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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques - spectrophotom é triques SPECTROPHOTOMETRIE DABSORPTION MOLECULAIRE Principe Utilise.

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1 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques - spectrophotom é triques SPECTROPHOTOMETRIE DABSORPTION MOLECULAIRE Principe Utilise la capacité dabsorption de lumière dune longueur donde fine et définie des substances dissoutes dans leau. Loi de Beer-Lambert (en expression logarithmique) : Log I0 /I = e. C.L = densité optique ou DO (directement proportionnelle à C) I = énergie lumière transmise I0 = énergie lumière incidente C = concentration substance en mole/l dans le solvant L = longueur du trajet optique (largeur de la cuve) e = coefficient caractéristique de la longueur donde (coef. dabsorption moléculaire) Si I=I0 -> le milieu est transparent, la transmission est de 100% et la DO = 0 Si I tend vers 0, milieu opaque, la DO tend vers linfini Spectre dabsorption lumineuse : représentation graphique des variations de densité optique de la lumière transmise lors de modification de la longueur donde de la lumière incidente. Spectres des substances : ultraviolet et visible. Conditions définies : solvant, pH, O sinon variation de lemplacement des longueurs donde et de coefficient dabsorption

2 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques - spectrophotom é triques SPECTROPHOTOMETRIE DABSORPTION MOLECULAIRE Appareillage Nature spectrophotomètres : toutes les longueurs dondes sont disponibles Photomètres : certaines longueurs dondes Caractéristiques Sources lumineuses solides chauffés (tungstène, visible-infrarouge) (halogène, visible-UV) décharges des gaz raréfiés (hydrogène ou deutérium( UV, continu) (vapeur de mercure (UV, discontinu) Fente dentréeforme rectangulaire Mono chromateurfiltres colorés (verre ou gélatine) Filtres interférentiels (verre + métal) Prismes (dispersion de la lumière) Réseaux (idem) Fentes de sortie

3 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques - spectrophotom é triques SPECTROPHOTOMETRIE DABSORPTION MOLECULAIRE Appareillage Caractéristiques Cuvesverre -> visible Quartz -> U.V. polystyrène Précautions dutilisation (bulles, rayures,nettoyage) Cellules photoélectriques -> transformation énergie lumineuse en énergie électrique Tubes photomultiplicateurs Lentilles, miroirs, fibres optiques Amplificateurs Galvanomètres (mesure le courant fourni par lamplificateur) Enregistreur Appareils photomètres : à filtres, peu coûteux spectrophotomètres : à réseaux ou à prismes (intéressants pour les spectres)

4 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques - spectrophotom é triques SPECTROPHOTOMETRIE DABSORPTION MOLECULAIRE Applications Détermination du spectre caractérisation substance Mesure de concentrationdirecte (Hb. Protéines) Indirecte (urée diacetylmonoxime) Réflectométrie Mesure de labsorption lumineuse au cours du passage dune lumière monochromatique à travers une phase solide sur support réfléchissant. ApplicationsLecture de plaques de chromatographie, de bandelettes réactives Analyse automatique Luminométrie Mesure de la lumière émise par réaction chimique (Chimioluminescence) Applications réactions impliquant la luciférase (ATP ou O2)

5 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques - spectrophotom é triques PHOTOMETRIE DES MILIEUX TROUBLES Opacimétrie mesure de la lumière émise dans le même sens que la lumière incidente Néphélémétrie mesure de la lumière à 90° par rapport à la direction de la lumière incidente Turbidimétrie concentration ou épaisseur dun milieu troublant la visibilité nette dun test optique placé derrière ce milieu FLUORIMETRIE Principe : une molécule à létat stable recevant une énergie sous forme de rayonnement passe à létat excité. Le retour à létat fondamental se traduit par lémission de lumière mesurable. CHEMILUMINESCENCE Dans ce cas, lénergie est dorigine chimique ou enzymatique Spectres démission comporte une longueur donde pour laquelle lintensité est maximum dexcitationcomporte une longueur donde pour laquelle lintensité est maximum

