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Développement de systèmes membranaires modèles pour la vacuole parasitophore de Toxoplasma gondii : Interactions des protéines GRA avec des vésicules unilamellaires.

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1 Développement de systèmes membranaires modèles pour la vacuole parasitophore de Toxoplasma gondii : Interactions des protéines GRA avec des vésicules unilamellaires Thèse de Doctorat en Physique soutenue par Pauline RUFFIOT Sous la direction de Marie-France CESBRON-DELAUW et Antoine DELON

2 Contexte biologique: T. gondii Pathogène responsable de la toxoplasmose: 50% de la population mondiale infectée; Formes graves chez les fœtus et les sujets immunodéprimés. Proche de Plasmodium falciparum, responsable de la malaria Hôtes définitifs: Félidés Mérozoïte Sporozoïte BradyzoïteTachyzoïte Hôtes intermédiaires: Mammifères et oiseaux Environnement Forme proliférative Forme dormante Reproduction sexuée Transmission verticale au foetus Réactivation chez les sujets immunodéprimés Encéphalite Toxoplasmose congénitale Toxoplasma gondii est un protozoaire eucaryote, appartenant au phylum des Apicomplexa: cest un parasite intracellulaire obligatoire.

3 La vacuole parasitophore (VP) de T. gondii Un compartiment spécialisé au sein de la cellule-hôte, formé activement par le parasite Sécrétion des micronèmes 1. Attachement Sécrétion des rhoptries 2. Invasion 4. Prolifération des parasites [Lebrun et al.,2007] 1µm Sécrétion des granules denses 3. Maturation de la VP

4 Les systèmes membranaires de la VP [Magno et al., 2005a] RNM: Réseau de nanotubes membranaires HOSTs: Tubules séquestrant des organites de la cellule-hôte [Coppens et al., 2006] PVM: Membrane délimitant la VP PVM PV Cellule-hôte Parasite Tubules de diamètre 30-50nm Tubules de diamètre ~50nm sous-tendus par un microtubule de la cellule-hôte

5 La famille des protéines GRA Protéines de granules denses GRA1 GRA2 GRA3 GRA4 GRA5 GRA6 GRA7 GRA8 GRA9 Domaine transmembranaire Hélice amphipathique La plupart des protéines GRA contiennent un segment hydrophobe ou amphipathique, susceptibles dinteragir avec des membranes.

6 Associées aux structures membranaires de la vacuole mature Stockées dans les granules denses Libérées lors de la maturation de la vacuole Trafic post-sécrétoire des protéines GRA

7 Associées aux structures membranaires de la vacuole mature Stockées dans les granules denses Libérées lors de la maturation de la vacuole Trafic post-sécrétoire des protéines GRA

8 Associées aux structures membranaires de la vacuole mature Stockées dans les granules denses Libérées lors de la maturation de la vacuole Toutes GRA Lumen RNM GRA2,4,6,9 HOSTs GRA7 PVM GRA3,5,7

9 Trafic post-sécrétoire des protéines GRA Stockées dans les granules denses Libérées lors de la maturation de la vacuole Associées aux structures membranaires de la PV mature PVM HOSTsRNM Lumen GRA7 Toutes GRA GRA3,5,7 GRA2,4,6,9 Bien que contenant pour la plupart des domaines hydrophobes, les protéines GRA existent en partie sous des formes solubles tout au long de leur trafic post-sécrétoire. Partiellement solubles Essentiellement solublesFraction luminale soluble

10 Interactions des protéines avec les membranes de la VP Rôle de GRA2 et GRA6 dans la formation du RNM [Mercier et al., 2002] En parasite sauvage: Tubules homogènes En labsence de GRA2: Matériel granulaire, non structuré En labsence de GRA6: Vésicules RNM [Coppens et al., 2006] Rôle de GRA7 dans la formation des HOSTs ? HOST GRA7 participe à un manteau cylindrique formé autour des membranes des HOSTs GRA2 et GRA6 sont nécessaires à la mise en place du RNM

11 Problématiques abordées Trafic post-sécrétoire Comment les protéines GRA sont-elles solubilisées avant datteindre leurs membranes-cibles ? Association membranaire Quels sont les paramètres nécessaires pour lassociation des protéines GRA aux membranes de la vacuole ? Formation de tubules membranaires De quelle manière les protéines sont-elles impliquées dans la formation du RNM et des HOSTs?

