SPECTROPHOTOMETRIE D’ABSORPTION MOLECULAIRE Principe

MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES méthodes analytiques - spectrophotométriques
SPECTROPHOTOMETRIE D’ABSORPTION MOLECULAIRE Principe Utilise la capacité d’absorption de lumière d’une longueur d’onde fine et définie des substances dissoutes dans l’eau. Loi de Beer-Lambert (en expression logarithmique) : Log I0 /I = e . C .L = densité optique ou DO (directement proportionnelle à C) I = énergie lumière transmise I0 = énergie lumière incidente C = concentration substance en mole/l dans le solvant L = longueur du trajet optique (largeur de la cuve) e = coefficient caractéristique de la longueur d’onde (coef. d’absorption moléculaire) Si I=I0 -> le milieu est transparent, la transmission est de 100% et la DO = 0 Si I tend vers 0 , milieu opaque, la DO tend vers l’infini Spectre d’absorption lumineuse : représentation graphique des variations de densité optique de la lumière transmise lors de modification de la longueur d’onde de la lumière incidente. Spectres des substances : ultraviolet et visible. Conditions définies : solvant, pH, O sinon variation de l’emplacement des longueurs d’onde et de coefficient d’absorption

SPECTROPHOTOMETRIE D’ABSORPTION MOLECULAIRE Appareillage Nature spectrophotomètres : toutes les longueurs d’ondes sont disponibles Photomètres : certaines longueurs d’ondes Caractéristiques Sources lumineuses solides chauffés (tungstène , visible-infrarouge) (halogène, visible-UV) décharges des gaz raréfiés (hydrogène ou deutérium( UV, continu) (vapeur de mercure (UV, discontinu) Fente d’entrée forme rectangulaire Mono chromateur filtres colorés (verre ou gélatine) Filtres interférentiels (verre + métal) Prismes (dispersion de la lumière) Réseaux (idem) Fentes de sortie

SPECTROPHOTOMETRIE D’ABSORPTION MOLECULAIRE Appareillage Caractéristiques Cuves verre -> visible Quartz -> U.V. polystyrène Précautions d’utilisation (bulles, rayures,nettoyage) Cellules photoélectriques -> transformation énergie lumineuse en énergie électrique Tubes photomultiplicateurs Lentilles, miroirs, fibres optiques Amplificateurs Galvanomètres (mesure le courant fourni par l’amplificateur) Enregistreur Appareils photomètres : à filtres, peu coûteux spectrophotomètres : à réseaux ou à prismes (intéressants pour les spectres)

SPECTROPHOTOMETRIE D’ABSORPTION MOLECULAIRE Applications Détermination du spectre caractérisation substance Mesure de concentration directe (Hb. Protéines) Indirecte (urée diacetylmonoxime) Réflectométrie Mesure de l’absorption lumineuse au cours du passage d’une lumière monochromatique à travers une phase solide sur support réfléchissant. Applications Lecture de plaques de chromatographie, de bandelettes réactives Analyse automatique Luminométrie Mesure de la lumière émise par réaction chimique (Chimioluminescence) Applications réactions impliquant la luciférase (ATP ou O2)

PHOTOMETRIE DES MILIEUX TROUBLES Opacimétrie mesure de la lumière émise dans le même sens que la lumière incidente Néphélémétrie mesure de la lumière à 90° par rapport à la direction de la lumière incidente Turbidimétrie concentration ou épaisseur d’un milieu troublant la visibilité nette d’un test optique placé derrière ce milieu FLUORIMETRIE Principe : une molécule à l’état stable recevant une énergie sous forme de rayonnement passe à l’état excité. Le retour à l’état fondamental se traduit par l’émission de lumière mesurable. CHEMILUMINESCENCE Dans ce cas, l’énergie est d’origine chimique ou enzymatique Spectres d’émission comporte une longueur d’onde pour laquelle l’intensité est maximum d’excitation comporte une longueur d’onde pour laquelle l’intensité est maximum

