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P rotéines de Stress : marqueurs de protéotoxicité

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Présentation au sujet: "P rotéines de Stress : marqueurs de protéotoxicité"— Transcription de la présentation:

1 P rotéines de Stress : marqueurs de protéotoxicité

2 Quest ce que les Hsp ? Hsp : Heat Shock Proteins Hsp : Heat Shock Proteins Hsp 70 Hsp 90 Hsp 90 Hsp 100 Hsp 100 Classées en plusieurs familles Classées en plusieurs familles Hsp de faible PM Hsp 60 Ritossa, 1962 : Choc thermique Ritossa, 1962 : Choc thermique Hsp 70 : hautement conservées Hsp 70 : hautement conservées

3 Hsp constitutives Hsp constitutives Transport sub-cellulaire des protéines Transport sub-cellulaire des protéines Repliment des protéines natives Repliment des protéines natives Réparation des protéines dénaturées Réparation des protéines dénaturées Dégradation des protéines non réparées Dégradation des protéines non réparées Ä Chaperons moléculaires

4 Hsp inductibles Hsp inductibles Tous les systèmes vivants Tous les systèmes vivants Plusieurs agents inducteurs Plusieurs agents inducteurs Bactérie, Levure, Organismes supérieurs Bactérie, Levure, Organismes supérieurs Fièvre, Infection virale, …. Fièvre, Infection virale, …. Stress oxydatif Stress oxydatif Métauds lourds Métauds lourds Xénobiotiques Xénobiotiques Ä Cytoprotection

5 Différents facteurs dinduction des familles de Hsp Hsp110 Hsp90 Hsp70 Hsp60 Hsp27 Agents de stress (dénaturation protéique): Altération de létat physiologique (augmentation de la synthèse protéique): - Choc thermique - Alcool - Rayons ultraviolets - Métaux lourds - Oxydants - Chimiothérapie - Cycle cellulaire - Facteurs de croissance - Infection, inflammation - Récupération à hypoxie ou carence en glucose

6 Les protéines de choc thermique se lient à des protéines dégradées par un stress et évitent leur agrégation et rétablissent leur fonctions Mécanismes dinduction : protétoxicité Mécanismes dinduction : protétoxicité Hsp 70: Marqueurs de toxicité universels non spécifiques Linduction des Hsp : Linduction des Hsp : réponse sensible et précoce réponse sensible et précoce réponse dose et temps dépendante réponse dose et temps dépendante Hsp et Toxicologie moléculaire

7 Quels rôles jouent les Hsp ? Assiste le repliment des protéines dans différents compartiments cellulaires 1) Assiste le repliment des protéines dans différents compartiments cellulaires 2) Assure le maintien des structures tri-dimentionnelles des protéines, 3) Asssite le repliement correcte des protéines dénaturées 4) Assure la translocation des protéines à travers les differents compartiment cellulaires, 5) Prévient de laggrégation des protéines 6) Dégrade des protéines instables

8 HSP Family Cellular Location Proposed Function HSP27 (sHSP)Cytosol, nucleus Microfilament stabilization, antiapoptotic HSP60MitochondriaRefolds proteins and prevents aggregation of denatured proteins, proapoptotic HSP70 family:Antiapoptotic HSP72 (Hsp70) Cytosol, nucleus Protein folding, cytoprotection HSP73 (Hsc70) Cytosol, nucleus Molecular chaperones HSP75 (mHSP70) MitochondriaMolecular chaperones HSP78 (GRP78) ERCytoprotection, molecular chaperones HSP90Cytosol, ER, nucleus Regulation of steroid hormone receptors, protein translocation HSP110/104CytosolProtein folding Table 1. Cellular locations and proposed functions of mammalian heat shock protein familiesHSP, heat shock protein; sHSP, small HSP; ER, endoplasmic reticulum.

9 La famille des Hsp 70 HSP70 sont les plus inductibles et les plus conservées HSP70 sont les plus inductibles et les plus conservées Elles présentent 60-80% dhomologie dans le monde des eucaryotes Elles présentent 60-80% dhomologie dans le monde des eucaryotes

10 Mécanisme dinduction des Hsp 70

11 La zéaralénone induit-elle lexpression des Hsp 70 ? La zéaralénone induit-elle lexpression des Hsp 70 ? Provoque-t-elle une protéo-toxicité ? Laboratoire de Recherche sur les Substances Biologiquement Compatibles (LRSBC)

12 Objectifs Étudier la cytotoxicité de la ZEN Étudier la cytotoxicité de la ZEN Étudier lexpression des Hsp 70 et leur potentiel cytoprotecteur Étudier lexpression des Hsp 70 et leur potentiel cytoprotecteur

13 Modèle in vitro : Hep G2 Le foie est une cible préférentielle de la ZEN Le foie est une cible préférentielle de la ZEN Activation métabolique ( -, -zearalenol) Activation métabolique ( -, -zearalenol) Modèle retenu pour la réponse Hsp Modèle retenu pour la réponse Hsp Hépatocytes humains Hépatocytes humains

14 Viabilité (% du control) Inhibition dose dépendante de la viabilité CI50 = 95 µM Inhibition dose dépendante de la viabilité CI50 = 95 µM Cas de la ZEN / Hep G2 Viabilité cellulaire Viabilité cellulaire

15 Comment peut-on déterminer le niveau dexpression dune protéine bien déterminée au niveau dune population cellulaire ou à partir dun tissu ou organe ?

16 Démarche Traitement des cellules avec des concentrations croissantes de ZEN Traitement des cellules avec des concentrations croissantes de ZEN Extraction des protéines cellulaires Extraction des protéines cellulaires Séparation des protéines par électrophorèse Séparation des protéines par électrophorèse Transfert des protéines Transfert des protéines Immunodétection de la protéine dintérêt Immunodétection de la protéine dintérêt

17 1. Sites inoccupés par les protéines transférées bloqués 2. Anticorps monoclonal anti-Hsp 70 de souris 3. Anticorps anti-IgG de souris couplé à la phosphatase alcaline 4. Phosphatase alcaline 5. S. Substrats révélateurs de lactivité phosphatase alcaline NBT/ BCIP P. Précipité coloré, produit de la réaction catalysée par la phosphatase alcaline en présence de NBT, BCIP sur le site du complexe antigène anticorps

18 Résultats

19 6h 12h 24h Expression des Hsp 70 Expression des Hsp 70

20 C µM C nM Choc thermique Choc thermique h C µM ZEN : 120 µM ZEN : 120 µM CTN : 260 µM CTN : 260 µM T-2 toxine : 110 nM T-2 toxine : 110 nM La ZEN, CTN et T-2 toxine sont cytotoxiques et induisent lexpression des Hsp 70 dune manière dose dépendante

21 Cas de lOTA : Hep G2 /Vero Viability (% of control) OTA : cytotoxique pour les Hep G2 et les Vero (CI 50: 90 et 120 µM) OTA : cytotoxique pour les Hep G2 et les Vero (CI 50: 90 et 120 µM)

22 OTA et expression des Hsp 70


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