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Étude du transporteur MRP1 : caractérisation des NBD, et étude de modulateurs conduisant à la mort des cellules surexprimant le transporteur Soutenance.

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1 Étude du transporteur MRP1 : caractérisation des NBD, et étude de modulateurs conduisant à la mort des cellules surexprimant le transporteur Soutenance de thèse de M. Thomas PERROTTON Directeur de thèse : Dr. Hélène CORTAY 14 Décembre 2007 – 14h30 Laboratoire des Protéines de Résistance aux Agents Chimiothérapeutiques Dr. Attilio DI PIETRO Institut de Biologie et Chimie des Protéines

2 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP2 SOMMAIRE II.RESULTATS 1.Caractérisation fonctionnelle des NBD 2.Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 3.Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil III.CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES I.RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES 1.Le cancer : un enjeux sociétal et économique 2.Le phénotype de résistance des cancers 3.Les transporteurs ABC 4.Le transporteur de multiples drogues MRP1 5.Les modulateurs de MRP1

3 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP3 I.RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES 1.Le cancer : un enjeux sociétal et économique 2.Le phénotype de résistance des cancers 3.Les transporteurs ABC 4.Le transporteur de multiples drogues MRP1 5.Les modulateurs de MRP1

4 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP4 1.Le cancer : un enjeu sociétal et économique

5 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP5 TYPE DE COUTS EVALUATION (k) Impacts immédiats et indirects de la maladie Impact de la maladie sur la vie des personnes Années potentielles de vie perdues (en années) ~ Perte de production Perte de productivité du fait darrêts maladie Perte de productivité du fait de mortalité Coûts de la lutte contre le cancer pour lÉtat et lAssurance Maladie Le coût des soins Politique de prévention primaire à la lutte contre les cancers Tabac Alcool Nutrition/exercice physique Dépistages organisés Cancer du sein Cancer colorectal Recherche publique « Analyse économique des coûts du cancer en France », Institut national du cancer, 10 avril 2007 (dossier de presse) 1.Le cancer : un enjeu sociétal et économique

6 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP6 2.Le phénotype de résistance des cancers 1. Inactivation moléculaire 2. Anomalies de réponses (apoptose, augmentation de la réparation de lADN) 3. Altération de la cible moléculaire (ADN topoisomérases) 4. Efflux actif en dehors de la cellule (transporteurs ABC) Un échec majeur des chimiothérapies, dû au traitement par des médicaments Résistance croisée à de nombreux agents chimiothérapeutiques

7 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP7 3.Les transporteurs ABC Généralités Une très large famille de protéines Présents des microorganismes à lHomme Une séquence hautement conservée : ATP Binding Cassette Une classification unique (HUGO) : homologie structurale Trois transporteurs ABC impliqués dans le phénotype MDR: P-gp/ABCB1 (Glycoprotéine-P) MRP1/ABCC1 (Multidrug Resistance Protein 1) BCRP/ABCG2 (Breast Cancer Resistance Protein)

8 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP8 TransporteurNomenclatureMaladie MDR1, MRP1, BCRPABCB1, ABCC1, ABCG2Cancer CFTRABCC7Mucoviscidose ABC1ABCA1 Maladie de Tangier et déficience familiale en HDL MRP2ABCC2 Syndrome de Dubin- Johnson SUR1, SUR2ABCC8, ABCC9 Hyperinsulinisme familial Les pathologies associées aux transporteurs ABC Des transporteurs impliqués dans de nombreuses fonctions physiologiques Des mutations associant souvent ces transporteurs à des maladies 3.Les transporteurs ABC

9 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP9 Topologie générale des transporteurs ABC Une topologie générale 2 domaines transmembranaires (TMD) : reconnaissent les substrats 2 domaines de fixation des nucléotides (NBD) : fournissent lénergie 3.Les transporteurs ABC

10 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP10 Des motifs inclus dans les NBD très conservés Motif A de Walker Motif B de Walker Motif C, signature des ABC Les domaines de fixation des nucléotides ou NBD 3.Les transporteurs ABC