SPECTROMETRIE D’ABSORPTION ATOMIQUE Principe Mesure de l’absorption de radiations photoniques spécifiques par des atomes en phase vapeur Loi de Kirchhoff : un élément métallique peut absorber les radiations qu’il est lui-même susceptible d’émettre Atome métallique + énergie lumineuse  état excité Retour à l’état fondamental radiations caractéristiques (raie de résonance) Inversement Vapeur atomique (atomes état fondamental) + radiation  absorption de la radiation Appareillage Sources de radiation : lampe à cathode creuse ou lampes à excitation HF Production de la vapeur atomique : source d’atomisation à flamme ou électrothermie Systèmes de correction d’absorption non spécifique Système de lecture : monochromateur puis photomultiplicateur Applications Dosage des métaux et alcalinoterreux (biologie clinique, toxicologie, pharmacologie)

PHOTOMETRIE D’EMISSION ATOMIQUE Principe Mesure de l’intensité d’énergie lumineuse spécifique émise par un élément chauffé dans une flamme (raie de résonance) Appareillage Nébuliseur – brûleur (solution à doser nébulisée dans une flamme (air-propane,acétylène) Système de lecture : filtre interférentiel à bande étroite + dispositif photosensible Applications Dosage des alcalins Na, K, Li (biologie clinique) Inconvénient Manipulation des gaz Avantages Fiabilité, spécificité, linéarité, simplicité

Spectrophotomètres Schéma

MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES méthodes analytiques
METHODES ELECTROCHIMIQUES Principe Echange d’électrons entre électrode et substance électroactive (électrode = cathode ou anode) Méthodes Méthodes en pleine expansion, souvent automatisables (biochimie analytique du GR ou analyses de biologie délocalisée) Les méthodes sont de 2 types selon l’importance de l’électrolyse :  ampérométrique : ampérométrie : microélectrolyse avec concentration relativement constante de l’analyte. Potentiel constant, intensité courant proportionnelle à concentration Analyte - Application : détermination de la PO2 ou étude post-chromatographique haute pression. potentiométrie : les électrodes sont spécifiques à membrane. Intensité courant constante,analyse des variations de potentiel en fonction de la concentration analyte  coulométrique : coulométrie mesure la consommation complète du produit à analyser. Intensité ou potentiel imposé. - Application : dosage du fer sérique par coulométrie à potentiel imposé.  voltamétrie et polarographie. Application peu usuelle

RADIOANALYSE Principe La plupart des éléments naturels existent à l’état de mélange d’isotopes Masse noyau  et Nombre électron = propriétés chimiques identiques Les radioisotopes sont instables. Leur désintégration  libération e- ou rayon g Il est possible de créer des réactifs marqués par radioisotopes pour l’usage biologique. Méthodes Les radioisotopes peuvent être détectés de diverses manières : - compteur Geiger (ionisation d’un gaz) - compteur à scintillation (éclair lumineux) - autoradiographie (impression d’une plaque photographique) Applications - toute technique d’analyse biochimique (cf : reste du cours !) - étude métaboliques : traçage des processus cellulaires : précurseur radioactif , étape métabolique, mesure biochimique , autoradiographique,..

MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES méthodes analytiques - enzymologie
Enzyme Définition catalyseur biologique de réaction biochimiques Spécificité vis à vis de la molécule sur laquelle il agit = substrat Variable (notion d’affinité) Structure Préparation et purification Protéines Parfois fragilisées par les séparation des constituants cellulaires Site actif = sites privilégiés de fixation du substrat Proenzyme = forme inactive à transformer pour activation Isoenzymes = différentes protéines à même spécificité enzymatique correspondent souvent à des protéines formées de plusieurs chaînes polypeptidiques à combinaisons variables entre elles (LDH) Il existe des protéines à plusieurs fonctions enzymatiques Enzyme et structure cellulaire - enzymes impliquées dans une chaîne métabolique ont souvent la même localisation cellulaire parfois regroupements en complexes poly-enzymatiques difficilement dissociables