6 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques - spectrophotom é triques SPECTROMETRIE DABSORPTION ATOMIQUE Principe Mesure de labsorption de radiations photoniques spécifiques par des atomes en phase vapeur Loi de Kirchhoff : un élément métallique peut absorber les radiations quil est lui-même susceptible démettre Atome métallique + énergie lumineuse état excité Retour à létat fondamental radiations caractéristiques (raie de résonance) Inversement Vapeur atomique (atomes état fondamental) + radiation absorption de la radiation Appareillage Sources de radiation : lampe à cathode creuse ou lampes à excitation HF Production de la vapeur atomique : source datomisation à flamme ou électrothermie Systèmes de correction dabsorption non spécifique Système de lecture : monochromateur puis photomultiplicateur Applications Dosage des métaux et alcalinoterreux (biologie clinique, toxicologie, pharmacologie)

7 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques - spectrophotom é triques PHOTOMETRIE DEMISSION ATOMIQUE Principe Mesure de lintensité dénergie lumineuse spécifique émise par un élément chauffé dans une flamme (raie de résonance) Appareillage Nébuliseur – brûleur (solution à doser nébulisée dans une flamme (air-propane,acétylène) Système de lecture : filtre interférentiel à bande étroite + dispositif photosensible Applications Dosage des alcalins Na, K, Li (biologie clinique) Inconvénient Manipulation des gaz Avantages Fiabilité, spécificité, linéarité, simplicité

8 Spectrophotomètres Schéma

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10 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques METHODES ELECTROCHIMIQUES Principe Echange délectrons entre électrode et substance électroactive (électrode = cathode ou anode) Méthodes Méthodes en pleine expansion, souvent automatisables (biochimie analytique du GR ou analyses de biologie délocalisée) Les méthodes sont de 2 types selon limportance de lélectrolyse : ampérométrique : ampérométrie : microélectrolyse avec concentration relativement constante de lanalyte. Potentiel constant, intensité courant proportionnelle à concentration Analyte - Application : détermination de la PO2 ou étude post-chromatographique haute pression. potentiométrie : les électrodes sont spécifiques à membrane. Intensité courant constante,analyse des variations de potentiel en fonction de la concentration analyte coulométrique : coulométrie mesure la consommation complète du produit à analyser. Intensité ou potentiel imposé. - Application : dosage du fer sérique par coulométrie à potentiel imposé. voltamétrie et polarographie. Application peu usuelle

11 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques RADIOANALYSE Principe La plupart des éléments naturels existent à létat de mélange disotopes Masse noyau et Nombre électron = propriétés chimiques identiques Les radioisotopes sont instables. Leur désintégration libération e- ou rayon Il est possible de créer des réactifs marqués par radioisotopes pour lusage biologique. Méthodes Les radioisotopes peuvent être détectés de diverses manières : - compteur Geiger (ionisation dun gaz) - compteur à scintillation (éclair lumineux) - autoradiographie (impression dune plaque photographique) Applications - toute technique danalyse biochimique (cf : reste du cours !) - étude métaboliques : traçage des processus cellulaires : précurseur radioactif, étape métabolique, mesure biochimique, autoradiographique,..

12 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques - enzymologie Enzyme Définitioncatalyseur biologique de réaction biochimiques Spécificitévis à vis de la molécule sur laquelle il agit = substrat Variable (notion daffinité) Structure Préparation et purification Protéines Parfois fragilisées par les séparation des constituants cellulaires Site actif = sites privilégiés de fixation du substrat Proenzyme = forme inactive à transformer pour activation Isoenzymes = différentes protéines à même spécificité enzymatique correspondent souvent à des protéines formées de plusieurs chaînes polypeptidiques à combinaisons variables entre elles (LDH) Il existe des protéines à plusieurs fonctions enzymatiques Enzyme et structure cellulaire - enzymes impliquées dans une chaîne métabolique ont souvent la même localisation cellulaire parfois regroupements en complexes poly-enzymatiques difficilement dissociables