11 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP11 Higgins CF, et al. (2004)Nat Struct Mol Biol 11(10): Les différentes étapes du transport dun substrat par un transporteur ABC 3.Les transporteurs ABC

12 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP12 4.Le transporteur de multiples drogues MRP1 TMD1 TMD2TMD3 NBD1NBD2 Une topologie originale de MRP1 Un domaine transmembranaire supplémentaire en position N-terminale

13 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP13 Des NBD originaux au fonctionnement asymétrique Des différences structurales Une asymétrie fonctionnelle des NBD de MRP1 La structure de NBD1 a été résolue Ramaen O, et al. (2006) J Mol Biol 359: Conformation non productive du site catalytique Peut expliquer la régulation entre NBD1 et NBD2 4.Le transporteur de multiples drogues MRP1

14 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP14 ComposésExemples Antinéoplasiquesmethotrexate, doxorubicine, étoposide, vincristine, vinblastine, paclitaxel AntivirauxSaquinavir, ritonavir AntibiotiquesDifloxacine, grepafloxacine MetalloïdesArsénite, arséniate, antimoine Sondes fluorescentesCalcéine, Fluo-3, BCECF, SNARF ToxinesAflatoxine B 1 Conjugués à des glucuronides Etoposide-Gluc Conjugués au GSHLeucotriène C 4, prostaglandine A 2 -SG Conjugués à des glucuronides 17β-Estradiol-17-β-D-Gluc, glucuronosylbilirubine Conjugués à des sulfatesEstrone-3-sulfate PeptidesGSH, GSSG Médicaments xénobiotiques Médicaments xénobiotiques conjugués Composés naturels Une grande diversité de substrats transportés 4.Le transporteur de multiples drogues MRP1 Transports danions organiques transports de substrats conjugués: GSH, glucuronates, sulfonates Co-transport de substrats avec du GSH

15 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP15 NBD1NBD2 Extracellulaire Intracellulaire ATP ADP+Pi 1.Transport du GSH et du GSSG 2.Transport du LTC 4 3.Transport de lestrone sulfate 4.Transport de la vincristine 5.Effet du vérapamil NBD1 NBD2 Différents mécanisme de transport Vérapamil GSH GSSG Vincristine LTC 4 Estrone sulfate GSH 4.Le transporteur de multiples drogues MRP1

16 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP16 5.Les modulateurs de MRP1 Classe des composésComposés Analogues des leucotriènesMK571 StéroïdesZK112993, LY Bloqueurs de canaux calciquesVérapamil, PAK-104P, nicardipine, NIK 250 Nucléotides antisensISIS-7597 CyclosporinesCyclosporine A, PSC833 FlavonoïdesGénistéine, quercitine DiversProbénécide, VX-710, MS-209, difloxacine, GF109203X, indométhacine, dipyridamole, LY Un objectif : contrecarrer la chimiorésistance Une stratégie : inhiber le transporteur Des solutions : flavonoïdes et vérapamil Pourquoi rechercher des modulateurs pour MRP1?

17 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP17 Caractériser la fonctionnalité et limplication des NBD vis-à-vis des nucléotides, substrats et modulateurs Étudier les énantiomères du vérapamil, comprendre leur activité Déterminer de nouvelles structures efficaces, et comprendre pourquoi LES OBJECTIFS DE CES TRAVAUX Mieux comprendre le fonctionnement moléculaire de MRP1 Analyser une nouvelle stratégie de lutte contre la chimiorésistance induite par MRP1 Améliorer les modulateurs actifs

18 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP18 I.RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES 1.Le cancer : un enjeux sociétal et économique 2.Le phénotype de résistance des cancers 3.Les transporteurs ABC 4.Le transporteur de multiples drogues MRP1 5.Les modulateurs de MRP1 II.RESULTATS 1.Caractérisation fonctionnelle des NBD 2.Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 3.Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil

19 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP19 II.RESULTATS 1.Caractérisation fonctionnelle des NBD

20 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP20 1.Caractérisation fonctionnelle des NBD Asymétrie fonctionnelle des NBD de MRP1 Rôle de cette asymétrie encore inconnue Changements conformationnels induits par lATP sur les NBD : transfert dinformation vers les TMD Interaction de flavonoïdes avec les NBD de MRP1 Généralités Trompier D, et al. (2003) Cell Mol Life Sci. 60(10): Conseil G, et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 18;95(17): Interaction des substrats et modulateurs sur les NBD ? Propriété de fixation des nucléotides sur les NBD ?

