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1 La réponse de la modélisation moléculaire Eduardo DE OLIVEIRA Catherine HUMEAU Elaine-Rose MAIA Séminaire Annuel RP2E -- Le 15 janvier 2009 Pourquoi.

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1 1 La réponse de la modélisation moléculaire Eduardo DE OLIVEIRA Catherine HUMEAU Elaine-Rose MAIA Séminaire Annuel RP2E -- Le 15 janvier 2009 Pourquoi les lipases sont-elles régiosélectives dans l'acylation de flavonoïdes ? Latifa CHEBIL Mohamed GHOUL Jean-Marc ENGASSER

2 2 INTRODUCTION ET OBJECTIFS

3 3 Composés polyphénoliques à faible poids moléculaire Composés polyphénoliques à faible poids moléculaire Les flavonoïdes Vaste spectre de propriétés biologiques bénéfiques, mais… Vaste spectre de propriétés biologiques bénéfiques, mais… … faible solubilité en milieu hydrophile et hydrophobe. … faible solubilité en milieu hydrophile et hydrophobe. (Harvsteen, 2002 ; Boudet, 2006 ; Chebil et al., 2007) Métabolites secondaires de nombreuses espèces végétales Métabolites secondaires de nombreuses espèces végétales (…) (…)

4 4 Permet daugmenter leur hydrophobicité (lipophilisation) Permet daugmenter leur hydrophobicité (lipophilisation) Peut être accomplie par voie chimique ou enzymatique Peut être accomplie par voie chimique ou enzymatique Acylation de flavonoïdes (Chebil et al., 2006, Villeneuve et al., 2007) VOIE CHIMIQUE : VOIE CHIMIQUE : VOIE ENZYMATIQUE : VOIE ENZYMATIQUE : OH OHOHHO OH OHOHHO O -R OHOHHO OH HO R- O O -R Donneur dacyle (R) P, T, milieu basique Donneur dacyle (R) Enzyme O -R R- O O -R HOOH

5 5 ENZYME = protéine qui catalyse des réactions chimiques ENZYME = protéine qui catalyse des réactions chimiques LIPASES = enzymes capables de catalyser les réactions : LIPASES = enzymes capables de catalyser les réactions : – Hydrolyse de liaisons ester en milieu aqueux – Formation de liaisons ester en milieu organique De nombreuses applications en biotechnologie De nombreuses applications en biotechnologie (Jaeger, 2002) Lipase la plus utilisée : Candida antarctica lipase B (CALB) Lipase la plus utilisée : Candida antarctica lipase B (CALB) Lipases Structure de la CALB Cavité du site actif : « Triade catalytique » au fond

6 6 Deux cas dacylation de flavonoïdes en utilisant la CALB O OH OH HO OH O OH OH OOH HO O ISOQUERCITRINE : ISOQUERCITRINE : O OH OH HO O -CO-CH 3 O OH OH OOH HO O Vinyl-acetate CALB (Nakajima et al., 1999 ; Stevenson et al., 2006 ; Chebil et al., 2007) O OH OH OOH HO OH O OH OH OOH HO QUERCÉTINE : QUERCÉTINE : Vinyl-acetate CALB (Ardhaoui et al., 2004 ; Chebil et al., 2007) Aucune réaction 6OH

7 7 Utiliser des outils de SIMULATION MOLECULAIRE pour expliquer, dans le cas de l'acétylation enzymatique de lisoquercitrine et de la quercétine, catalysée par la lipase B de Candida antarctica (CALB) : (A) LA SPECIFICITÉ : Pourquoi la CALB est-elle capable de catalyser lacétylation de l'isoquercitrine mais pas celle de la quercétine ? (B) LA RÉGIOSÉLECTIVITÉ : Pourquoi, dans le cas de l'isoquercitrine, seulement un groupement hydroxyle (6-OH) précis du substrat réagit ? Objectifs

8 8 METHODOLOGIE

9 9 Outils de simulation Structure cristallographique de lenzyme CALB :Structure cristallographique de lenzyme CALB : –Obtenue sur la Protein Data Bank (PDB) –Code 1LBS LogicielsLogiciels –Discovery Studio (v.1.7) –Insight (v. 2005) –Champ de forces : CHARMmCHARMm –Algorithme de docking : LigandFit

10 10 Chacune de ces orientations est placée dans la cavité (« pose ») Principe du docking Exploration de lespace conformationnel du ligand Chaque conformation : 4 orientations possibles

11 11 Choix de poses favorables Complémentarité géométrique : BONNE ADEQUATION DE FORME AVEC LA CAVITE Complémentarité chimique : INTERACTIONS FAVORABLES AVEC LES RESIDUS PROCHES Liaisons H Électrostatiques Aromatiques ( - et - ) Van der Waals (…) conformères (= poses) GÉNERÉES… … et seules les 50 les plus favorables RETENUES

12 12 Mécanisme réactionnel simplifié (adapté de Uppenberg et al., 1994) Enzyme libre CIBLE DE DOCKING SUBSTRAT DOCKÉ Flavonoïde (accepteur dacyle) F H3CH3C F – OH Flavonoïde acylé Enzyme régénérée H 2 C = CH OH CH 3 Acyl- enzyme H3CH3C CH=CH 2 Vinyl-acétate (donneur dacyle)

13 13 (1) (3) (2) Létape critique (1) (1)Liaisons H entre ACE et les résidus Thr40 et Gln106 (2) (2)Transfert de proton (activation de laccepteur lacyle) (3) (3)Attaque nucléophile sur lacyle-enzyme HOHOOH OH HO Flavonoïde docké dans la cavité de lacyl-enzyme (adapté de Hult et al., 1998, 2000, 2001)