12 Stratégie: Microscopie de fluorescence (LSP) Biochimie (LAPM) Un modèle pour la VP Physique des vésicules géantes (LSP) Etude de la VP (LAPM) Exploration des interactions membranaires et des fonctions des protéines GRA Protéines GRA + Modèle de la VP Membranes modèles

13 Contraintes du système Pas de protéines GRA purifiées -> Travail à partir de: 3 fractions ultrasolubles riches en protéines des anticorps spécifiques de chacune des protéines GRA. Milieu de culture complémenté de serum de veau foetal Protéines de parasites extracellulaires Protéines sécrétées in vitro Protéines de cellules infectées Formes solubles obtenues par ultracentrifugation ( g; 1h)

14 Membranes-modèles Lipides HeLa Les SUVs et GUVs ont été formées à partir dun extrait lipidique total de cellules HeLa (cellules humaines), afin dapprocher la composition lipidique des membranes rencontrées dans la vacuole.

15 Présentation des résultats Formes de solubilisation Association membranaireDéformations membranaires Travail sur SUVs Travail sur GUVs Biochimie (LAPM) Microscopie de fluorescence (LSP) En solution Comparaison des différentes formes ultrasolubles des protéines GRA Association spontanée Répartition des protéines GRA Implication des protéines GRA dans des déformations membranaires?

16 Protéines GRA suivies Contrôle: hydrophile 2 hélices amphipathiques 1 TMD GRA1 GRA2 GRA6 GRA3 GRA7 RNM PVM + HOSTs 1 TMD PVM HOSTsRNM Lumen GRA7 Ttes GRA GRA3,5,7 GRA2,4,6,9

17 Biochimie - Analyse des formes solubles des protéines GRA par séparation isopycnique - Détermination des capacités dassociation des protéines GRA avec des SUVs

18 d=1.13 d=1.01 Protéines à analyser Gradient linéaire de glycérol Centrifugation jusquà léquilibre ( g; 17h) Analyse des formes solubles des protéines GRA Chaque protéine sédimente jusquà une densité isopycnique spécifique. Détection des protéines GRA par immunoblot à laide danticorps spécifiques Bottom Top 123 Séparation isopycnique

19 Analyse des protéines sécrétées in vitro

20 Analyse des protéines GRA des différentes fractions GRA1 GRA2 GRA3 GRA6 GRA7 Prot. parasite Prot. sécrétées Prot. cell. infectée Soluble Protéines à domaines Transmembranaires: Formes plus agrégées dans le parasite ? Signatures des fractions de protéines: références pour les expériences dassociation membranaire

21 Association membranaire SUVs + Protéines Agitation douce 1h, 20°C Séparation isopycnique Protéines sécrétées in vitro + SUVs HeLa SUVs

22 Les protéines GRA sassocient aux membranes HeLa GRA1 GRA2 GRA3 GRA6 GRA7 Prot. parasite Prot. sécrétées Prot. cell. infectée Les protéines GRA2,3,6,7, quelles qu soient leurs formes de solubilisation, sont capables de sassocier aux membranes HeLa

23 Lassociation de GRA2 et GRA6 aux SUVs dépend de leur composition Incubation 1h, 20°C Ultracentrifugation différentielle ( g, 1h) P S SUVs EPC + Protéines SUVs HeLa + Protéines P S Partenaires lipidiques de GRA2 -> GRA2 lie les phosphoinositides Les protéines GRA2 et GRA6 sont capables de sassocier aux SUVs HeLa, mais pas aux SUVs EPC. -> Interactions spécifiques avec certains lipides? * EPC: phosphatidylcholine dœuf * HeLa: extrait lipidique total de cellules HeLa

24 Validation du système-modèle Les protéines GRA sécrétées contenant des séquences hydrophobes ou amphipathiques sont capables de sassocier spontanément à des membranes. Associées: GRA2, GRA3, GRA7 SUVs HeLa GRA6 Solubles: GRA1

25 Microscopie de fluorescence Détection des protéines GRA par ImmunoFluorescence indirecte

26 Electroformation GUVs HeLa Lavage Incubation AC primaire Incubation AC secondaire Lavage Mode opératoire Incubation protéines 1h, t° amb Association des protéines aux GUVsFormation des GUVs Marquage des protéines par immunofluorescence Réalisation dune chambre délectroformation à flux:

27 Les protéines GRA sassocient aux GUVs HeLa GRA2 GRA7 GRA3 GRA6 25µm GRA2,6,7 se rassemblent en microdomaines protéiques à la surface. GRA3 est répartie de manière beaucoup plus diffuse, bien que non homogène.