Enzyme Régulation de l’activité enzymatique Formes allostériques différences de forme spaciale Certaines substances - ligands- modifient ces formes Ce sont des effecteurs allostériques (parfois substrat ;dans ce cas la courbe de la vitesse de réaction en fonction de la concentration prend la forme d’une sigmoîde) Certaines substances de bas PM ont également des effets effecteurs ou inhibiteurs  modification de l’affinité pour le substrat régulation métabolique Cas de la régulation par le produit terminal de la chaîne métabolique = rétro inhibition ou inhibition par feed-back Enzyme à concentration faible par rapport aux autres enzymes de la chaîne métabolique, enzyme régulateur de la chaîne  effet limitant Classification internationale des enzymes => numérotation 1 = oxydoréductases : réactions d’oxyoréduction 2 = transférases : transfert de groupements fonctionnels 3 = hydrolases : réactions d’hydrolyse 4 = lyases : suppression ou fixation d’un groupement=>double liaison 5 = isomérases : réactions d’isomérisation 6 = ligases : liaison (c-o, c-n, c-c, c-s) avec coupure d’une molécule d’ATP

Dosage des enzymes Moyens :méthodes immunochimiques (comme autres protéines, cf suite du cours) méthodes de mesure de l’activité catalytique Mesure quantitative (activité catalytique) Mesurer la vitesse de réaction  apprécier la quantité d’enzyme v = k{Enz] v = molécules de substrat tranformées par minute [Enz] concentration en enzyme k = constante dépendant de la nature de l’enzyme Paramètres concentration en substrat mesure, pour chaque concentration, de la vitesse initiale (tous paramètres stables) aspect de la courbe dû au fait que, à concentration faible, toutes les molécules d’enzyme ne sont pas saturées pour une concentration en substrat la vitesse est donnée par : équation de Michaelis-Menton : v = Vmax {S] / {S] + {KM] KM : caractéristique de l’enzyme, exprimée en molécules.l-1 Souvent transformation pour obtenir une représentation graphique linéaire (équations de Lineweaver-Burk, Eadie-Hoftee)

Dosage des enzymes Paramètres Température et pH résultante entre effets activateurs et inhibiteurs Coenzymes partie non protéique – souvent transformé lui-même souvent transporteur de groupements fonctionnels ATP, coenzymeA, biotine, pyrophosphate de thiamine Activateurs autres : ions métalliques (Zn, Mg..), protéines inertes (albumine) protecteurs des thiols Inhibition compétitive : analogue structural du substrat modification par ajout de substrat modification de la KM non compétitive complexants, inhibiteurs d’une fonction chimique aucun effet d’ajout de substrat pas de modification de la KM  nécessité de standardisation, de contrôles interne, externes

Dosage des enzymes conditions classiques large excès de substrat température = 37° ou 30° pH = pH optimal protecteurs enzymatiques dilutions ( !) Expression des résultats v de la réaction / ml ou mg de protéines v = mmoles de substrat / mn à 30°  UI Katal = 1 mole/seconde 1 UI = 16 nkatal

Dosage des enzymes Techniques de mesure 2 possibilités : disparition du substrat ou apparition du produit méthodologies de mesure photométrie coloration du produit , différence d’absorption fluorimétrie technique plus sensible, soit fluorescence spontanée, soit transformation par modification pH, ajout réactif, transformation structure causes d’erreurs (fluorescence propre , impuretés témoin « blanc réaction ») radioisotopie substrat radioactif  séparation sensible, peu d’interférences impossibilité d’automatisation prix élevé, difficultés de fabrication Immunochimie Anticorps-anti-enzyme pour séparer différentes activités Spécificité pour une isoforme Etude des modifications génétiques

