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Dr Moyenga. Reponse reçu...merçi Hamed sawadogo Kone Amariane Hadra Sawdogo Madeleine adiguenoue Saidou sawadogo Koritimi Ouedrago Seydou Kinda Amadou.

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1 Dr Moyenga

2 Reponse reçu...merçi Hamed sawadogo Kone Amariane Hadra Sawdogo Madeleine adiguenoue Saidou sawadogo Koritimi Ouedrago Seydou Kinda Amadou Dao Moumouni Tandamba

3 Projet Pilote 2me partie Prise en charge du Paludisme au Burkina Faso Pathophysiologie et diagnostic du paludisme

4 Paludisme Cycle du parasite dans le corps humain : 2 étapes essentielles : un cycle asexué chez lhomme un cycle sexué chez le moustique l'anophèle femelle le parasite : Plasmodium. homme

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7 Plasmodium vivaxzones tempérées chaudesDurée de vie est de 3 à 4 ans Plasmodium malariaefoyers tropicauxjusqu'à 20 ans Plasmodium ovale,* rare Plasmodium falciparum agent de la fièvre tierce plus répandu en zone chaude Sa longévité est en moyenne de 2 mois et atteint exceptionnellement 1 an.

8 P. Falciparum : 'petit, résistant et mortel'. Incubation : 7 à 10 jours Phase d'invasion : caractérisée par la fièvre continue (39°-40°) accompagnée de céphalées, nausées ou vomissements Phase d'état : Les accès prennent une évolution de type tierce (accès toutes les 48 h). Fièvre 39°-40°, frissons, sueurs accompagnées de céphalées, de vomissements et d'une splénomégalie parfois d'une hépatomégalie

9 Transmissions: -piqûre par anophèle femelle contaminée -transfusions/piqûres par matériel souillé sg contaminé -transmission congénitale Vecteurs: 60 espèces dAnophèles (A. funestus, A. gambiae en Afrique) Condition nécessaires pour maladie: -présence de leau pour phases larvaires et nymphales du moustique - Température élevée pour multiplication sexuée de Plasmodium chez le moustique (T°>21°C P.falciparum T°>16°C les 3 autres)

10 La reproduction exige 'sang, eau et chaleur', expliquant l'absence de paludisme pendant la saison sèche ou froide selon la région, avec reprise respectivement à la saison des pluies ou chaude; en pays tropicaux humides, la transmission est perannuelle

11 Le cycle parasitaire en 2 phases L'étape hépatique L'étape érythrocytaire

12 Glandes salivaires sporozoïte le foie, le sang, se multiplient et évoluent vers une forme sexuellement pré-déterminée : les gamétocytes mâles et femelles. Pas de maturation en dessous de 18°C ou au dessus de 35°C, elle est maximale vers 24°C. Quand l'oocyste rompt, les sporozoïtes qui migrent dans le corps du moustique jusqu'aux glandes salivaires d'où ils peuvent, lors d'un nouveau repas de sang, infecter un nouvel hôte humain Schizonte hépatique

13 Mérozoïtes hépatiques Libération Mérozoïtes érythrocytaires Corps en rosace Repas sanguin anophèle Schizonte mature Schizonte jeune Trophozoïte âgé Trophozoïte jeune gamétocytes

14 Cycle hépatique: asymptomatique 7 à 21 jours, toujours court pour P.falciparum, parfois quelque mois pour P.vivax ou ovale (hypnozoïtes) Cycle érythrocytaire: durée dun cycle dépendant de lespèce P.falciparum, vivax, ovale 48H P.malariae72H A lissue de chaque cycle, les GR parasités éclatent généralement de façon synchronisée, libérant les mérozoïtes des schizontes matures. Plusieurs cycles se succèdent, mais environ après 1 semaine, certains mérozoïtes se différencient en forme gamétocytes sexués

15 Les sporozoïtes inoculés gagnent le foie. Pendant 1re semaine, la multiplication a lieu sous la forme de schizontes. A terme, la cytolyse hépatique libère des mérozoïtes.

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17 L'étape érythrocytaire Les mérozoïtes pénètrent dans une hématie, se transforment en trophozoïtes puis en schizontes qui se multiplient. **L'éclatement du globule rouge libère les schizontes qui peuvent aller coloniser d'autres hématies.

18 Après plusieurs cycles apparaissent des gamétocytes mâles et femelles. - Ce cycle de maturation de 48h ou 72h rend compte de l'évolution cyclique variable de la fièvre.

19 **La destruction de globules rouges s'accompagne de la libération d'hémozoïne, qui va perturber le fonctionnement de l'hypothalamus. Production de cytokine comme le TNFα et cause de très fortes fièvres qui peuvent aller jusqu'à l'hyperpyrexie.