13 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques - enzymologie Enzyme Régulation de lactivité enzymatique Formes allostériques différences de forme spaciale Certaines substances - ligands- modifient ces formes Ce sont des effecteurs allostériques (parfois substrat ;dans ce cas la courbe de la vitesse de réaction en fonction de la concentration prend la forme dune sigmoîde) Certaines substances de bas PM ont également des effets effecteurs ou inhibiteurs modification de laffinité pour le substrat régulation métabolique Cas de la régulation par le produit terminal de la chaîne métabolique = rétro inhibition ou inhibition par feed-back Enzyme à concentration faible par rapport aux autres enzymes de la chaîne métabolique, enzyme régulateur de la chaîne effet limitant Classification internationale des enzymes => numérotation 1 = oxydoréductases : réactions doxyoréduction 2 = transférases : transfert de groupements fonctionnels 3 = hydrolases : réactions dhydrolyse 4 = lyases : suppression ou fixation dun groupement=>double liaison 5 = isomérases : réactions disomérisation 6 = ligases : liaison (c-o, c-n, c-c, c-s) avec coupure dune molécule dATP

14 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques - enzymologie Dosage des enzymes Moyens :méthodes immunochimiques (comme autres protéines, cf suite du cours) méthodes de mesure de lactivité catalytique Mesure quantitative (activité catalytique) Mesurer la vitesse de réaction apprécier la quantité denzyme v = k{Enz] v = molécules de substrat tranformées par minute [Enz] concentration en enzyme k = constante dépendant de la nature de lenzyme Paramètres concentration en substrat mesure, pour chaque concentration, de la vitesse initiale (tous paramètres stables) aspect de la courbe dû au fait que, à concentration faible, toutes les molécules denzyme ne sont pas saturées pour une concentration en substrat la vitesse est donnée par : équation de Michaelis-Menton : v = Vmax {S] / {S] + {KM] KM : caractéristique de lenzyme, exprimée en molécules.l-1 Souvent transformation pour obtenir une représentation graphique linéaire (équations de Lineweaver-Burk, Eadie-Hoftee)

15 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES méthodes analytiques - enzymologie

16 Dosage des enzymes Paramètres Température et pH résultante entre effets activateurs et inhibiteurs Coenzymes partie non protéique – souvent transformé lui-même souvent transporteur de groupements fonctionnels ATP, coenzymeA, biotine, pyrophosphate de thiamine Activateurs autres : ions métalliques (Zn, Mg..), protéines inertes (albumine) protecteurs des thiols Inhibition compétitive : analogue structural du substrat modification par ajout de substrat modification de la KM non compétitive complexants, inhibiteurs dune fonction chimique aucun effet dajout de substrat pas de modification de la KM nécessité de standardisation, de contrôles interne, externes

17 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES méthodes analytiques - enzymologie

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19 Dosage des enzymes conditions classiques large excès de substrat température = 37° ou 30° pH = pH optimal protecteurs enzymatiques dilutions ( !) Expression des résultats v de la réaction / ml ou mg de protéines v = moles de substrat / mn à 30° UI Katal = 1 mole/seconde 1 UI = 16 nkatal

20 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques Dosage des enzymes Techniques de mesure 2 possibilités : disparition du substrat ou apparition du produit méthodologies de mesure photométriecoloration du produit, différence dabsorption fluorimétrietechnique plus sensible, soit fluorescence spontanée, soit transformation par modification pH, ajout réactif, transformation structure causes derreurs (fluorescence propre, impuretés témoin « blanc réaction ») radioisotopiesubstrat radioactif séparation sensible, peu dinterférences impossibilité dautomatisation prix élevé, difficultés de fabrication ImmunochimieAnticorps-anti-enzyme pour séparer différentes activités Spécificité pour une isoforme Etude des modifications génétiques

