Zine-Charaf AMIR Service de Pathologie, CHU Mustapha- Alger Recherche de la mutation EGFR dans le CBNPC Bonnes pratiques anatomo-pathologiques ‘Expérience du CHU Mustapha’ Zine-Charaf AMIR Service de Pathologie, CHU Mustapha- Alger Journée thématique sur la prise en charge du cancer bronchique Tizi Ouzou, 06 Mai 2017

Le cancer du poumon 1er cancer dans le monde : incidence et mortalité En Algérie : 1er cancer chez l’homme (Tx St : 25,8/100 000 Hb) âge m. 61 ans * > 70% : stades localement avancés ou métastatiques  Dc Bx  Trt médical But du Trt : Amélioration SG , DFS tout en améliorant ou en préservant la qualité de vie  plusieurs thérapeutiques : CMT, T ciblées et Immunothérapie * Hamdi Cherif : Réseau National des registres du cancer Algérie (incidences 2014)

INTRODUCTION Les avancées moléculaires ont considérablement modifié la prise en charge du CBNPC Les cibles principales pour lesquels le traitement de référence est maintenant en première ligne sont :  Epidermal growth factor (EGFR),  Anaplastic lymphoma kinase (ALK), ROS1 L’Histologie, histochimie, IHC, biologie moléculaire occupent une place de plus en plus importante dans l’indication d’une thérapie ciblée Le cancer du poumon est composé de deux types histologiques principaux : le cancer à petites cellules (CPC) et le cancer non à petites cellules (CBNPC) : AD, CE…

Cancer Bronchique en 2017 ~ 15% ~ 85% Adénocarcinome ‘AD’ + fréquents Carcinome à petites cellules ‘CPC’ Carcinome à petites non à cellules ‘CNPC’ Adénocarcinome ‘AD’ + fréquents Carcinome à Grandes Cellules ‘CGC’ (P/op) CNPC NOS (Bx) 10% Carcinome épidermoide’CE’

De la morphologie à la biologie moléculaire Rôle du Pathologiste Identification des cancers du poumon différents sur le plan moléculaire

Anomalies moléculaires des CBNPC / Adénocarcinomes Herbst: p1374, col2, par2, ln1-5 NCCN: pMS-6, col2, par1, ln1 & ln7-11 & ln14-18 Multiples cibles Essais cliniques NCCN: pMS-6, col1, par3, ln8-13 Molecular heterogeneity of NSCLC tumors can lead to significantly different outcome or response to therapy in patients with similar clinical stage NSCLC and tumor histology.1 Some of the genetic abnormalities have emerged as prognostic and predictive markers for NSCLC. For example2: EGFR mutation is a predictive marker of better response to EGFR TKI therapy. KRAS mutation is a prognostic marker of shorter survival compared to patients with wild-type tumor, and it is a predictive marker of lack of benefit from platinum-based chemotherapy or EGFR tyrosine kinase inhibitor therapy. ALK fusion gene is a predictive marker of treatment response to ALK inhibitor. References Herbst RS, Heymach JV, Lippman SM. Lung cancer. N Engl J Med. 2008;359:1367-1380. Referenced with permission from NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology (NCCN Guidelines® Non-Small Cell Lung Cancer V.2.2012. ©2011 National Comprehensive Cancer Network, Inc. All rights reserved. Accessed 11/01/2011. To View the most recent and complete version of the guideline, go online to www.nccn.org. NATIONAL COMPREHENSIVE CANCER NETWORK®, NCCN®, NCCN GUIDELINES®, and all other NCCN Content are trademarks owned by the National Comprehensive Cancer Network, Inc.).

Anomalies moléculaires des CBNPC / Adénocarcinomes Herbst: p1374, col2, par2, ln1-5 NCCN: pMS-6, col2, par1, ln1 & ln7-11 & ln14-18 Lesquels tester ? NCCN: pMS-6, col1, par3, ln8-13 Molecular heterogeneity of NSCLC tumors can lead to significantly different outcome or response to therapy in patients with similar clinical stage NSCLC and tumor histology.1 Some of the genetic abnormalities have emerged as prognostic and predictive markers for NSCLC. For example2: EGFR mutation is a predictive marker of better response to EGFR TKI therapy. KRAS mutation is a prognostic marker of shorter survival compared to patients with wild-type tumor, and it is a predictive marker of lack of benefit from platinum-based chemotherapy or EGFR tyrosine kinase inhibitor therapy. ALK fusion gene is a predictive marker of treatment response to ALK inhibitor. References Herbst RS, Heymach JV, Lippman SM. Lung cancer. N Engl J Med. 2008;359:1367-1380. Referenced with permission from NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology (NCCN Guidelines® Non-Small Cell Lung Cancer V.2.2012. ©2011 National Comprehensive Cancer Network, Inc. All rights reserved. Accessed 11/01/2011. To View the most recent and complete version of the guideline, go online to www.nccn.org. NATIONAL COMPREHENSIVE CANCER NETWORK®, NCCN®, NCCN GUIDELINES®, and all other NCCN Content are trademarks owned by the National Comprehensive Cancer Network, Inc.).