21 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP21 8N 3 AXP (µM) ,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 mol probe / mol protéine Nucléotides et NBD : interaction et modifications conformationnelles NBD2 8-azido-[α-32P]ATP NBD2 8-azido-[α-32P]ADP NBD1 8-azido-[α-32P]ATP NBD1 8-azido-[α-32P]ADP NBD seul + ATP-Mg + ADP-Mg NBD1 NBD2 Fort marquage par lATP sur NBD1, faible pour lADP Faible marquage sur NBD2 LATP et lADP modifie laccessibilité des Trp de NBD1 Seul lADP modifie laccessibilité de NBD2 1.Caractérisation fonctionnelle des NBD

22 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP22 Fixation du LTC 4 et du MK571 NBD1 NBD2 NBD1 NBD2 Fixation du LTC 4 sur les deux NBD Fixation du MK571 sur les deux NBD NBD1 K d = 5.8 ± 0.4 µM NBD2 K d = 8.2 ± 0.7 µM NBD1 K d = 6.0 ± 1.3 µM NBD2 K d = 3.9 ± 1.6 µM 1.Caractérisation fonctionnelle des NBD

23 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP23 AB Les NBD et le NMeOHI 2 NBD1 seul 30 µM NMeOHI2 + 2 mM ATP-Mg NBD1 NBD2 NBD seul 10 µM NMeOHI2 30 µM NMeOHI2 Modification de laccessibilité des Trp de NBD1 par le NMeOHI 2 Modification différente de lATP Interaction au même site que le MK571 1.Caractérisation fonctionnelle des NBD

24 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP24 Changements conformationnels induits par les substrats et modulateurs NBD seul 30 μM docetaxel 30 μM vincristine 30 μM vinblastine 5 mM GSH 5 μM LTC4 NBD1NBD2 Tous les composés modifient laccessibilité des Trp de NBD1 Seuls le GSH et le LTC 4 modifient laccessibilité des Trp de NBD2 1.Caractérisation fonctionnelle des NBD

25 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP25 Conclusions résultats 1 NBD1 NBD2 ATP LTC4 MK571 NMeOHI 2 LTC4 MK571 NMeOHI 2 Vincristine Vinblastine GSH LTC 4 Vincristine Vinblastine GSH LTC 4 MK571 NMeOHI 2 LTC4 MK571 NMeOHI 2 GSH LTC 4 GSH LTC 4 Interaction Modifications Conformationnelles Modifications Conformationnelles Modifications Conformationnelles Modifications Conformationnelles

26 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP26 Conclusions résultats 1 Les nucléotides et les NBD: Comportement intrinsèque asymétrique vis-à-vis des nucléotides Changements conformationnels pouvant expliquer le rôle de chaque NBD dans le mécanisme catalytique Les domaines recombinants sont fonctionnels Les substrats/modulateurs et les NBD: Participation des NBD à la fixation des substrats et modulateurs? Validation par dautres techniques (photomarquage, mutagenèse, …)

27 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP27 II.RESULTATS 1.Caractérisation fonctionnelle des NBD 2.Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1

28 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP28 * Un dérivé diphénylalkylamine Inhibiteur des canaux calciques de type L (cœur) Utilisation en thérapeutique: hypertension, arythmie Lénantiomère S est pharmacologiquement efficace Lénantiomère S est beaucoup plus vite métabolisé Le vérapamil 2.Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1

29 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP29 Trompier D, et al. (2004) Cancer Res 64: Vérapamil Fuite massive du GSH intracellulaire Mort des cellules surexprimant MRP1 par apoptose Effet du vérapamil sur MRP1 Low DW, et al. (2000) J Pharmacol Exp Ther 293(2): Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Vérapamil Cellules BHK-21 Cellules BHK-MRP1

