecteurs potentiels Extraction Purification Association biomolécules Le transfert de molécule active à travers la bicouche du liposome   Adsorption de la molécule active à l’interface interne de la bicouche liposome Diffusion à travers la bicouche Désorption 3 phénomènes de transfert étudiés Désorption : organe, peau, entre en réaction avec son environnement, effet médical, nutritionnel, toxique

18 Fonctionnalité de Molécules (positive ou négative)
(URAFPA/LIPIDOMIX/LIBIO/LSGC)

19 Fonctionnalité négative
Fonctionnalité : capacité d’une molécule à intervenir sur les fonctions de l’organisme, pour en moduler l’activité « Tout bénéfice physiologique, que ce soit en termes de réduction du risque d’apparition de troubles chroniques ou d’optimisation de l’état de santé» Fonctionnalité positive Fonctionnalité négative « Peut potentiellement affecter négativement n’importe quelle fonction de l’organisme » * Bioaccessibilité : capacité à se rendre disponible (si aliment : absorption intestinale; métaux, antioxydant…) * Biodisponibilité : fraction d’une molécule atteint sa cible (via la circulation sanguine ou non pour aller vers sa cible, peptides, lipides) * Bioefficacité (toxicité) : mesure in vivo d’une activité biologique Echelle d’approche : Cellule/Organes/Animal

20 Labyrinthe en Croix Surélevé (LCS)
Démonstration de l’activité biologique Activité anxiolytique : a-Casozépine (peptide du lait) 165 s – 135 s Labyrinthe en Croix Surélevé (LCS) 50 s – 60 s TEMPS PASSE EN BRANCHE OUVERTE (S) N=15 P<0,05 1 mg/kg 0,79 µmol/kg 0,7 mg/kg 0,79 µmol/kg 1 mg/kg

21 Bioefficacité de a-Casozépine
BARRIERES PHYSIQUES et ENZYMATIQUE Estomac- Suc gastrique Pancréas- Suc pancréatique Intestin grêle- Epithélium intestinal Peptidases membranaires de la bordure en brosse Hémato-encéphalique Bioefficacité de a-Casozépine Mécanisme d’action ? Ojectifs du travail

22 Modèles de biodisponibilité intestinale
- Lipides, peptides, mélanges nanostructurés, Polluants… Caco-2 Chambre de Ussing Apical basal

23 Modifications des propriétés de molécules bioactives
(Acylation, Vectorisation) Résistance à l’hydrolyse ? Augmentation du Transfert ? Biodisponibilité Acylation Influence du milieu Faible réactivité Lys-Ser O H2N CH C NH CH CHIMIOSELECTIVITE COOH (CH2)4 CH2 N-acylation NH2 OH O-acylation EFFICACITE Biomolécules intégrées dans des nanoémulsions

24 Sécurité sanitaire des aliments
EVALUATION RISQUE Sites et sols pollués Site soumis à autorisation Produits animaux Modalités d’élevage Exposition Caractérisation Scénarios prédictifs Biodisponibilité des polluants GESTION RISQUE

25 Résultats In Vivo Pour le Plomb

26 [Pb] dans le rein µg/kg DM
Dose-Réponse Dose-réponse pour le plomb pour différents sols : cas du rein [Pb] dans le rein µg/kg DM Dose (µgPb/KgBW/day)

27 Facteurs de transfert déterminés après consommation de foin d’Albertville par 3 chèvres en lactation pendant 72 j Concentration dans le lait de congénères PCDD

28 BIOMARQUEURS-BIOINDICATEURS
(LSE)

29 Utiliser la faune du sol pour évaluer la restauration des sols contaminés
Utilisation des Nématodes pour caractériser l’évolution de sols anciennement contaminés par une cokerie 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 May 07 April 08 September 08 Abondance nématodes Ind / g MS Terre Désorbée Terre Nue

30 Domaine Expérimental de la Bouzule
100 VL (robot de traite) 40 places en ingestion individuelle Vaches Fistulées Etang et station aquacole (12 bassins) Animalerie ENSAIA/URAFPA *12 places individuelles porc *48 places individuelles poules *6 places individuelles caprins/ovins

31 Prévention des pathologies neurodégénératives
(LIPIDOMIX) Approche préventive/curative - Nutritionnelle * Métabolisme lipidique - Médicamenteux * Injection de Lipide endogène - Thérapie cellulaire * Injection de cellules productrices de neurotrophine Echelle d’approche : Cellule/Animal Pas de test clinique

32 (docosahexaenoic acid)
Neuroprotection par des lipides : le DHA (docosahexaenoic acid) CTRL 100 p < 0.001 80 Cell viability (% of control) 60 Aβ 40 20 DHA + Aβ DHA (nM) 5 + Aβ

33 Démonstration In vivo Amélioration de la mémoire court terme
mémoire long terme

34 QUELLES INTERACTIONS ENTRE LES PROBLEMATIQUES ???

35 Valorisation Co-produits
Conditions de milieu BioProcédés Valorisation Co-produits Structuration moléculaires Production de molécules d’intérêt Interféron g , vaccin, ligament Toxicité, Criblage (Colza, extrait Levure) Vectorisation de molécules - Greffage (acylation) Encapsulation Mélange nanostructuré Cellules Organes Organismes Produits animaux Prévention maladie Neurodégénérative Nutritionnelle Médicamenteuse Thérapie cellulaire Fonctionnalité positive Peptides anxiolytiques, lipides, flavonoïdes Périphérique, cérébral Fonctionnalité Négative Transfert Biodisponibilité Bioaccessibilité Mécanisme d’action Chaîne alimentaire HAP, PCB, ETM, Dioxine, Pesticide Neurotoxicité Bioefficacité démontrée

36 QUELLES INTERACTIONS ENTRE LES LABORATOIRES ???

37 Structure molécules BioProcédés Prévention Vectorisation
LSGC LIBIO LIPIDOMIX Vectorisation Fonctionnalité + URAFPA Fonctionnalité - Biodisponibilité Toxicité Bioindicateurs Biodiversité LAE LSE