28 Observation de GUVs groupées GRA2 et GRA7 sont particulièrement concentrées aux zones de contact entre GUVs -> Rôle dans jonctions membranaires? GRA2GRA7 25µm GRA3 25µm GRA6 25µm

29 Les protéines GRA2 et GRA7 sassocient à des fils membranaires GRA2 et GRA7 sont associées à des fils membranaires. -> Rôle dans leur formation? 25µm

30 Bilan GUVs HeLa Membranes des GUVs: GRA3 Zones de contact: GRA2, GRA7 Micro-domaines protéiques: GRA2,GRA6,GRA7 Réseau de fils ponctués: GRA7 Fils membranaires: GRA2 GRA2 et GRA7 présentent des caractéristiques particulières: elles sont concentrées aux zones de contact entre GUVs et présentes sur des fils membranaires.

31 Discussion des résultats Trafic post-sécrétoire des protéines GRA Ciblage des protéines GRA aux membranes de la vacuole Rôles des protéines GRA dans la formation des HOSTs et du RNM

32 Comment les protéines GRA sont-elles solubilisées avant datteindre leurs membranes-cibles? Protéines ultrasolubles parasitaires Protéines ultrasolubles sécrétées in vitro Protéines ultrasolubles de cellules infectées Densité isopycnique en gradient de glycérol GRA2 GRA3 GRA6 GRA7 GRA3 GRA6 GRA7 GRA6 GRA3 GRA7 GRA1

33 Comment les protéines GRA sont-elles solubilisées avant datteindre leurs membranes-cibles? Protéines ultrasolubles parasitaires Protéines ultrasolubles sécrétées in vitro Protéines ultrasolubles de cellules infectées Densité isopycnique en gradient de glycérol GRA2 GRA3 GRA6 GRA7 GRA3 GRA6 GRA7 GRA6 GRA3 GRA7 GRA1 Formes plus agrégées Formes transitoires Formes plus solubles GRA2 Identification des protéines partenaires des protéines à domaine transmembranaire (GRA3,6,7) -> Braun et al., 2007

34 Quels sont les paramètres nécessaires pour lassociation des protéines GRA à des membranes ? Associées: GRA2, GRA3, GRA7 GRA6 SUVs HeLa Paramètre suffisants: (in vitro) Fractions solubles De parasite Sécrétée De cellule infectée SUVs HeLa + Paramètres nécessaires: Mécanisme de ciblage aux membranes de la vacuole Interactions spécifiques protéine-lipide ?

35 De quelle manière les protéines GRA sont-elles impliquées dans la formation du RNM et des HOSTs? Formation du RNM: Fusion de petites vésicules Rôle de GRA2? Courbure spontanée locale - hél. amphipathique GRA2, - épingle TM GRA6 Stabilisation de la courbure Formation des HOSTs: Poussée des microtubules de la cellule-hôte Initiation de la déformation Stabilisation de la courbure Charpentage par GRA7 Protéine vacuolaire ?

36 GRA2 suffit à déformer des SUVs en tubules! [Travail de Amina Bittame, Stage M2 2007] SUVs HeLa + GRA2 + GTP Très récemment au LAPM, GRA2 a pu être purifiée. Bilan Mise en œuvre de méthodes permettant lanalyse des protéines GRA sous forme solubles Validation du système-modèle: Les protéines GRA, sous forme soluble, sont capables de sassocier spontanément à des membranes (SUVs ou GUVs) de composition lipidique adaptée. Développement dune méthode pour le marquage par immunofluorescence sur GUVs: –Détection des protéines GRA associées aux GUVs. -> Possibilité dapplication de techniques de spectroscopie de fluorescence

37 Remerciements Marie-France Cesbron-Delauw et Antoine Delon qui ont dirigé ma thèse, Patricia Bassereau et Jean-François Dubremetz qui mont fait lhonneur dêtre rapporteurs de ma thèse, Annie Viallat qui a accepté de participer au jury de soutenance en tant quexaminatrice, Bertrand Fourcade qui a accepté de présider ce jury, Toutes les personnes avec qui jai eu loccasion de travailler et qui mont apporté leur aide, au LSP et au LAPM, mais également au Laboratoire de Génétique Moléculaire des Plantes, Et particulièrement Corinne Mercier, qui ma suivie tout au long de mon travail de thèse.

38 Ouvertures: Etudes in vitro à partir de protéines GRA purifiées En solution Etude des cinétiques dassociation des protéines GRA En membrane Etude des associations protéiques au sein de la membrane Spectroscopie de fluorescence Dichroïsme circulaire Biochimie Mode dassociation membranaire Identification des protéines partenaires (FCS) (FCS, FRET) *FCS: Spectroscopie à corrélation de fluorescence Etude des changements de conformation


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