21 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques Dosage des substrats Dosages en point final Excès denzyme Possibilité dutiliser une deuxième réaction de révélation Mesure en fin de réaction par photométrie ou radioenzymologie Dosages par méthode cinétique Enzyme à Km élevée (éventuellement inhibiteur compétitif) Mesure de la vitesse de réaction à 2 temps rapprochés et comparaison avec la courbe établie à partir de quantités connues de substrat La plupart du temps ; méthodes des analyseurs multiparamétriques

22 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques

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24 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques - immunochimie Principe utilise la spécificité remarquable de la liaison antigène – anticorps due à la complémentation stéréochimique qui la caractérise Nature des réactifs Anticorpsprotéine particulière synthétisée par les lymphocytes B Architecture de base à 2 chaînes lourdes et légères Polymorphisme très élevé Site Ac toujours situé en extrémité N terminale Liaison Ag-Ac par site antigénique et site anticorps Chaque anticorps possède une afffinité particulière à légard de lépitope qui lui correspond AntigèneNombre dépitopes variable de 1 pour les molécules hapténiques à plusieurs centaines pour certains virus

25 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques - immunochimie Préparation des réactifs immunochimiques Immunisation expérimentale danimaux la plupart du temps Préparation des antigènes Grosses molécules spontanément immunogènes injection directe Haptènes = molécules PM <5000 couplage avec grosses molécules (albumine, adjuvant de Freund) Préparation des anticorps Anticorps polyclonaux Mélange danticorps issus de nombreuses cellules lymphoïdes Ac reconnaissant des épitopes différents ou des aspects variés du même épitope ou un même épitope avec une affinité variable = immunsérums, excellents réactifs Nécessité de purifier limmunsérum de le concentrer en anticorps (précipitation Ig) Anticorps monoclonaux Proviennent de lhybridation dune cellule lymphocytaire avec une cellule tumorale (plasmocytome) =>cellule hybride immortelle =>clone à fabrication indéfinie et stabilisée d1 anticorps avantages : production industrielle préparation à partir dantigènes inconnus

26 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques - immunochimie Etalonnage Réaction Ag-Ac sensible à lenvironnement étalonnage et dosage mêmes conditions (y compris nature du prélèvement) En général, il est en fait techniquement impossible de connaître la quantité exacte dantigène dans le milieu détalonnage => expertises et définitions dunités internationales distribution de solutions détalonnage sous les auspices de lOMS Méthodes Nombre et variété impressionnants Classification possible selon le phénomène observé et mesuré Observation directe du complexe Ag-Ac : précipitation, agglutination Observation indirecte par lintermédiaire dune marque attachée soit à lantigène, soit à lanticorps. Marque = molécule détectable par un appareil ou les sens. Observation par intermédiaire dun phénomène biologique Applicables à la quantification des antigènes et des anticorps mais dosage possible des antigènes (cf : remarques) Seulement estimation des anticorps (variabilité) Appréciation de la quantité des immuncomplexes

27 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques - immunochimie

28 Standardisation et contrôles de qualité en immunochimie Valeurs des méthodes inégales : Reproductibilité seuil de détection Spécificité sensibilité aux interférences Commodité capacité à être automatisée coût Donc : évaluations, comparaisons généralement du mélange : « principe méthodologique, appareillage, réactifs » standardisation en fait impossible définition de valeurs de consensus mise au point de matériel réactif de référence

29 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques – observation microscopique Principe Utilisation damplification du signal par lentilles optiques pour détecter des objets de taille inférieure à celle décelable à lobservation à lœil nu. Méthodes On distingue : âla microscopie photonique qui, comme son nom lindique, utilise des lampes à émission de photons (longueurs dondes UV visibles). Préparation spéciale :coloration sélective (entraîne la nécessité daugmenter la sensibilité par activité enzymatique ou par fluorescence) le microscope à fluorescence permet la détection de protéines ou dautres substances. Il est possible dutiliser des anticorps marqués (fluorescents ou révélés par activité enzymatique). Ces anticorps se lient à la surface des molécules de la cellule vivante ou à lintérieur de la cellule fixée perméabilisée. Il y a possibilité de détection de variation de concentration et localisation de molécules à lintérieur de la cellule. la microscopie par diffraction des rayons X : révèle un arrangement tridimensionnel moléculaire.

