Etude de l'adaptation des organismes marins en environnement variable

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1 Etude de l'adaptation des organismes marins en environnement variable
Arnaud Tanguy, Didier Jollivet Station Biologique de Roscoff, UMR CNRS 7144, Adaptation et Diversité en Milieu Marin, Equipe Ecologie et Génétique des Populations Marines

2 Mécanismes physiologiques et génétiques de la réponse aux stress chez l’huître creuse Crassostrea gigas Dario Moraga, Marie Thérèse Thébault, Philippe Soudant Christophe Lambert Laboratoire des Sciences de l’Environnement Marin (LEMAR) Institut Universitaire Européen de la Mer (IUEM) UMR CNRS 6539, Université de Bretagne Occidentale Plouzané. Equipe 3 de l’UMR 6539 Réponses des organismes et des populations à la variabilité environnementale Thème 2 Réponses aux stress et adaptation …

3 Approche génétique intégrée de la réponse au stress
Différents niveaux d’intégration et d’étude de la réponse des organismes face au stress Molécule Gène Cellule Groupes fonctionnels Communautés Peuplements Organisme Individu Population Réponse au stress Expression de gène Génotoxicité Protéines de stress Polymorphisme Dynamique de population Croissance Reproduction Abondance et diversité spécifiques, écologie Signification TOXICOLOGIQUE Signification ECOLOGIQUE

4 Approche génétique intégrée de la réponse au stress
Recherche de gènes candidats en réponse au stress environnementaux Analyse de l’expression des gènes Analyse du polymorphisme des gènes candidats Intégration des réponses: corrélation phénotypes / génotypes au niveau populationnel Paramètres biologiques (Fécondité, génotoxicité, etc.) Sélection / Adaptation ?

5 Les sources de stress oxydatif
Milieu hydrothermal Milieu côtier Caractéristiques des fluides Température élevée ( °C) Acides (pH 2.5 à pH 4.5) Métaux (Fe, Zn, Cu…) Gaz dissous (H2S, H2, CO2, CH4) Anoxie Radiations ionisantes Polluants anthropiques Gradients abrupts Température Concentrations en oxygène Concentrations en composés réduits (H2S, H2, CO2, CH4) Température Eutrophisation (MO)

6 État actuel des connaissances sur le stress oxydatif chez les mollusques marins
Très nombreuses études en écotoxicologie utilisant essentiellement - les mesures d’activités d’enzymes anti-oxydantes (SOD, catalases, …) - le dosage des ROS et du GSH comme biomarqueurs de stress Peu d’études au niveau moléculaire (absence d’organisme modèle, peu d’outils moléculaires relatifs au stress oxydant)

7 Les modèles biologiques étudiés
Mollusques Bathymodiolus azoricus Crassostrea gigas Mytilus edulis Paralvinella grasslei Paralvinella sulfincola Annélides Alvinella pompejana

8 Approches moléculaires employées: transcriptomie différentielle
Approches globales: Banque cDNA Approche spécifique Banques SSH ARNm Stressed samples Control samples tissues ARNm ARNm Substraction of common genes Up-regulated genes Down-regulated genes

9 Approches moléculaires employées: transcriptomie différentielle
Métaux lourds Pesticides Hydrocarbures Salinité Température Hypoxie Infections bactériennes Modèle Crassostrea gigas Tous convergent vers une production de radicaux libres Analyses des profils transcriptomiques: recherche des gènes communs ou spécifiques de plusieurs stress hypoxie xénobiotiques n y R X Identification des différentes voies de régulation et de détoxication du stress oxydatif Stress abiotiques Infections pathologies a

10 BANQUES SSH sur Crassostrea gigas: effets de l’hypoxie
Gènes sur-exprimés (24 jours) Cytoskeleton, structure, matrix Respiratory chain Nucleic acids regulation Detoxification Amino acids metabolism Energetic metabolism Protein regulation Cellular communication, immune system, receptor Stress protein Reproduction Lipids metabolism Development, differenciation Ribosomal protein Unknown functions ESTs Cytochromes P4501A1 SOD HSP70 Gluthatione peroxydase Glutamine synthetase Delta-9-desaturase Arginine kinase Glycogen phosphorylase Anhydrase carbonique BANQUES SSH sur Crassostrea gigas: effets de l’hypoxie Gènes inhibés (7-10 jours)