Dosage des substrats Dosages en point final Excès d’enzyme Possibilité d’utiliser une deuxième réaction de révélation Mesure en fin de réaction par photométrie ou radioenzymologie Dosages par méthode cinétique Enzyme à Km élevée (éventuellement inhibiteur compétitif) Mesure de la vitesse de réaction à 2 temps rapprochés et comparaison avec la courbe établie à partir de quantités connues de substrat La plupart du temps ; méthodes des analyseurs multiparamétriques

MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES méthodes analytiques - immunochimie
Principe utilise la spécificité remarquable de la liaison antigène – anticorps due à la complémentation stéréochimique qui la caractérise Nature des réactifs Anticorps protéine particulière synthétisée par les lymphocytes B Architecture de base à 2 chaînes lourdes et légères Polymorphisme très élevé Site Ac toujours situé en extrémité N terminale Liaison Ag-Ac par site antigénique et site anticorps Chaque anticorps possède une afffinité particulière à l’égard de l’épitope qui lui correspond Antigène Nombre d’épitopes variable de 1 pour les molécules hapténiques à plusieurs centaines pour certains virus

Préparation des réactifs immunochimiques Immunisation expérimentale d’animaux la plupart du temps Préparation des antigènes Grosses molécules spontanément immunogènes injection directe Haptènes = molécules PM <5000  couplage avec grosses molécules (albumine, adjuvant de Freund) Préparation des anticorps Anticorps polyclonaux Mélange d’anticorps issus de nombreuses cellules lymphoïdes  Ac reconnaissant des épitopes différents ou des aspects variés du même épitope ou un même épitope avec une affinité variable = immunsérums, excellents réactifs Nécessité de purifier l’immunsérum de le concentrer en anticorps (précipitation Ig) Anticorps monoclonaux Proviennent de l’hybridation d’une cellule lymphocytaire avec une cellule tumorale (plasmocytome) =>cellule hybride immortelle =>clone à fabrication indéfinie et stabilisée d’1 anticorps avantages : production industrielle préparation à partir d’antigènes inconnus

Etalonnage Réaction Ag-Ac sensible à l’environnement  étalonnage et dosage mêmes conditions (y compris nature du prélèvement) En général, il est en fait techniquement impossible de connaître la quantité exacte d’antigène dans le milieu d’étalonnage => expertises et définitions d’unités internationales distribution de solutions d’étalonnage sous les auspices de l’OMS Méthodes Nombre et variété impressionnants Classification possible selon le phénomène observé et mesuré Observation directe du complexe Ag-Ac : précipitation, agglutination Observation indirecte par l’intermédiaire d’une marque attachée soit à l’antigène, soit à l’anticorps. Marque = molécule détectable par un appareil ou les sens. Observation par intermédiaire d’un phénomène biologique Applicables à la quantification des antigènes et des anticorps mais dosage possible des antigènes (cf : remarques) Seulement estimation des anticorps (variabilité) Appréciation de la quantité des immuncomplexes

Standardisation et contrôles de qualité en immunochimie Valeurs des méthodes inégales : Reproductibilité seuil de détection Spécificité sensibilité aux interférences Commodité capacité à être automatisée coût Donc : évaluations, comparaisons généralement du mélange : « principe méthodologique, appareillage, réactifs » standardisation en fait impossible  définition de valeurs de consensus  mise au point de matériel réactif de référence

MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES méthodes analytiques – observation microscopique
Principe Utilisation d’amplification du signal par lentilles optiques pour détecter des objets de taille inférieure à celle décelable à l’observation à l’œil nu. Méthodes On distingue : la microscopie photonique qui, comme son nom l’indique, utilise des lampes à émission de photons (longueurs d’ondes UV visibles). Préparation spéciale :coloration sélective (entraîne la nécessité d’augmenter la sensibilité par activité enzymatique ou par fluorescence)  le microscope à fluorescence permet la détection de protéines ou d’autres substances. Il est possible d’utiliser des anticorps marqués (fluorescents ou révélés par activité enzymatique). Ces anticorps se lient à la surface des molécules de la cellule vivante ou à l’intérieur de la cellule fixée perméabilisée. Il y a possibilité de détection de variation de concentration et localisation de molécules à l’intérieur de la cellule.  la microscopie par diffraction des rayons X : révèle un arrangement tridimensionnel moléculaire.