30 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques – observation microscopique Méthodes âla microscopie électronique qui utilise un faisceau délectrons. Contraintes spécifiques : -la fixation est nécessaire (elle utilise en général des produits identiques à ceux décrits pour la déprotéinisation) -coupe en tranches fines (souvent inclusion dans résine ou cire) -les mêmes préparations avec révélation (enzyme, peroxydase ou or colloïdal) utilisées pour la microscopie optique peuvent être utilisées en microscopie électronique La microscopie électronique par cryofracture (cassure des structures internes de la cellule par le froid intense) localise la distribution de proteines intra-cellulaires. La technique de coloration négative : entraîne la révélation dagrégats macromoléculaires ou lagencement des sous-unités protéiniques.

31 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques – observation microscopique

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33 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES valeurs Mesure dun paramètre biologique chez un individu Valeur à situer par rapport aux valeurs possibles donc nécessite que soient connues : Les valeurs représentatives de la population générale Les valeurs de référence Individus en bonne santé Conditions définies (exclusion des facteurs de variation) Les valeurs usuelles Population hétérogène (existent des facteurs incontrôlés) Population pathologique à risque (obèses…) Valeurs usuelles deviennent valeurs de référence si définition de la population et contrôle des facteurs dinterférence

34 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES valeurs – listes des facteurs de variations biologiques Le choix des individus de la population de référence impose de connaître les facteurs de variations biologiques Etablissement de la liste = constitution de banques de données Répertorier Littérature Facteurs physiologiques Facteurs pharmacologiques Quantifier Centres dexamens de santé Variations tissulaires physiologiques Variations pharmacologiques et pathologiques

35 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES valeurs – listes des facteurs de variations biologiques Types de facteurs de variations biologiques Plusieurs propositions de classifications Variations génétiques ou acquises Variations dues à lenvironnement Variations dues à des facteurs exogènes ou endogènes Variations dues à des facteurs physiologiques Facteurs de masse (graisse, muscle, foie enzymes) Facteurs métaboliques Très régulés Produits de catabolisme Produits impliqués dans les mécanismes de synthèse à partir du plasma (glucose, cholestérol…)

36 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES valeurs - s é lection de la population de r é f é rence La sélection de la population de référence utilise 2 types de critères Les critères de stratification ou facteurs de variation maîtrisables création de sous ensembles homogènes personnalité des groupes environnement histoire En général : âge, sexe, masse corporelle, origine ethnique Les critères dexclusion ou facteurs de variation non maîtrisables pathologies prise de médicaments état physiologique sujets à risque

37 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES valeurs – le concept de valeur de r é f é rence Filiation entre les différents termes Individus de référence Population de référence Échantillon de référence Valeur de référence Distribution de référence Limite de référence Intervalle de référence Valeur observée chez un individu Pouvant être comparée aux Constituent la À partir de laquelle est sélectionné un Sur lequel on détermine des Sur lesquelles on observe une À partir de laquelle est déterminée une Qui sert à définir l

38 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES valeurs – le concept de valeur de r é f é rence Études bibliographiques et expérimentales Liste des facteurs de variations biologiques et pathologiques Sélection des sujets à posteriorià priori = population de référence Préparation des sujets questionnaire Prélèvement Traitement du spécimen analyse Sélection de léchantillon de référence Critères de stratification, dexclusion Traitement statistique Vérification de la représentativité Valeurs de référence Critères de stratification, dexclusion Préparation des sujets Prélèvement Traitement du spécimen analyse Traitements statistiques