20 CycleDuréeSymptomatologie Passage dans la circulation sanguine 30 minutesPhase asymptomatique Cycle dans le foie5 à 12 jours 5 à 7 pour PFPhase asymptomatique Cycle dans le globule rouge Quelques joursPhase asymptomatique Eclatement du globule rouge Quelques heuresApparition des symptômes

21 Les formes graves neuroméningées sont dues à la séquestration des hématies parasitées dans les capillaires cérébraux entraînant une anoxie.

22 L'évolution se fait rapidement vers le décès en l'absence de traitement. Les facteurs de mauvais pronostic sont: * grossesse, splénectomie ou autres états d'immunodépression * fièvre très élevée, signes neuropsychiques * hépatomégalie * parasitémie>5% * les perturbations métaboliques ou en rapport avec l'hémolyse: - hyperleucocytose>12 000/mm 3 - hypoglycorachie et élévation des lactates - hématocrite 50µM - oligoanurie avec créatininémie>260µM

23 Manifestations Quen pensez vous?? Sumaya?? Dusukun Yelema?? Kono?? Djoliban???

24 Manifestations 3 phases à un rythme régulier. Ce rythme est variable selon l'espèce de Plasmodium : un jour sur deux (fièvre tierce) ou un jour sur 3 (fièvre quarte), mais il peut également y avoir une fièvre quotidienne. Les 3 stades: (1)Frissons intenses avec une fiêvre de 39 à 40°C et d'une baisse de la tension artérielle ; le patient frissonne sous les couvertures. (2)Fièvre sèche pendant lequel la fiêvre s'élève à 40 ou 41°C, la peau est sèche et brûlante ; le patient rejette ses couvertures. (3)Sueurs abondantes : la fiêvre retombe, la tension artérielle remonte. Le patient émet des urines foncées. L'accès palustre est généralement suivi d'une sensation de fatigue accompagnée d'une période d'euphorie et de soulagement

25 Diagnostic Quels sont les outils/methodes utilisés pour diagnostiquer le paludisme

26 Techniques qui permettent le diagnostic du paludisme : La goutte épaisse et le frottis sanguin Le TDR (Test de Diagnostic Rapide) Le principe du test ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) La PCR (Réaction de Polymérisation en Chaîne)

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29 Frottis

30 LA GOUTTE ÉPAISSE ET LE FROTTIS SANGUIN Les techniques pour mettre en évidence la présence de l'agent responsable du paludisme sont - le frottis sanguin et -la goutte épaisse. La goutte épaisse est un examen plus sensible que le frottis sanguin, la lecture en est délicate, elle requiert une certaine habitude de la part de la personne qui observera la goutte de sang.

31 Technique de la goutte épaisse Dépôt du sang: déposer, sur une lame de verre dégraissée, une grosse goutte de sang (2 fois le volume utilisé pour un frottis). - Défibrination : Pour empêcher la coagulation, avec le coin d'une autre lame ou la pointe d'un vaccinostyle, étaler régulièrement le sang sur une surface de 1 cm de diamètre, en tournant régulièrement pendant 2 minutes. - Séchage : Retourner la lame et laisser sécher à plat sur un support, soit pendant 24 heures à la température ambiante soit pendant 1 heure à l'étuve à 37 °C. **Ne jamais fixer à la chaleur ou à l'alcool. - Déshémoglobinisation : Recouvrir abondamment la goutte épaisse du mélange Giemsa : 3 gouttes, eau neutre : 2 ml. Laisser agir pendant 5 à 10 minutes jusqu'à décoloration complète. Fixer ensuite à l'alcool méthylique. - Coloration : jeter le liquide avec précaution (risque de décollement de la pellicule de sang) et remplacer immédiatement par le mélange : Giemsa : 1 ml, eau neutre qsp : 10 ml. Laisser agir 20 minutes puis rejeter le liquide avec précaution. Laver à l'eau du robinet, en faisant couler le liquide très délicatement sur la lame. Sécher à l'air

32 Quelle que soit la technique la goutte est alors observée pendant au moins 20 minutes (selon les recommandationsde l'OMS - Organisation mondiale de la santé).

33 Frottis, goutte épaisse Le frottis, après coloration au Giemsa

34 Frottis

35 Goutte épaisse L'examen de la GE peut détecter des parasitémies de parasites par µl. La numération parasitaire se fait en comptant le nombre de parasites par 200 leucocytes. On admet que la leucocytémie moyenne est de 6000 par µl. En multipliant le nombre de parasites comptés par 30, on obtient une approximation du nombre de parasites par µl. Frottis L'examen des frottis permet de détecter des parasitémies de l'ordre de 200 parasites par µl. Dans le frottis, l'utilisation d'un oculaire quadrillé, permettra la numération des globules rouges parasités par champ. Le rapport de ce nombre sur le nombre total d' hématies par champ donne le pourcentage d'hématies parasitées et donc le nombre de parasites par µl, en admettant que le nombre normal de globules rouges par µl soit de 4 à 5 millions.

