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Diagnostic des infections virales MICROBIOLOGIE DCEM-1 ANNEE UNIVERSITAIRE 2007-2008 Nicolas LEVEQUE CHU Robert Debré-Laboratoire de virologie Mail :

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1 Diagnostic des infections virales MICROBIOLOGIE DCEM-1 ANNEE UNIVERSITAIRE Nicolas LEVEQUE CHU Robert Debré-Laboratoire de virologie Mail :

2 Pourquoi faire du diagnostic en virologie ? Dons de sang, dorganes et de tissus (dépistage obligatoire) Suivi biologique des infections (VIH, VHB, VHC) Mesures prophylactiques et contrôle des épidémies rota et VRS en pédiatrie - grippe Etudes épidémiologiques (prévalence, réservoir, mode de transmission) Preuve de lorigine virale dune infection +++ chez immunodéprimés Décision thérapeutique développement des antiviraux

3 Recherche des anticorps = Sérologie = Diagnostic indirect Recherche du virus ou de ses constituants = Diagnostic direct = approches complémentaires (fonction du virus recherché et de la clinique) Plusieurs approches Lanalyse comprends plusieurs phases : Prélèvement = phase pré-analytique Choix de techniques et réalisation = phase analytique Validation et interprétation

4 Phase pré-analytique : le prélèvement 1. Choix des prélèvements à effectuer Selon la clinique (toute lésion accessible doit être prélevée) Porte dentrée, sites de multiplication et/ou dexcrétion des virus recherchés 2. Réalisation des prélèvements Importance +++ de la qualité du prélèvement Doit être réalisé le plus tôt possible après le début des signes cliniques (multiplication +++ pendant phase dincubation) 3. Acheminement des prélèvements au laboratoire Milieux de transport pour virologie (+++ pour culture de virus) Transport rapide Sécurité Importance des renseignements cliniques transmis au virologue avec le prélèvement

5 Diagnostic indirect = sérologie Recherche des anticorps ELISA ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) : substrat développé pour tous types de virus, automatisable, adapté à de grandes séries différencie IgG et IgM

6 Sérologie +++ Pour diagnostic des primo-infections = apparition des Ac entre deux sérums dun patient 2 sérums : sérum précoce (neg) – sérum tardif (pos) Pour définir le statut immunitaire vis-à-vis dun virus = savoir si un patient a déjà rencontré un virus précis (Ac pos) ou non (Ac neg) 1 sérum

7 Diagnostic direct Recherche du virus ou de ses constituants : Détection dantigènes – techniques immunologiques Détection de génome (ADN ou ARN) – biologie moléculaire Détection du virus entier – culture virale Observation des particules virales (microscopie électronique) Si résultat positif avec clinique concordante = preuve de limplication dun virus dans une infection

8 Détection des antigènes du virus : IF, ELISA Techniques simples et rapides à mettre en œuvre mais manque de sensibilité Mise au point des anticorps monoclonaux en Détection : Ag dans des cellules (immunofluorescence) Ag libre ou libéré (ELISA ; agglutination ; immunochromatographie) - contrôle de la spécificité de la réaction +++ selles (rotavirus, adénovirus) pvts respiratoires (VRS, grippe, rougeole) lésions cutanéomuqueuses (HSV, VZV)

9 RSV-infected cells

10 Diagnostic direct : Diagnostic direct : détection du génome DNA polymerase PCR = polymerase chain reaction Très nombreuses copies de lADN … 30 x1989

11 HSV dans LCR pour méningo-encéphalite (urgence) CMV : PCR quantitative (greffés de rein) VIH : PCR qualitative (dépistage chez nouveau-né) et PCR quantitative (charge virale pour suivi thérapeutique) VHC : sérologie + PCR Diagnostic direct : Diagnostic direct : détection du génome Principales applications

12 Equipement +++ hotte à flux laminaire hotte à flux laminaire car manipulations en environnement stérile Microscope Incubateur à CO2 … Incubateur à CO2 … Diagnostic direct : Diagnostic direct : culture de virus

13 Technique de référence Virus = parasites intracellulaires obligatoires Ne peuvent se multiplier que dans des cellules vivantes animal (Coxsackievirus A types1 à 6) œuf de poule embryonné (virus de la grippe, poxvirus) cellules en culture in vitro Importance dun transport rapide jusquau laboratoire pour conserver le pouvoir infectieux du virus Dans milieu de transport = MEM + protéines (SVF) + tampon + ATB Diagnostic direct : Diagnostic direct : culture de virus

14

15 CMV / MRC-5HSV / MRC-5 Parainfluenza / LLC-MK2VRS / HEp-2

16 Microscope électronique

17 Diagnostic direct : Microscopie électronique Adénovirus Rotavirus


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