39 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques - publication ELEMENTS D'UN ARTICLE SCIENTIFIQUE journal Date de parution titre Auteurs + adresses Mots clefs résumé introduction Exposé du problème à résoudre Etat des connaissances Plan du travail Matériels (techniques et biologiques) et méthodes Résultats + commentaires (Tableaux – Figures) Discussion (Tableaux – Figures) conclusion remerciements bibliographie

40 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques - publication (X linked recessive icthyosis) MATERIEL BIOLOGIQUE UTILISE biopsie cutan é e fibroblastes cultiv é s sang leucocytes isol é s METHODES UTILISEES culture cellulaire s é dimentation en polyvinylpyrolidone centrifugation lyse cellulaire (ultrasons) mesure activit é enzymatique : radiochimie blanc r é actif + blanc r é action double essai mesure par fluorim é trie en substrat artificiel (m é thylumbellif é rone)

41 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques - publication (X linked recessive icthyosis) RESULTATS blanc r é actif (conditions d'incubation) conditions de r é action STS comparaison de tampon Tris et phosphate sensibilit é dans les leucocytes temps incubation activit é sp é cifique substrat concentration en prot é ines de l' é chantillon ARS-C tampon phosphate à pH 8,5 d é termination des valeurs de r é f é rence des valeurs des patients des valeurs des porteurs CONCLUSION int é rêt du dosage de la STS int é rêt de la mesure dans plusieurs types cellulaires pour le d é pistage des porteurs

42 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques – publication (purification microfibrilles MATERIEL BIOLOGIQUE UTILISE Ligaments de la nuque de f œ tus de boeuf METHODES UTILISEES Pr é paration de microfibrilles natives intactes ( ) Centrifugation en gradient de densit é directement ou apr è s traitement avec hyaluronidase toute la nuit en gradient de C 3 CL (densit é initiale 1,35 g/ml) soit 72 H, rpm 15 fractions de 0,8 ml soit cong é lation4 H à -80°C, 18 H centrifugation, rmp 15 fractions de 0,8 ml Analyse biochimique dialyse contre tampon 50 mM Tris/HCL, pH 7,4, contenant 0,2 M NaCl mesure densit é optique à 280 nm par analyse spectrophotom é trique SDS PAGE dialyse contre eau distill é e (aliquot 0,5 ml) cong é lation SDS PAGE à 6 % de SDS en condition r é ductrice (dithiothreitol) coloration des prot é ines ou bleu de Coomassie Immunobuvardage (ou "blotting") sur membrane de cellulose (aliquot 50 µ l) anticorps : anticollag è ne VI, antifibrilline, anti MAGP-1, anti LTBP-1, anti LTBP-2, antifibronectine r é v é lation par chemiluminescence Microscopie é lectronique à ombrage rotatif observation du m é lange initial riche en microfibrilles et des fractions de centrifugation en gradient

43 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques – publication (purification microfibrilles) RESULTATS Centrifugation en gradient de densité gradients de 1,28 à 1,43 g/ml (72H ou 18H après congélation) mesure de la densité optique à 280 nm protéines à densité 1,30, 1,33 et 1,41 g/ml après traitement par hyaluronidase, pic protéines 1,33 et 1,37 g/l SDS PAGE et Immunobuvardage fractions 6 et 7 collagène VI chaîne 1 et 2 et chaîne 3 fractions11 et 12 protéine de 330 kDa fibrilline avec colocalisation MAGP-1 sommet du gradient fractions 1 et 2 LTBP-1 et LTBP-2 Microscopie à ombrage rotatif - préparation non traitée à la hyaluronidase fractions 6 et 7 collagène VI en aggregats + quelques fibres de fibrilline fractions 11 µfibrilles de fibrilline - préparation traitée à la hyaluronidase fractions 6 et 7 µfibrilles de collagène VI fractions 11 µfibrilles de fibrilline DISCUSSION (CONCLUSION) La méthode proposée permet une analyse structurale fine et précise des µfibrilles.


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