CBNPC : Anomalies génétiques ROS1 1% Thérapie ciblée  mut EGFR, fusion ALK et ROS1 (pour le moment)

Mutation du gène EGFR Mutations plus communes  Délétion exon 19 ou mutation exon 21 10 à 20% des CNPC stade avancé Clinique : femme jeune, non tabagique Histo : AC bien différencié avec aspect : lepidic, acinaire, papillaire Pas de nécrose Pas de réaction lymphocytaire du stroma tumoral Technique validée de mise en évidence : Real Time – PCR (séquençage Sanger, pyroséquençage, ARMS r PCR …..) Trt : réponse aux anti –TK Resistance : rechercher mutation EGFR T790M

EGFR Récepteur de croissance épidermique membranaire à activité thyrosine kinase Impliquer dans la croissance et la différenciation cellulaire Muté dans 10 à 20% des ADK du poumon chez les caucasiens et 35 à 45 % chez les asiatiques Les mutations oncogéniques sont retrouvées au sein des exons de 18  21

Quand collecter le tissu tumoral pour le testing EGFR ? Les échantillons utilisés pour le diagnostic de la tumeur serviront pour les tests moléculaires Disposer de plus de tissu possible pour permettre diagnostic et tests moléculaires est d’une importance primordiale Archiver soigneusement les blocs d’inclusion après le diagnostic pathologique initial Rebiopsier au moment de la récidive ou de la progression de la maladie ou si les specimens sont insuffisants pour l'analyse de mutation Pirker et al., J Thorac Oncol 2010;5:1706–1713.

Guidelines pour la pratique des tests moléculaires ‘2013’

Guidelines pour la pratique des tests moléculaires ‘2013’ Qui tester ? Recherche concomitante des mut. EGFR et réarrangement ALK  tout patient présentant un AC AC pulmonaire pur de tout grade NSCLC avec composante AC NSCLC avec une IHC en faveur d’une composante AC *indépendamment des caractéristiques cliniques / âge, sexe, race, tabagisme NSCLC , CE, SCLC sans pouvoir exclure complètement une composante AC sur specimen de petite taille (Bx, cytobloc..): sur la base des critères cliniques (jeune âge, peu ou pas tabagique…)

Guideline pour la pratique des tests moléculaires ‘2013’ Quand Rechercher la mut. EGFR ? Au moment du Dc : stade IV (pTNM 2009) / stade I, II et III encouragé si RCP favorable Récurrence ou progression chez patient qui était à un stade moins avancé et n’ayant pas déjà bénéficié de tests moléculaires Re-tester si progression de la maladie (PD) sous Trt pour attester de l’évolution du profil moléculaire

Guidelines pour la pratique des tests moléculaires ‘2013’ Rechercher la mut. EGFR Sur quel specimen ? Site primitif ou méta Chaque tumeur si T pulmonaires primitives multiples Une seule zone si tumeur unique Abord le plus facile et moins délétère; tissu T le plus abondant Trauma minimum

Guidelines pour la pratique des tests moléculaires ‘2013’ Rechercher la mut. EGFR et réarrangement ALK : Quel Matériel et quel Type de prélèvement? Prélèvement fixé au formol inclus en paraffine (FFPE) - Fixation rapide formol, durée idéale < 24h à 48h (pas d’acides ni de métaux lourds, ni décalcifiants) Cytoblocs

Guidelines pour la pratique de tests moléculaires ‘2013/approuvées à l’ASCO : octobre 2014’ Délais acceptables ? Prélèvement adressé en pathologie moléculaire dés le DC /24h ou 3 j ouvrables s’il est à distance Rendu des résultats : < 10 j ouvrables à compter de la réception du prélèvement en pathologie moléculaire Compte rendu clairement rédigé et compréhensible (oncologues, pneumologues …)

Guidelines pour la pratique des tests moléculaires ‘2013’ Rôle du pathologiste : Tissu priorisé pour testing EGFR contrôle morphologique de la tumeur à analyser  Sélection et validation du tissu tumoral (qualité et quantité d’ADN)  Microdissection : 5 lames blanches , coupes de 5 à 10 μm (>200 cell. T) 5 LB + 1 HE

Etape pré-analytique Sélection précise du matériel T. Primordiale : effectuée par le pathologiste A partir des blocs ‘FFPE’ destiné au testing mol.. : HE Sélection de blocs représentatifs s’assurer nature néo (AC) du specimen éviter erreurs de bloc (étiquetage peu lisible, bloc épuisé, limites de résection saines, …  HE de contrôle systématique Une faible cellularité tumorale peut être à l’origine de faux-négatifs  « dilution» de rares cellules tumorales parmi cellules normales sans mutation

