La culture des bactéries CIVEL / Microbiologie

La culture des bactéries I. Multiplication des bactéries Bactérie mère Allongement Invagination Division 2 bactéries filles La scissiparité

II. Techniques d’étude des caractères culturaux La culture des bactéries II. Techniques d’étude des caractères culturaux L’isolement : Obtention d’une colonie pure (ensemble de clones bactériens) En milieu solide : méthode des quadrants

méthode des quadrants 2 : Diviser la boîte de petri en 4 quadrants 3 : soulever le couvercle de la boite de Pétri et déposer l’inoculum (à l’aide de l’oese) sur une petite surface au point initial. 4 : stériliser l’oese et après refroidissement faire des stries serrées sur toute la surface des quadrants 1 et 2 3 5 : stériliser de nouveau l’oese et faire des stries serrées sur les quadrants 2 et 3. 2 4 6 : stériliser de nouveau l’oese et faire des stries serrées sur les quadrants 3 et 4. 1 7 : stériliser l’oese et placer la boite (correctement identifiée) à l’envers (couvercle vers le bas) dans l’étuve.

Isolement sur milieux solides, par la méthode des quadrants 2 3 Isolement sur milieux solides, par la méthode des quadrants 1 4

2 3 Colonies isolées - Le dépôt est effectué en zone 1-2, les colonies y sont serrées et petites. - La fin de l’isolement se fait en zone 4 : on retrouve des colonies isolées 1 4 Zone riche

Obtention d’une colonie pure (ensemble de clones bactériens) L’isolement : Obtention d’une colonie pure (ensemble de clones bactériens) Colonie isolée

Obtention d’une colonie pure (ensemble de clones bactériens) L’isolement : Obtention d’une colonie pure (ensemble de clones bactériens) Variantes

Obtention d’une colonie pure (ensemble de clones bactériens) L’isolement : Obtention d’une colonie pure (ensemble de clones bactériens) Ne jamais écrire sur le couvercle !! Initiales, N°de poste, référence de la souche

II. Techniques d’étude des caractères culturaux La culture des bactéries II. Techniques d’étude des caractères culturaux L’isolement : Obtention d’une colonie pure (ensemble de clones bactériens) En milieu solide : méthode des quadrants En milieu solide : méthode par épuisement

En milieu solide : méthode par épuisement Face Profil En milieu solide : méthode par épuisement

Stries Vue de face Gélose inclinée Vue de profil En milieu solide : méthode par épuisement

II. Techniques d’étude des caractères culturaux La culture des bactéries II. Techniques d’étude des caractères culturaux L’isolement : Obtention d’une colonie pure (ensemble de clones bactériens) En milieu solide : méthode des quadrants En milieu solide : méthode par épuisement L’examen macroscopique En milieu liquide

L’examen macroscopique : En milieu liquide SURFACE : Voile, Anneau Importance du trouble + (bulles ? Homogénéïté, couleur…) CULOT : Couleur, adhérence

L’examen macroscopique : En milieu liquide

II. Techniques d’étude des caractères culturaux La culture des bactéries II. Techniques d’étude des caractères culturaux L’isolement : Obtention d’une colonie pure (ensemble de clones bactériens) En milieu solide : méthode des quadrants En milieu solide : méthode par épuisement L’examen macroscopique En milieu liquide En milieu solide

L’examen macroscopique : Sur milieu solide L’étude de colonies

aspect de la surface, transillumination, consistance, L’examen macroscopique : Sur milieu solide L’étude de colonies Taille, forme, relief, contour, aspect de la surface, transillumination, consistance, couleur, présence d’un halo…

Halo opaque Halo clair Centre noir (colonie)

III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture La culture des bactéries III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture

III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture La culture des bactéries III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture III.1. Définitions Milieux de culture = préparation dans laquelle un microorganisme peut se multiplier. Il doit donc comporter tous les éléments nutritifs et les conditions physico-chimiques (pH, T°, concentration en ions…) nécessaires au développement du germe étudié. Ensemencer = c’est introduire un microorganisme dans ou sur un milieu de culture. Culture = c’est le résultat de la multiplication d’un microorganisme. -Culture pure = milieu ne contenant qu’une seule espèce bactérienne. (Notion de clone bactérien)