30 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP30 Vérapamil: inhibiteur de référence de la glycoprotéine -P Même activité des énantiomères sur la glycoprotéine-P Les énantiomères : 60 milliards de dollars dépensés chaque année aux USA Effet physiologique différentiel des énantiomères de molécules Thalidomide Ibuprofène Le vérapamil et ses énantiomères et sur MRP1 …? 2.Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1

31 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP31 Seul le S-verapamil induit une cytotoxicité des cellules BHK-MRP1 Cytotoxicité des énantiomères du vérapamil vérapamil +/- vérapamil S vérapamil R vérapamil +/- vérapamil S vérapamil R BHK-21 BHK-21-MRP1 2.Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1

32 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP32 10 µM vérapamil +/- 5 µM vérapamil S 5 µM vérapamil R 10 µM vérapamil +/- 5 µM vérapamil S 5 µM vérapamil R BHK-21 BHK-21-MRP1 Effet des énantiomères du vérapamil sur le transport de GSH par MRP1 Leffet du S-vérapamil est plus fort en absence de lénantiomère R 2.Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1

33 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP33 0 µM vérapamil R 2 µM vérapamil R 4 µM vérapamil R BHK-21-MRP1 Effet du R-vérapamil sur lactivité du S-vérapamil Inhibition de type mixte de lisomère R sur lactivité de lisomère S 2.Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1

34 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP34 Effet des énantiomères du vérapamil sur le transport de calcéine Contrôle Verapamil R Verapamil S MK571 BHK21 Contrôle Verapamil R MK571 Verapamil S BHK21-MRP1 Aucun effet sur les cellules contrôles Les 2 énantiomères inhibent lefflux de calcéine 2.Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1

35 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP35 IC 50 (nM) de la vincristine R-vérapamil (µM) 0515 BHK-21 1,51 ± 0,41,48 ± 0,271,06 ± 0,38 BHK-MRP1 9,42 ± 0,232,87 ± 0,421,02 ± 0,18 BHK21 BHK21-MRP1 Réversion du phénotype MDR par le R-vérapamil 0 µM15 µM5 µM Le vérapamil R réverse le phénotype MDR induit par MRP1 2.Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1

36 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP36 Purification de MRP1 à laide des cellules BHK-MRP1 MRP1 SDS-PAGE 6%, Coomassie MW (KDa) MR P1 MW (KDa) Western Blot, Lumilight® Purification de MRP1 20 boites de 15 cm Ø ~ 200 µg Concentration ~ 0.07 µg/µl Dépôt de 1.5 µg de protéines purifiées 2.Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1

37 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP37 MRP1 seul 0.5 µM R-vérapamil 0.5 µM S-vérapamil Pas dasolectine0.2 % asolectine Changements conformationnels induits par les énantiomères du vérapamil Lasolectine modifie laccessibilité des Trp Les deux énantiomères induisent des changements conformationnels différents MRP1 seul K SV = 1.23 ± 0.15 M µM R-vérapamil K SV = 2.51 ± 0.17 M µM S-vérapamil fa = 0.45 MRP1 seul K SV = 1.46 ± 0.23 M µM R-vérapamil fa = µM S-vérapamil fa = Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1

38 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP38 R-vérapamil S-vérapamil Fixation du S- et R-vérapamil sur MRP1 purifiée Fixation du S et R-verapamil sur MRP1 R-vérapamil K d = 47.7 ± 4 nM S-vérapamil K d = 92.5 ± 5 nM 2.Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1

39 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP µM R-vérapamil MRP1 seul 0.05 µM R-vérapamil Effet du R-vérapamil sur la fixation su S-vérapamil, topologie des sites de fixation Modification de la fixation du S-vérapamil par le R-vérapamil 2.Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1

40 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP40 S-vérapamil MRP1 seul 0.5 mM GSH R-vérapamil Effet du GSH sur la fixation du S-vérapamil et du R-vérapamil Modification de linteraction des deux énantiomères avec MRP1 par le GSH Interdépendance entre les sites de fixation des énantiomères et du GSH 2.Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1