la microscopie électronique qui utilise un faisceau d’électrons. Contraintes spécifiques : la fixation est nécessaire (elle utilise en général des produits identiques à ceux décrits pour la déprotéinisation) coupe en tranches fines (souvent inclusion dans résine ou cire) les mêmes préparations avec révélation (enzyme, peroxydase ou or colloïdal) utilisées pour la microscopie optique peuvent être utilisées en microscopie électronique La microscopie électronique par cryofracture (cassure des structures internes de la cellule par le froid intense) localise la distribution de proteines intra-cellulaires. La technique de coloration négative : entraîne la révélation d’agrégats macromoléculaires ou l’agencement des sous-unités protéiniques.

MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES valeurs
Mesure d’un paramètre biologique chez un individu  Valeur à situer par rapport aux valeurs possibles donc nécessite que soient connues : Les valeurs représentatives de la population générale Les valeurs de référence Individus en bonne santé Conditions définies (exclusion des facteurs de variation) Les valeurs usuelles Population hétérogène (existent des facteurs incontrôlés) Population pathologique à risque (obèses…) Valeurs usuelles deviennent valeurs de référence si définition de la population et contrôle des facteurs d’interférence

MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES valeurs – listes des facteurs de variations biologiques Le choix des individus de la population de référence impose de connaître les facteurs de variations biologiques Etablissement de la liste = constitution de banques de données  Répertorier Littérature Facteurs physiologiques Facteurs pharmacologiques Quantifier Centres d’examens de santé Variations tissulaires physiologiques Variations pharmacologiques et pathologiques

Types de facteurs de variations biologiques
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES valeurs – listes des facteurs de variations biologiques Types de facteurs de variations biologiques Plusieurs propositions de classifications Variations génétiques ou acquises Variations dues à l’environnement Variations dues à des facteurs exogènes ou endogènes Variations dues à des facteurs physiologiques Facteurs de masse (graisse, muscle, foie  enzymes) Facteurs métaboliques Très régulés Produits de catabolisme Produits impliqués dans les mécanismes de synthèse à partir du plasma (glucose, cholestérol…)

création de sous ensembles homogènes
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES valeurs - sélection de la population de référence La sélection de la population de référence utilise 2 types de critères Les critères de stratification ou facteurs de variation maîtrisables  création de sous ensembles homogènes personnalité des groupes environnement histoire En général : âge, sexe, masse corporelle, origine ethnique Les critères d’exclusion ou facteurs de variation non maîtrisables pathologies prise de médicaments état physiologique sujets à risque

Individus de référence
MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES valeurs – le concept de valeur de référence Filiation entre les différents termes Individus de référence Constituent la Population de référence À partir de laquelle est sélectionné un Valeur observée chez un individu Échantillon de référence Pouvant être comparée aux Sur lequel on détermine des Valeur de référence Sur lesquelles on observe une Distribution de référence À partir de laquelle est déterminée une Limite de référence Qui sert à définir l’ Intervalle de référence

MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES valeurs – le concept de valeur de référence
Études bibliographiques et expérimentales Liste des facteurs de variations biologiques et pathologiques à posteriori Sélection des sujets à priori Critères de stratification, d’exclusion Préparation des sujets = population de référence Préparation des sujets questionnaire Prélèvement Traitement du spécimen analyse Prélèvement Traitement du spécimen analyse Sélection de l’échantillon de référence Critères de stratification, d’exclusion Traitements statistiques Traitement statistique Vérification de la représentativité Valeurs de référence

MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES méthodes analytiques - publication
ELEMENTS D'UN ARTICLE SCIENTIFIQUE journal Date de parution titre Auteurs + adresses Mots clefs résumé introduction Exposé du problème à résoudre Etat des connaissances Plan du travail Matériels (techniques et biologiques) et méthodes Résultats + commentaires (Tableaux – Figures) Discussion (Tableaux – Figures) conclusion remerciements bibliographie

MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES méthodes analytiques - publication (X linked recessive icthyosis) MATERIEL BIOLOGIQUE UTILISE  biopsie cutanée  fibroblastes cultivés  sang  leucocytes isolés METHODES UTILISEES culture cellulaire sédimentation en polyvinylpyrolidone centrifugation lyse cellulaire (ultrasons) mesure activité enzymatique :  radiochimie  blanc réactif + blanc réaction  double essai  mesure par fluorimétrie en substrat artificiel (méthylumbelliférone)

MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES méthodes analytiques - publication (X linked recessive icthyosis) RESULTATS blanc réactif (conditions d'incubation) conditions de réaction STS  comparaison de tampon Tris et phosphate  sensibilité dans les leucocytes  temps incubation  activité spécifique substrat  concentration en protéines de l'échantillon ARS-C  tampon phosphate à pH 8,5 détermination des valeurs de référence  des valeurs des patients des valeurs des porteurs CONCLUSION intérêt du dosage de la STS intérêt de la mesure dans plusieurs types cellulaires pour le dépistage des porteurs

MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES méthodes analytiques – publication (purification microfibrilles MATERIEL BIOLOGIQUE UTILISE Ligaments de la nuque de fœtus de boeuf METHODES UTILISEES Préparation de microfibrilles natives intactes ( ) Centrifugation en gradient de densité  directement ou après traitement avec hyaluronidase toute la nuit  en gradient de C3CL (densité initiale 1,35 g/ml) soit  72 H, rpm  15 fractions de 0,8 ml soit  congélation4 H à -80°C, 18 H centrifugation, rmp Analyse biochimique  dialyse contre tampon 50 mM Tris/HCL, pH 7,4, contenant 0,2 M NaCl  mesure densité optique à 280 nm par analyse spectrophotométrique SDS PAGE  dialyse contre eau distillée (aliquot 0,5 ml)  congélation  SDS PAGE à 6 % de SDS en condition réductrice (dithiothreitol)  coloration des protéines ou bleu de Coomassie Immunobuvardage (ou "blotting")  sur membrane de cellulose (aliquot 50 µl)  anticorps : anticollagène VI, antifibrilline, anti MAGP-1, anti LTBP-1, anti LTBP-2, antifibronectine  révélation par chemiluminescence Microscopie électronique à ombrage rotatif  observation du mélange initial riche en microfibrilles et des fractions de centrifugation en gradient

MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES méthodes analytiques – publication (purification microfibrilles) RESULTATS Centrifugation en gradient de densité  gradients de 1,28 à 1,43 g/ml (72H ou 18H après congélation)  mesure de la densité optique à 280 nm  protéines à densité 1,30, 1,33 et 1,41 g/ml après traitement par hyaluronidase, pic protéines 1,33 et 1,37 g/l SDS PAGE et Immunobuvardage  fractions 6 et 7  collagène VI chaîne 1 et 2 et chaîne 3  fractions11 et 12 protéine de 330 kDa  fibrilline avec colocalisation MAGP-1  sommet du gradient fractions 1 et 2  LTBP-1 et LTBP-2 Microscopie à ombrage rotatif - préparation non traitée à la hyaluronidase  fractions 6 et 7  collagène VI en aggregats + quelques fibres de fibrilline  fractions 11  µfibrilles de fibrilline - préparation traitée à la hyaluronidase  fractions 6 et 7  µfibrilles de collagène VI DISCUSSION (CONCLUSION) La méthode proposée permet une analyse structurale fine et précise des µfibrilles.

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