III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture La culture des bactéries III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture III.2 : composition chimique moyenne sèche d'une bactérie Éléments Pourcentage (en masse sèche) Carbone 50 Oxygène 20 Azote 14 Hydrogène 8 Phosphore 3 Soufre 1 Potassium Sodium Calcium 0,5 Magnésium Chlore Fer 0,2 divers 0,3

III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture La culture des bactéries III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture III.3. Composition d’un milieu de culture - Source de C et N et d’énergie (glucides (C), lipides (C et P), protides (C et N = peptone)) = elles fournissent de l’énergie et des matériels cellulaires aux bactéries. Peptones (muscles, cervelle d'animaux, caséine, gélatine, soja...) : contient des aa, fact de croissance, ions, glucides !! - Eléments minéraux = Na+, K+, Cl-, PO42-, Mg2+… Ils ont un rôle dans l’équilibre physico-chimique (pression osmotique) et les besoins en minéraux de la bactérie (+ CoEnzyme)

III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture La culture des bactéries III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture III.3. Composition d’un milieu de culture Eau = (solvant indispensable à la vie sur terre) rôle majeur dans les réactions de solvatation, hydratation, réactions chimiques et enzymatiques se réalisent majoritairement en milieu aqueux. Facteurs de croissance = ils stimulent la croissance et sont indispensables à certaines bactéries dites exigeantes (éléments que les bactéries ne savent pas synthétiser). Agar = composé présent dans les milieux solides. C’est un polyoside extrait d’algues japonaise (=gélose) qui à la propriété d’être liquide à >56°C et solide à 40°C. (- Autres : indicateur de pH, agents sélectifs…)

Exemple : la gélose ordinaire (GO) La culture des bactéries III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture Exemple : la gélose ordinaire (GO) Peptones = hydrolysat de protéines (source d’aa)  5 g source d’A, N, énergie + facteurs de croissance + apporte des ions Extrait de viande = macération de viande contenant des protéines, glucides, vitamines et sels minéraux. 1g NaCl 5g Maintien de la pression osmotique Agar 15g Solidifiant, support pour colonie Eau Qsp 1L Solvatation, hydratation, permet les réactions biochimiques

Exemple : le citrate de Simmons La culture des bactéries III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture Exemple : le citrate de Simmons Citrate de Sodium 1g Seule source de C NaCl 5g Maintien de la pression osmotique Sulfate de magnésium 0,2g Cofacteur enzymatique Dihydrogenophosphate Système tampon (limite les variations de pH) Hydrogénophosphate de potassium Bleu de bromothymol 0,08g Indicateur de pH Agar 15g Solidifiant, support pour colonie Eau Qsp 1L Solvatation, hydratation, permet les réactions biochimiques

IV. Les différents types de milieux de culture La culture des bactéries IV. Les différents types de milieux de culture Milieux empiriques Milieux synthétiques Milieux semi-synthétiques

IV. Les différents types de milieux de culture La culture des bactéries IV. Les différents types de milieux de culture Exemple : la gélose ordinaire (GO) – Nature du milieu : Milieu Empirique Peptones = hydrolysat de protéines (source d’aa)  5 g source d’A, N, énergie + facteurs de croissance + apporte des ions Extrait de viande = macération de viande contenant des protéines, glucides, vitamines et sels minéraux. 1g NaCl 5g Maintien de la pression osmotique Agar 15g Solidifiant, support pour colonie Eau Qsp 1L Solvatation, hydratation, permet les réactions biochimiques

IV. Les différents types de milieux de culture La culture des bactéries IV. Les différents types de milieux de culture Exemple : le citrate de Simmons – Nature du milieu : Milieu synthétique Citrate de Sodium 1g Seule source de C NaCl 5g Maintien de la pression osmotique Sulfate de magnésium 0,2g Cofacteur enzymatique Dihydrogenophosphate Système tampon (limite les variations de pH) Hydrogénophosphate de potassium Bleu de bromothymol 0,08g Indicateur de pH Agar 15g Solidifiant, support pour colonie Eau Qsp 1L Solvatation, hydratation, permet les réactions biochimiques