41 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP41 Effet des énantiomères du vérapamil sur lactivité ATPase De MRP1 purifiée 0.2 % asolectinePas dasolectine 5 mM GSH 1 µM S- ou R-vérapamil 0.8 mM vanadate Modification de lactivité ATPase par lasolectine Abolition des effets du GSH sur lactivité ATPase par le S-vérapamil, par deffet du R-vérapamil Activité basale : 2.11 ± 0.1 nmol/min/mgActivité basale : 16.2 ± 0.4nmol/min/mg 2.Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1

42 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP42 Conclusions résultats 2 - Effets biologiques différents: seul le S-vérapamil induit lefflux du glutathion, entraînant la mort cellulaire le R-vérapamil agit comme un inhibiteur de MRP1 - Les deux énantiomères ont des sites de fixation interdépendants INTÉRÊT DE CES RÉSULTATS = NOUVELLES STRATEGIES INTÉRÊT DE CES RÉSULTATS = NOUVELLES STRATEGIES Il faut choisir entre les deux énantiomères pour cibler MRP1 de manière plus efficace, et selon deux aspects: - Le R-vérapamil a deux avantages: il est peu cardiotoxique il réverse le phénotype MDR - Le S-vérapamil a lavantage de tuer spécifiquement les cellules susceptibles de devenir résistantes, par induction de lapoptose Il faut choisir entre les deux énantiomères pour cibler MRP1 de manière plus efficace, et selon deux aspects: - Le R-vérapamil a deux avantages: il est peu cardiotoxique il réverse le phénotype MDR - Le S-vérapamil a lavantage de tuer spécifiquement les cellules susceptibles de devenir résistantes, par induction de lapoptose Perrotton T, et al. (2007) J Biol Chem 26;282(43):

43 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP43 NBD1 NBD2 RS GSH S Vincristine Activité du S-vérapamil sur MRP1 1.Transport du GSH, et de la vincristine en co-transport avec le GSH 2.Fixation du S- vérapamil 3.Modification de la conformation de MRP1 4.Transport massif du GSH 5.Inhibition du transport de la vincristine Extracellulaire Intracellulaire ATP ADP+Pi

44 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP44 NBD1 NBD2 RS R GSH Vincristine 1.Transport du GSH et de la vincristine en co-transport avec le GSH 2.Fixation du R- vérapamil 3.Modification de la conformation de MRP1 4.Inhibition du transport de la vincristine et du GSH Activité du R-vérapamil sur MRP1 Extracellulaire Intracellulaire ATP ADP+Pi

45 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP45 NBD1 NBD2 RS Extracellulaire Intracellulaire ADP+Pi R S Sites de fixation des énantiomères du vérapamil La fixation du R-vérapamil sur MRP1 modifie la fixation du S-vérapamil Interdépendance des sites de fixation des énantiomères du vérapamil ATP

46 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP46 Conclusions résultats 2 Synthèse des énantiomères diiodés du vérapamil, pour une meilleure efficacité à plus faible concentration Etudier linfluence des énantiomères du vérapamil sur la fixation du glutathion sur MRP1, intérêt mécanistique Etudier linfluence du phénotype cellulaire sur lactivité du S- vérapamil Passer à un modèle animal

47 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP47 II.RESULTATS 2.Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 1.Caractérisation fonctionnelle des NBD 3.Relation structure/activité des dérivés iodés du vérapamil

48 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP48 3.Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil Composés Type de modification chimique 1234n VerapamilCH 3 OCH 3 -2 NMeOMeCH 3 -OCH 3 -2 NMeOMeICH 3 IOCH 3 -2 NMeOMeI 2 CH 3 IOCH 3 I2 NMeOHCH 3 -OH-2 NMeOHICH 3 IOH-2 NMeOHI 2 CH 3 IOHI2 Verapamil CCH 3 -OH-3 Verapamil CICH 3 -OHI3 Verapamil CI 2 CH 3 IOHI3 Verapamil DCH 3 -OH-1 Verapamil DICH 3 -OHI1 Verapamil DI 2 CH 3 IOHI1 NHOHH-OH-2 NHOHIHIOH-2 NHOHI 2 HIOHI2 Partie « ouest » Partie « est » Structure chimique des dérivés iodés du vérapamil