11 BANQUES SSH sur Crassostrea gigas: effets de l’hypoxie
1 2 3 7 10 14 17 21 24 * 4 6 8 Métabolisme lipidique: maintien de la structure membranaire Delta-9 désaturase Manteau Peroxiredoxine 6 Enzyme antioxydant Expression relative Glande digestive Protéine de stress Protection cellulaire Fonction anti-oxydante Metallothionein 4 Manteau * Forte variabilité inter-individuelle de l’expression des gènes Expression tissu-specifique * Expression régulée au cours du temps Temps d’exposition (jours) hypoxie normoxie

12 BANQUES SSH sur C. gigas: effets des hydrocarbures
Phase I Oxydation par les monooxygénases Récepteurs Phase II Conjugaison à des composés endogènes Dommages ADN Phase III Elimination active métabolites hydrosolubles H Hydrocarbures (H) métabolites réactifs BANQUES SSH sur C. gigas: effets des hydrocarbures

13 BANQUES SSH sur C. gigas: effets des hydrocarbures
détoxication des hydrocarbures régulation des lipides protéines de stress cytosquelette chaine respiratoire régulation des acides nucléiques régulation des protéines communication cellulaire métabolisme énergétique protéines ribosomales EST induit 7 jours inhibé 7 jours induit 21 jours inhibé 21 jours 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 258 gènes potentiellement régulés par les hydrocarbures * 10 gènes codant pour des enzymes impliquées dans la biotransformation Cytochromes P4501A1 et 3A4 Cytochrome b5 Monoamine oxidase A (MAO A) Monooxygenase à flavine 2 (FMO-2) 4 Glutathione S-transferases (GST) Sulfotransferase 1C1

14 BANQUES SSH sur C. gigas: effets des hydrocarbures
0.2 kb M 3 7 11 15 jours T T CYP1A1 Phase I Induction * ** jours jours GST pi GST sigma GST omega GST mu T Phase II RT-PCR Multiplex jours Induction des GSTs mu et omega Inhibition de la GST sigma

15 Hem IC (Intracellulaire)
Effets de la température sur P. grasslei: induction de stress oxydant Hémoglobines 1 10 100 1000 20° C Branchie 15°C Branchie 20° C Corps 15°C Corps expression HemL3 Hem B1   Hem IC Hem A2C À 15°C Sur expression: Hem IC (Intracellulaire) A 20°C sur expression: Hem L3 (Linker) Hem B1 (Extracellulaire) Gène du métabolisme mitochondrial 1 10 100 1000 20°C Branchie 15°C Branchie 20°C Corps 15°C Corps Temperature-Tissue expression MDH AAT Succinate Aconitase Gènes du stress oxydant 1 10 100 1000 20°C Branchie 15° C Branchie 20°C Corps 15°C Corps Temperature - Tissue expression PRX SOD GST Sigma À 15°C: sur expression Branchie: MDH, AAT, SDH Corps: Aconitase À 15°C: sur expression Branchie-manteau: GST sigma Branchie: PRX, SOD

16 Effets de la température sur P. grasslei: induction de stress oxydant
Augmentation de Température Réduction de la disponibilité d’O2 20° C 20° C PO2 15° C Transfert Bidirectionnel ? SOD ? Hémoglobines Intracellulaires IC Réservoir d’O2 Linker L3 Structure Hb Protection contre le ROS Hémoglobines Extracellulaires B1 et A2C Capture et transport d’O2

17 Effets de la température sur P. grasslei: induction de stress oxydant
Augmentation de la Température 20°C Altération de la stabilité membranaire (peroxydation lipidique) Métabolisme anaérobie? Stress Oxydatif SOD GST PRX ROS RHS Aconitase AAT MDH Protéines métaboliques Enzymes de protection

18 Alvinella pompejana sequencing project
6,600 with homolog proteins (51%) 4,000 contigs 9,000 singlets 49% with no homologs !!! (long ORFs with biased composition) blastX

19 Banques cDNA construites en 2005-2007:
ESTs (cDNA libraries): * 9000 unigenes chez Crassostrea gigas * 3500 unigenes chez Mytilus galloprovincialis * 1800 unigenes chez Ruditapes decussatus * 2500 unigenes chez Bathymodiolus azoricus * 2000 unigenes chez Paralvinella grasslei * 9000 unigenes on Alvinella pompejana * 300 unigenes on Lepetodrillus elevatus Marine Genomic Europe Network Alvinella Consortium Puce ADN disponibles ou en construction : * « gigas » micro-array (1500 spots) dédiée au stress: utilisée pour des analyses comparatives en milieu anthropisé. * « gigas » micro-array (9000 spots) C. gigas: collaboration avec le Marine Genomics Europe Program and Aquafirst (IFREMER-INRA) * Autres microarrays: en construction : moules, palourdes, annélides