III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture La culture des bactéries III. Conditions d’une culture bactérienne et milieux de culture III.4. Caractéristiques physico-chimiques - pH = voisin de la neutralité (7 < pH < 7,5). RQ : certaines bactéries peuvent soit alcaliniser soit acidifier le milieu au cours de leur croissance ce qui peut finir par entraver leur multiplication. On a donc recours à des systèmes tampons pour limiter les écarts de pH (Ex : système KH2PO4 et K2HPO4)   + Conditions d’incubation : - T°C = elle doit être choisie en fonction du germe étudié (en général 37°C) - atmosphère = présence ou absence d’O2…

IV. Les différents types de milieux de culture La culture des bactéries IV. Les différents types de milieux de culture

IV. Les différents types de milieux de culture La culture des bactéries IV. Les différents types de milieux de culture IV.1. Conditionnement - Les milieux liquides = on parle de bouillon de culture. - Les milieux solides = on parle de gélose. Ils peuvent être conditionnés en boite de Pétri ou en tube (gélose inclinée) / agar-agar Isolement : Macroscopie / vérification de pureté

IV. Les différents types de milieux de culture La culture des bactéries IV. Les différents types de milieux de culture IV.2. Classification 421. Selon la composition - Milieux empiriques = composition non connue exactement (extrait de viande…) - Milieux synthétiques = composition qualitative et quantitative exactement connue. - Milieux semi-synthétiques = la base est empirique et on additionne une molécule connue.

IV. Les différents types de milieux de culture La culture des bactéries IV. Les différents types de milieux de culture IV.2. Classification 422. Selon l’utilisation - Milieux de conservation = milieu en général très pauvre - Milieux d’identification = milieux servant à identifier le germe (un caractère) - Milieux d’isolement = milieux servant à séparer les bactéries contenues dans un échantillon polymicrobien pour pouvoir, par la suite, les étudier séparément.

IV. Les différents types de milieux de culture La culture des bactéries IV. Les différents types de milieux de culture IV.2. Classification On distingue : a) les milieux d’isolement non sélectifs : permettent la culture de la plupart des bactéries. (GO, GTS, BCP…) Milieux usuel ou ordinaire : pour les microorganismes non exigeant (peptones, glucide, ions, eau) Milieux enrichis : addition de vitamines, sang...   b) les milieux sélectifs = contiennent un inhibiteur ou de conditions de culture défavorable qui empêche la culture des germes sauf celui qu’on étudie.

Les milieux sélectifs : Présence d’agents sélectifs nature Ex de milieux Bactéries inhibées Cristal violet Colorants Drigalski Bactéries Gram positif Desoxycholate Dérivé des sels biliaires Bile BEA Bactéries Gram négatif (et certaines Gram positif) Azide (de Sodium) ? Drigalski BEA

Les milieux sélectifs : Présence d’agents sélectifs nature Ex de milieux Bactéries inhibées Cristal violet Colorants Drigalski Bactéries Gram positif Desoxycholate Dérivé des sels biliaires Bile BEA Bactéries Gram négatif (et certaines Gram positif) Azide (de Sodium) ? Acide nalidixique + colimycine Antibiotiques GS + ANC Bactéries à Gram négatif NaCl à 75g/L Sel Chapman Gram- et certains Gram + (Enterococcus et Streptococcus) Cétrimide Antiseptique Gélose au Cétrimide Toutes bactéries sauf les Pseudomonas (et quelques exeptions) Drigalski BEA Chapman

Les milieux sélectifs : Présence d’ose et d’indicateur de pH

IV. Les différents types de milieux de culture La culture des bactéries IV. Les différents types de milieux de culture Milieux empiriques Milieux synthétiques Milieux semi-synthétiques Milieux de conservation Milieux d’identification Milieux d’isolement non sélectifs Milieux d’isolement sélectifs Milieux d’enrichissement

La culture des bactéries CIVEL / Microbiologie