49 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP49 Composés IC 50 (µM) BHK-21-MRP1BHK-21 Verapamil10.6 ± NMeOMe17.2 ± ± 7.7 NMeOMeI4.7 ± ± 0.5 NMeOMeI ± ± 0.3 NMeOH11.7 ± ± 0.8 NMeOHI8.6 ± ± 0.9 NMeOHI ± ± 7.1 Verapamil C20.9 ± Verapamil CI9.3 ± ± 0.2 Verapamil CI ± ± 5.1 Verapamil D6.6 ± ± 1.6 Verapamil DI13.0 ± ± 0.3 Verapamil DI ± ± 2.6 NHOH38.1 ± NHOHI0.78 ± ± 0.3 NHOHI ± ± 0.5 Cytotoxicité des dérivés iodés du vérapamil Liodation augmente lefficacité des molécules en général 3.Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil

50 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP50 C VérapamilNHOHINMeOHI 2 Toxicité cellulaire du vérapamil et de deux dérivés actifs Trois composés intéressants F > 10F ~ 18F ~ 49 3.Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil

51 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP51 Effet des dérivés iodés du vérapamil sur le contenu cellulaire en GSH Effet de la taille du linker Effet de liodation 3.Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil

52 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP52 Conclusions résultats 3 Intérêts des modifications chimiques: Pas de bénéfice lors de modification linker Puissant effet de liodation CH3 OH: pas dintérêt sauf dans cas diodation Intérêt: synthétiser et étudier les énantiomères du NMeOHI 2 Etudier attentivement les résultats du dosage de GSH, ne pas se contenter de la toxicité cellulaire!

53 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP53 II.RESULTATS 1.Caractérisation fonctionnelle des NBD 2.Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 3.Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil I.RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES 1.Le cancer : un enjeux sociétal et économique 2.Le phénotype de résistance des cancers 3.Les transporteurs ABC 4.Le transporteur de multiples drogues MRP1 5.Les modulateurs de MRP1 III.CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

54 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP54 III.CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES Mieux comprendre le fonctionnement moléculaire de MRP1 Explication de lasymétrie des NBD dans leur séquences La différence de fixation des nucléotides peur expliquer les différentes étapes du cycle catalytique Les NBD ont la capacité de fixer le LTC 4 et le MK571 Le GSH, le NMeOHI 2, la vincristine et la vinblastine modifient laccessibilité des NBD Participation des NBD à la fixation des substrats? Intérêt mécanistique à confirmer par dautres techniques Intérêt mécanistique à confirmer par dautres techniques

55 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP55 III.CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES Analyser une nouvelle stratégie de lutte contre la chimiorésistance induite par MRP1 Améliorer les modulateurs actifs S-vérapamil : responsable de lefflux de GSH R-vérapamil : inhibiteur du transporteur Une nouvelle stratégie thérapeutique : aller plus loin, dautres modèles Une nouvelle stratégie thérapeutique : aller plus loin, dautres modèles Un intérêt majeur de lhalogénation des composés Un dérivé prometteur : le NMeOHI 2 Synthétiser les énantiomères du NMeOHI 2 : un espoir prometteur! Synthétiser les énantiomères du NMeOHI 2 : un espoir prometteur!

56 14 Décembre 2007Thomas PERROTTON - IBCP56 REMERCIEMENTS Le laboratoire du Dr. DI PIETRO, IBCP, Lyon Dr. Atillio DI PIETRO Dr. Hélène CORTAY Dr. Pierre FALSON Tous les membres du laboratoire et de lInstitut Plateau technique cytométrie en flux, IFR128, Lyon Chantal BELLA Odette DE BOUTEILLER Mayo Clinic, Scottsdale, USA Dr. Xiu-Bao CHANG Yue-Xian HU et Irène BEAUVAIS Département de Chimie Moléculaire, UJF, Grenoble Dr. Amaury DU MOULINET DHARDEMARE University of Cape Town Medical School, Cape Town, SOUTH AFRICA Dr. David MCINTOSH


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