20 Etude qualitative et quantitative des régulations
Projets de recherche en cours Transcriptomie comparée Catalogues de gènes régulés au cours des processus de réponse aux stress (biotiques, abiotiques, anthropiques,…) mais aussi liés aux différents stades de développement Développement de micro-array Temps [Gène X] PCR quantitative Etude qualitative et quantitative des régulations et/ou Intensité du stress

21 Projets de recherche en cours
Etude des convergences des réponses au stress sur une échelle évolutive * croissance * fitness * détoxication BIOLOGIE FONCTIONNELLE TRANSCRIPTOMIE: Régulation de l’expression des gènes PHYSIOLOGIE: * activité d ’enzymes régulées par le stress * Couplages génotype/phénotype (polymorphisme d’expression ou de séquence) Gradient et nature du stress oxydant

22 Régulation de l’expression des gènes
Projets de recherche en cours TRANSCRIPTOMIE: Régulation de l’expression des gènes Stress D Espèce 4 Stress B Espèce 2 Stress A Espèce 1 Espèce 3 X w n a Stress C Identification des différentes voies de régulation et de détoxication du stress oxydatif Comparaison inter-espèce(taxons) et/ou inter-stress des profils transcriptomiques: recherche de signatures de régulation communes ou spécifiques

23 Projets de recherche en cours
TRANSCRIPTOMIE: Régulation de l’expression des gènes Gène A Gène D Gène J Gène E Gène K Gène G Gène H Gène F Gène C Gène L Gène I Gène B Etude des co-régulations entre gènes Identification de network de gènes = Signatures moléculaires de réponse au stress

24 Relation génotype-expression de gènes.
Projets de recherche en cours Relation génotype-expression de gènes. Ex de Bathymodiolus Relation entre génotypes allozymiques et expression des ARNm PGM bas 6 6,5 7 7,5 8 8,5 100/100 100/95+95/95 105/ / /95 delta Ct HSP70 PGM haut 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 100/100 100/90+ 90/90 110/100+ 110/90 100/86+ 110/86 delta Ct HSP70 HSP70 Ferritine GF2a, yolk, GF2b / MDH haut et bas ; ferritine GF1 / LAP GPI ; anhydrase carbonique / MDH haut GPI ; MT / PGM haut Analyse canonique de redondance: mise en évidence de relation entre le génotype allozymique, l’expression des ARNm, le niveau de protéines de stress (?) et le temps (d’exposition et de récupération).

25 Projets de recherche en cours
* Couplages génotype/phénotype (polymorphisme d’expression ou de séquence) Expression et polymorphisme des gènes Activité protéique 1: TTT GGG GTC AAG 2: TTT GGG CCC AAG variant1 Variant 2 Activation de MT1 5 ’UTR 1er cas: présence de faibles concentrations en métaux - 60pb - 90pb MT1 MBF - 170pb MT2 2ième cas: présence de fortes concentrations en métaux Activation de MT2 Transformation dans E.coli BL21DE3 Culture en milieu liquide en présence de gammes de stress DO Temps

26 Dans quel cadre ? * OUEST-genopole® (projet fédérateur Mer-Agro-Santé): Génome, adaptation et environnement. Projet 5: Réponse au stress oxydatif chez l’huître Crassostrea gigas en environnement variable : expression et activité d’enzymes antioxydantes * ANR Genanimal (Cgphysiogen) CNRS IFREMER Universités Bases moléculaires des fonctions physiologiques chez Crassostrea gigas : interaction hôte/pathogène/environnement * Programme Européen « Marine Genomics Europe » Etude transcriptomique de la réponse au stress chez les mollusques marins. * Coopération franco-chilienne et franco-canadienne

27 Dans quel cadre ? * PRIR « AMETHYST » ( ) : Adaptation Multigénique et Evolution des Taxons HYdrothermaux aux conditions ‘extrêmes’ de température et d’anoxie : recherche de Signatures moléculaires convergentes au niveau du Transcriptome * Programme GIS « Alvinella » ( ) Etude de l’adaptation des Alvinellides aux conditions de stress thermique et oxydatif de l’environnement hydrothermal profond * Programme Européen « Marine Genomics Europe »: Etude transcriptomique de la réponse au stress chez les mollusques marins: comparatif hydrothermal-côtier.