Etape pré-analytique Qualité de la fixation : cruciale Immédiate Fixateur : formol neutre tamponné , 10 X le vol. du specimen Proscrire Ac picrique, fixateurs à base de métaux lourds, décalcifiants … fragmentation ADN Durée de fixation entre 24 et 48 h Certains pré-requis d’ordre qualitatif et quantitatif sont indispensables pour le déroulement optimal de la détermination moléculaire Eviter ischémie froide Fixation /congélation (au bloc op. s’il est situé à distance de l’an apath en rexspectant les recommandations d’ouverture de le p/op et sa fixation?) pb meta osseuse car décalcifiant = acide Bouin Dubosq à proscrire car acide picrique Congélation possible

Recommandations pathologistes Gestion des blocs Dc initial Ne pas trop dégrossir les blocs Bleu alcian, TTF1, p40 (Napsin A, p63 ou CK5/6) (recommandations classification IASLC/ATS/ERS: 02 Ac) Réserver des lames blanches et/ou une biopsie pour l’analyse moléculaire • Plateforme: lames blanches stockées à 4°C avant extraction • Archivage: blocs protégés de la lumière et des variations de température

Etapes techniques Contrôle morphologique Extraction d’ADN PCR Compte rendu Microdissection  30 % cellules tumorales

Validation de la technique  Contrôle qualité externe

Plateformes hospitalières de génétique moléculaire des cancers Objectifs : • Assurer une équité d’accès aux tests moléculaires innovants • Pour tous les patients de la région, quelque soit l’établissement où ils sont pris en charge • Assurer des tests de qualité  03 plateformes pour EGFR en Algérie

Notre expérience Bilan EGFR sur une année : 2015 - 2016 135 tests réalisés 113 validés 19 mut EGFR (16,8%) 14 H et 5 F Age m: 65 ans Adénocarcinome 94 non mutés 22 (16,3%) non validés

Mutations EGFR détectées n= 19 /113 (16,8%) Type de mut. EGFR T790M Exon 20 Délétion Exon 19 L858R Exon 21 L861Q Exon 21 S7681 Exon 20 G719x Exon 18 Exon 20 Ins GCT/CAC 2319-2320 2310-2311 Exon 20 Ins 9 2307- 2308 Nombre de cas : 17 1 (5,88%) Vs 5% 4 (23,52%) Vs 48% 2 (11,76%) Vs 43% Vs 3% 5 (29,41%) *1 cas avec triple mutation : T790M Exon 20 + L858R Exon 21 + L861Q Exon 21 *1 cas avec double mutation : Délétion Exon 19 + Exon 20 Ins GCT/CAC (2319-2320 /2310-2311) 48% 3% 5% 3% I. Rouquette, INCa 2011

Pourcentage de résultats non interprétables 16,3% * ADN non amplifiable … % de cellules tumorales < seuil de détection Les taux de résultats non interprétables ont diminué depuis le début

Résistances acquises post therapie anti-EGFR & mutation au niveau d’un second site du domaine kinase de EGFR EGFR T790M (60% aprés 8 à 16mois de TKI)  PCR-rt sur Bx tissu Vs Bx liquide MET amplification (kinases alternatives) Transformation en CPC  Bx  Dc

Intérêt de l’ADN circulant (ADNc) « biopsie liquide » Tests mol. sans prélèvement tissulaire tumoral Méthode non invasive, reproductible bonne alternative si : prélévement Tissulaire non réalisable Matériel épuisé ou pauvres en cells tumorales Mauvaise qualité ADN (métas osseuses) Suivi efficacité traitement : Disparition mutation activatrice EGFR Apparition de mutation de résistance (T790M) Par technique de PCR en temps réel comme pour les tissus juste l’extraction de l’ADN est différente ) Acheminement du prélèvement sanguin / protocole spécifique)

Conclusion Cancer du poumon : Maladie hétérogène Dc histologique est crucial dans l’évaluation du Cancer du poumon Trt dépend du sous type histologique : Distinction entre AC et CE essentielle La médecine personnalisée devient une réalité : anomalies génétiques (EGFR , ALK, ROS1) sont actuellement ciblées Tous les AC doivent être testés pour les mut EGFR , Fusion ALK…, ROS1 (BRAF, HER2, …?)  Thérapie ciblée Concertation pluridisciplinaire essentielle dont le But Traiter uniquement les patients pour lesquels le bénéfice est très important (efficacité ++) Eviter un traitement inutile, coûteux, toxique (qualité de vie ++) *Erik Thunnissen . An international interobserver study. Modern Pathology (2012), 1–10

Challenges actuels en anatomie pathologique Le pathologiste doit extraire du tissu du patient le maximum d’informations morphologiques et moléculaires, pour fournir les éléments Dc, Pc et prédictifs Il doit s’impliquer dans le testing moléculaire en interaction avec le biologiste , de la réception du specimen aux résultats Son rôle est central dans la prise en charge du patient au sein de l’équipe multidisciplinaire *

Je vous remercie