36 les patients infectés par P.falciparum et présentant plus de parasites par µl (plus de 250 parasites par champ de GE ou 2 p.100 de globules rouges parasités) nécessitent une attention particulière, surtout si l'hématocrite est bas. Les enfants atteints de malaria cérébrale, les parasitémies qui excédent 1 million/µl (20 p.100 de G.R. parasités) sont associées de manière significative à une issue fatale

37 LA METHODE QBC ( Quantitative Buffy Coat (QBC) Test) microlitres de sang. Pour le test QBC, le sang recueilli sur un tube à hématocrite contenant de lacridine orange (tube QBC) est ensuite centrifugé à t/mn pendant 5 mn puis lidentification est faite par lecture au microscope à fluorescence Les globules parasitées occupent la partie la plus haute de la colonne de cellules rouges

38 QBC Malaria Test (Quantitative Buffy Coat): marquage par un fluorochrome (acridine orange) de lADN du Plasmodium, après centrifugation différentielle des hématies parasitées et non parasitées dans un tube capillaire. Observation des parasites fluorescents sous microscope IF

39 La réaction en chaîne par polymérase (P.C.R) Le PCR constitue une façon damplifier une séquence dADN. On lutilise pour détecter le génome du parasite en présence dADN humain par lamplification dun gène cible. Cette technique peut détecter moins de 10 parasites dans 10 µL de sang

40 une parasitémie supérieure à 5% est un critère d'hospitalisation, même si l'état du patient n'est pas cliniquement préoccupant. De même, on hospitalise les personnes qui, sujettes à de violents maux de tête et à des vomissements GSK (2005)

41 RDT Les tests diagnostiques rapides du paludisme, parfois appelés " bandelettes réactives " ou " systèmes de diagnostic rapide " détectent les antigènes spécifiques(protéines) produits par les parasites du paludisme. Ces antigènes sont présentsdans le sang des personnes infectées, que l'infection soit récente ou non. Le test diagnostique rapide signale leur présence par un changement de couleur sur unebandelette de nitrocellulose. Certains de ces tests ne peuvent détecter qu'une seule espèce (Plasmodium falciparum), habituellement en repérant la protéine riche en histidine (HRP2) ou la lactate-déshydrogénase (pLDH) spécifique au parasite. La présence du pLDH est revelé par des antigènes monoclonaux

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43 RDT(test diagnostique rapide)

44 Ligne du Control et ligne du test même position = Positive. Une seule ligne du control = negative. PAS de ligne du tout = invalide.

45 Les lignes apparaisent dans les deux positions= positive même si la ligne est faible. Pas de ligne du control = invalid.

46 La sonde à ADN Une sonde synthétique de DNA couplée à la phosphatase alcaline (PFR1-AP) est utilisée. ** 2 séries déchantillons de sang sont mis en contact avec la sonde et la réaction est révélée par coloration du filtre par le NBT/BCIP ou par chemiluminescence utilisant 0,1 mg/ml de Lumiphos 540 (Tropix) et le film rayon X. Lintensité des réactions positives a été établie selon une échelle allant de 0 à 4 + (11).

47 Enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA) Les anticorps associés aux stades asexués du paludisme sont détectés en utilisant des immunodosages enzymatiques ou des techniques dimmunofluorescence qui en augmentent la sensibilité dans les limites de détection plus basse. Méthodes séro-immunologiques : Utile pour la détection du paludisme viscéral progressif associé à la spénomégalie. Ces anticorps contre les mérozoïtes, trophozoïtes ou schizonti peuvent persister pendant plusieurs mois suivant linfection.

48 La réaction en chaîne par polymérase (P.C.R) Le PCR constitue une façon damplifier une séquence dADN et peut détecter moins de 10 parasites dans 10 µL de sang. **Détection de séquences caractéristiques de lADN génomique plasmodial à laide de sondes dADN dénaturé contenant une séquence nucléotidique complémentaire dune séquence répétitive delADN. Les gènes que lon utilise sont ceux des protéines de surface mérozoïte 1 et 2 (msp 1, msp 2) ou de protéine riche en glutamine (glurp). Cette méthode est utile dans la recherche de marqueurs de résistance ou de gènes qui ont muté ou changé de composition.

49 Technologies d'amplification d'acides nucléiques pour détecter l'ADN du parasite dans le sang

50 CONCLUSIONS Le cycle du Paludisme Les techniques pour le Diagnostic pour repondre a ces questions! ? La Mise en évidence de lagent infectieux: ?? L examen met-il en évidence un plasmodium ? ??? S agit-il de Plasmodium falciparum ? ???? Quelle est la densité parasitaire ?

51 Réferences O. GAYE*, G. MC LAUGHLIN**, M. DIOUF*, S. DIALLO(1998)ETUDE COMPARATIVE DE CINQ METHODES DEDIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DU PALUDISME LA GOUTTE EPAISSE, LA METHODE QBC, LA SONDE A ADN, LA PCR ET LE PARASIGHT F TEST Professeur Wilfred F. Mbacham(2008) Diagnostiquer le paludisme Dr Francis Louis, Yaoundé, Cameroun(2008) Le paludisme au Burkina Faso


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