14 14 4Å Analyse des poses retenues HOHOOH OH HO MODE DE LIAISON PRODUCTIF : Mode de liaison du ligand qui aboutit à une réaction. Mode de liaison du ligand qui aboutit à une réaction. Le substrat docké doit obéir à trois conditions : Le substrat docké doit obéir à trois conditions : 2 ou 3 liaisons H ( Botta et al., 2002 ; Vallikivi et al., 2005 ; Palocci et al., 2007) Flavonoïde docké dans la cavité de lacyl-enzyme

15 15 RESULTATS ET DISCUSSION

16 16 Isoquercitrine O O H O H H O O H O O H O H O O H H O O Mode de liaison 1 SUCRE PARTIE SUCRE AU FOND DE LA CAVITÉ O O H O H H O O H O O H O H O O H H O O PHÉNOLIQUE PARTIE PHÉNOLIQUE AU FOND DE LA CAVITÉ Mode de liaison 2

17 17 Mode de liaison 1 SUCRE AU FOND DE LA POCHE + hydrophobe+ hydrophile VUE 1 : VUE FRONTALE DE LA CAVITE DE LENZYME (SURFACE DE CONNOLLY) Partie phénolique à lentrée Partie sucre vers le fond Ile189 Val149

18 18 Mode de liaison 1 SUCRE AU FOND DE LA POCHE VUE 2 : VUE LATERALE DU LIGAND DOCKE ET DES RESIDUS INTERAGISSANT Thr40 His224 Asp187 Ile189 Val149 Ser105 Gln106 ACE 3-OH : His224:N : 8.7 Å ACE:C : 7.4 Å 4-OH : His224:N : 6.2 Å ACE:C : 4.6 Å 6-OH : His224:N : 4.0 Å ACE:C : 3.5 Å

19 19 Mode de liaison 2 PARTIE PHÉNOLIQUE AU FOND DE LA POCHE VUE LATERALE DU LIGAND DOCKE ET DES RESIDUS INTERAGISSANT Thr40 His224 Asp187 Ile189 Val149 Ser105 Gln106 ACE 5-OH : His224:N : 8.3 Å ACE:C : 5.6 Å 7-OH : His224:N : 7.1 Å ACE:C : 5.2 Å

20 20 Quercétine Mode de liaison 1 A C B A CYCLE A AU FOND DE LA CAVITÉ A C B Mode de liaison 2 B CYCLE B AU FOND DE LA CAVITÉ

21 21 Mode de liaison 1 CYCLE A AU FOND DE LA POCHE VUE LATERALE DU LIGAND DOCKE ET DES RESIDUS INTERAGISSANT His224 Asp187 Thr40 Ser105 Gln106 ACE 5-OH : His224:N : 6.3 Å ACE:C : 4.3 Å

22 22 Mode de liaison 2 CYCLE B AU FOND DE LA POCHE VUE 2 : VUE DU LIGAND DOCKE ET DES RESIDUS INTERAGISSANT His224 Asp187 Thr40 Ser105 Gln106 ACE Gln157 3-OH : His224:N : 6.2 Å ACE:C : 5.7 Å 4-OH : His224:N : 4.5 Å ACE:C : 3.7 Å

23 23 CONCLUSIONS

24 24 O OH OH HO O -CO-CH 3 O OH OH OOH HO O His224 ACE His224 ACE Pas dacétylation sur la partie phénolique et… … acétylation seulement du 6-OH de la partie sucre. Acétylation seulement du 6-OH de la partie sucre. ISOQUERCITRINE OK OK

25 25 His224 ACE His224 ACE … ni sur le cycle A. Pas dacétylation sur le cycle B… O OH OH OOH HO OH Aucune réaction QUERCÉTINE OK OK

26 26 Trois CRITÈRES STRUCTURAUX doivent être satisfaits pour quun complexe enzyme-substrat puisse être considéré comme RÉACTIF : (1) 2 ou 3 liaisons H entre lacyle-enzyme et le « oxyanion hole » (2) Au moins un OH à 4 Å de latome Ace:C (3) Au moins un OH à 4 Å de latome His224:N (3) Au moins un OH à 4 Å de latome His224:N (A) LA SPECIFICITÉ : OK Isoquercitrine : au moins un mode de liaison satisfait aux critères de réactivité = réaction OK NON Quercétine : aucun mode de liaison ne satisfait aux critères de réactivité = absence de réaction NON (B) LA RÉGIOSÉLECTIVITÉ : 6-OH : le seul OH de lisoquercitrine satisfaisant aux critères de réactivité (donc le seul à pouvoir réagir). MÉTHODOLOGIE PRÉDICTIVE ? ? ? MODÈLESEXPÉRIENCE

27 27 Équipe Biocatalyse-Bioprocédes - LIBio – ENSAIA / INPL Eduardo Basilio DE OLIVEIRA (doctorant - 3 ème année) Catherine HUMEAU (Maître de conférences) Mohamed GHOUL (Professeur) Jean-Marc ENGASSER (Professeur) Latifa CHEBIL (Maître de conférences) Évelyne RONAT (Informaticienne) Collaborateurs – experts en Modélisation Moléculaire Elaine-Rose MAIA (Professeur – Université de Brasilia – Brésil) Bernard MAIGRET (Directeur de recherche - LORIA –CNRS) MERCI DE VOTRE ATTENTION ! MERCI DE VOTRE ATTENTION !


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